CN112654346B - 生物分子包覆颗粒和薄膜及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了聚合物颗粒(包含其上所附着的目的生物分子)及其使用方法和制造方法。所述聚合物颗粒表面可通过按所需比例附着多种不同的目的生物分子以共同呈递而实现官能化。另外，所述聚合物颗粒还可以包囊用于体内释放的生物分子，例如治疗性核酸、肽和/或多肽。本发明还提供了用于增强CAR‑T细胞增殖的合成颗粒和方法。此外，本发明提供了生物分子包覆薄膜及相关方法。

Description

生物分子包覆颗粒和薄膜及其用途
本专利申请案主张于2018年7月10日提交的编号为62/696,191的美国临时专利申请案以及于2019年3月21日提交的编号为62/821,879的美国临时专利申请案的优先权，上述专利申请全文以引用方式并入本文中。
介绍
传统生物分子疗法与现代合成细胞模拟物的主要目标是开发方法和组合物，促使将生物分子有效、高效地递送至和/或将靶向或调节信号呈递至从此类治疗中受益的合适的细胞和组织。这需要在各种病理状态下提高向细胞施用治疗药剂的效率、特异性和模块性。当涉及到某些细胞的活化时，这一点尤为重要。因此，由具有各种生物分子受控表面呈递功能以及有效核心负载功能的合成生物相容性材料制成的有效***能增强各种细胞在疾病中的调节能力，促使将生物分子靶向递送至特定细胞，减少治疗相关“副作用”。
此外，还需要用于增加生物分子体内半衰期的方法，这可以通过将生物分子附着于固体支持物上以及提供具有比例和密度受控的多种生物分子的固体支持物来实现。
另外，需要提供改善嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的离体和体内扩增、持久性和杀伤潜力的策略。
发明内容
本发明提供了聚合物颗粒(包含其上所附着的目的生物分子)及其使用方法和制造方法。所述聚合物颗粒表面可通过附着目的生物分子以在所述合成颗粒表面呈递而实现官能化。多种不同的目的生物分子可按所需比例附着于所述聚合物颗粒表面以共同呈递。另外，所述聚合物颗粒还可以包囊用于体内释放的生物分子，例如治疗性核酸、肽和/或多肽。
本发明还提供用于增强CAR-T细胞增殖的方法，所述方法涉及使所述CAR-T细胞与CAR抗原呈递合成颗粒接触。所述合成颗粒可以是聚合物颗粒、磁性颗粒或脂质体。
此外，本发明提供了生物分子包覆薄膜及其使用方法和制造方法。
附图说明
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。附图中包括以下图示：
图1阐明了PLGA微米颗粒利用DNA支架实现的多官能化。
图2展示了用于门控抗原特异性癌症靶向的工程化回路人原代synNotch CAR-T细胞通过可生物降解的聚合物微米颗粒实现的活化。
图3阐明了PLGA微米颗粒的多官能化及其对原代synNotch T细胞活性的影响。
图4展示了DNA支架在PLGA微米颗粒上的稳定性。
图5提供了用于HER2特异性抗原靶向的synNotch CAR T细胞通过瘤内注射PLGA颗粒而实现局部活化的示意图。
图6阐明了用于使DNA与嵌段共聚物PLGA-PEG-MAL共价连接以生成核酸—聚合物缀合物的方法。
图7A-K.适用于人原代T淋巴细胞离体扩增的具有按比例计量控制部分的AICE。
图8A-8F.synNotch CAR-T细胞利用AICE颗粒局部活化来选择性杀伤体内肿瘤。
图9阐明了用于细胞因子释放的synNotch受体的密度依赖性活化。
图10展示了血清细胞因子和趋化因子在DNA支架化颗粒构建体施用后的量化情况。
图11提供了CAR-T细胞通过与CAR抗原呈递颗粒(CAPP)接触来实现扩增的示意图。
图12展示了CAR-T细胞通过呈递不同抗原的CAPP而活化的情况。
图13阐明了CAPP在一系列粒径和抗原密度范围内诱导细胞扩增的能力。
图14表明，磁珠和脂质体上的CAR抗原呈递也能诱导CAR-T细胞扩增。
图15阐明了在未诱导细胞因子产生也无细胞耗竭的情况下，利用聚合物颗粒实现的CAPP介导的细胞增殖。
图16表明，磁珠和脂质体上CAR抗原呈递的相应CAR-T细胞耗竭曲线(A)与细胞因子释放情况(B)与通过聚合物颗粒(CAPP-EGFR)活化的CAR-T细胞的相应情况类似。
图17A-17D表明，多孔薄膜设备中包含DNA支架。
实施方式
本发明提供了聚合物颗粒(包含其上所附着的目的生物分子)及其使用方法和制造方法。例如，所述聚合物颗粒可以按所需比例载有多种不同的目的生物分子以共同呈递。
本发明还提供用于增强CAR-T细胞增殖的方法，所述方法涉及使所述CAR-T细胞与CAR抗原呈递合成颗粒接触。例如，所述方法可以增强CAR-T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加，也不会使CAR-T细胞耗竭。
此外，本发明提供了生物分子包覆薄膜及其使用方法和制造方法。例如，所述薄膜可以载有多种不同的目标生物分子，且可用于各种生物医学应用中，例如过继细胞移植。
在描述本发明的示例性实施例之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本专利中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在该所述范围内的任何其他所述或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
除非另有定义，否则本专利所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本专利所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和示例性的方法和材料。本专利提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内容。
必须注意的是，如本专利和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，对“第一核酸”的提及包括多个此类第一核酸，而对“所述核酸”的提及包括对一种或更多种核酸等的提及。
还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。
本专利所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中没有任何内容可以解释为承认本发明凭借先前的发明没有权早于此类公开。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。如果此类出版物列出的术语定义与本发明所述的相应明确或隐含定义相冲突，则以本发明所述的定义为准。
在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本专利所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序对任何陈述的方法进行实施。
定义
术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基，还包含已经修饰的其他杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。另外，术语“核苷酸”包括包含半抗原或荧光标记，以及不仅可以包含属于常规核糖和脱氧核糖的糖，还可以包含其他糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸还包括对所述糖部分的修饰，例如，其中一个或更多个所述羟基被卤素原子或脂族基团取代，官能化为醚、胺等。
术语“核酸”是指长度大于约5个碱基、大于约10个碱基、大于约15个碱基或大于约20个碱基的聚合物。核酸的长度可以是5-200个碱基，例如，长度为5-50个碱基、50-200个碱基、10-80个碱基、10-50个碱基、10-30个碱基、10-20个碱基或12-20个碱基。术语“核酸”是指核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸(PNA))的聚合物，且可以通过酶促法或合成法制备(例如，第5,948,902号美国专利中所述的PNA)，其可与天然存在的核酸以序列特异性方式进行杂交，该方式与诸如能够参与Watson-Crick碱基配对相互作用的两种天然存在的核酸的杂交方式类似。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。所述核酸可以为单链或双链核酸。
术语“杂交”是指核酸通过Watson-Crick碱基配对与互补核酸特异性结合。
本文中使用的术语“杂交条件”是指允许核酸与互补核酸杂交的条件，例如，固定在聚合物颗粒上的核酸可在杂交条件下通过Watson-Crick碱基配对与互补核酸特异性结合。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、与抗原保持特异性结合的抗体片段(包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后会产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它有两个抗原结合位点且仍能与抗原交联。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施例中，所述Fv多肽进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽连接子，使sFv能够形成抗原结合所需的结构。
术语“结合”是指两个分子由于诸如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)而直接缔合。与特定多肽内的表位“特异性”结合的抗体的结合亲和力为10-7M或更高，例如，结合亲和力为10-8M、10-9M、10-10M等。非特异性结合是指结合亲和力小于约10-7M，例如，结合亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等。
术语“患者”或“受试者”可互换使用，是指人类或非人动物(例如，哺乳动物)。
术语“治疗”、“预防”等是指诸如确诊患有、观察到出现疾病、病症、病状或相关症状后实施的行动方案(例如施用药剂或包含药剂的药物组合物)，以便暂时或永久地消除、减轻、抑制、缓解或改善对受试者造成影响的疾病、病症或病状的至少一种潜在病因，或与对受试者造成影响的疾病、病症或病状相关的至少一种症状。因此，治疗包括抑制(即，阻止疾病、病症或病状或与之相关的临床症状发展或进一步发展)活动性疾病。
本文中使用的术语“需要治疗”是指医师或其他护理人员做出的受试者需要治疗或将从治疗中受益的判断。这种判断依据所述医师或护理人员的专业知识范围内的各种因素做出。
短语“治疗有效量”是指以单次剂量或作为多次剂量的一部分单独或作为药物组合物的一部分施用于受试者的药剂量，所述药剂量在施用于患者时，能对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征产生任何可检测到的积极效应。所述治疗有效量可通过测定相关生理效应来加以确定。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可以包括基因编码和非基因编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的多肽骨架的多肽。此术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列、含或不含N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记蛋白等。
聚合物颗粒
本发明提供了通过附着一种或更多种目的生物分子而实现官能化的聚合物颗粒。在某些实施例中，提供了通过附着两种或更多种目的生物分子而实现官能化的聚合物颗粒，其中所述两种或更多种生物分子各自的占比均受控制。在某些实施例中，提供了通过附着三种或更多种目的生物分子而实现官能化的聚合物颗粒，其中所述三种或更多种生物分子各自的占比均受控制。在某些实施例中，提供了通过附着一种或更多种目的生物分子而实现官能化的聚合物颗粒，其中各生物分子的所述密度均受控制。在某些实施例中，除了具有在聚合物颗粒表面呈递的一种或更多种生物分子之外，所述聚合物颗粒还可以包囊生物分子。本文中使用的术语“生物分子”是指在体内或体外，在生物***中具有活性的有机分子。生物分子的示例包括核酸(例如，DNA或RNA)、肽和蛋白质。术语生物分子涵盖特异性结合对的成员，例如，抗体、抗原、配体、受体、酶、底物等。
在某些实施例中，聚合物颗粒可以包括聚合物核；包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；包含与所述第一结合成员共价缔合的第二单链核酸的第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第一结合成员，其中所述第一结合成员是特异性结合对的成员，其中所述第一结合成员与第二结合成员(其为所述特异性结合对的成员)特异性结合。
所述核酸—聚合物缀合物可以使用与形成所述聚合物核相同的聚合物或使用不同的聚合物来形成。在某些实施例中，所述核酸—聚合物缀合物中的聚合物可与所述聚合物非共价缔合，形成所述聚合物核，使得所述核酸—聚合物缀合物作为表面活性剂以生成所述颗粒，其中所述亲水性核酸在所述缀合物中的疏水性聚合物位于所述颗粒内部时，其在所述颗粒外部显现。因此，所述核酸—聚合物缀合物可用作表面活性剂，以形成由核酸—聚合物缀合物和聚合物的混合物制成的颗粒。
所述核酸—聚合物缀合物中的所述核酸可以是由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的单链核酸，其长度至少为5个碱基且至多为200个碱基。在某些实施例中，所述核酸的长度可以是5-100个碱基。在某些实施例中，所述核酸的长度可以是10-25个碱基，且可以是脱氧核糖核苷酸的聚合物。所述核酸可以通过共价键与所述聚合物缀合。例如，可以通过连接反应性基团来修饰所述核酸的3'端或5'端，所述反应性基团可与经适当修饰的聚合物反应，以在所述核酸和所述聚合物之间形成共价键。在某些实施例中，可对所述核酸进行修饰，以在所述3'端处引入巯基，并且可对所述聚合物进行修饰，以引入马来酰亚胺基团，所述马来酰亚胺基团可以发生反应，使所述核酸与所述聚合物共价连接。
在某些实施例中，用于形成所述聚合物颗粒的所述聚合物可以是任何聚合物，例如，可生物降解的聚合物和生物相容性聚合物。在某些情况下，所述聚合物可以是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)和/或聚(e-己内酯)(PCL)。在另一方面，所述聚合物可以是共聚物，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)聚(e-己内酯)(PLGA/PCL)。在一些实施例中，用于形成所述聚合物颗粒的所述聚合物可以是PLA、PGA、PEG、PCL、PLGA和PLGA/PCL中的一项或更多项的组合。在某些实施例中，所述聚合物颗粒中的所述聚合物核包含PLGA和PLA。在某些情况下，所述聚合物颗粒中的所述聚合物核包含PLGA、PEG和PLA。
在某些情况下，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物可以是嵌段聚合物。在某些实施例中，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物可以是嵌段共聚物。在某些实施例中，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物可以是由PLGA和PEG组成的嵌段共聚物(PLGA-嵌段-PEG)。在某些实施例中，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物可以是由PLA和PEG组成的嵌段共聚物(PLA-嵌段-PEG)。在某些情况下，所述嵌段共聚物中的所述PLGA的分子量范围可以是8kDa-30kDa(例如，10kDa)，而所述PEG的分子量范围可以是3kDa-7kDa(例如，5kDa)。在某些实施例中，可以选择所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物，使得所述聚合物的长度足以***所述聚合物核中，以便与所述核中的所述聚合物稳定缔合。在一些情况下，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物与形成所述颗粒核的所述聚合物非共价缔合。此类非共价缔合可以通过疏水相互作用或通过范德华力实现。在一些情况下，所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物通过诸如聚合作用与形成所述颗粒核的所述聚合物共价缔合。
形成所述聚合物颗粒核以及与核酸—聚合物缀合物缔合可以同时发生，使得多种疏水性聚合物可以彼此缔合并远离亲水环境，并且可以形成由所述核酸—聚合物缀合物包围的颗粒，所述核酸—聚合物缀合物在所述疏水核和所述亲水环境之间形成界面，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物部分与所述核相互作用，其核酸部分与所述亲水环境相互作用。所述核中的所述聚合物可以聚合，形成与所述核酸—聚合物缀合物中的所述聚合物共价缔合(例如，经聚合)或非共价缔合(例如，疏水相互作用)的稳定颗粒。
术语颗粒或聚合物颗粒可互换使用，是指一种或多种此类颗粒。所述聚合物颗粒基本上可以为球形，例如，球形、椭圆形、半球形、半球状、具有平坦部分或凹入或凸起部分的不规则球形、半椭圆形、具有平坦部分或凹入或凸起部分的不规则椭圆形。
所述颗粒的直径是指从所述颗粒的一端至完全相对的另一端的长度，其范围可以为数纳米至数微米。所述颗粒的尺寸可以通过用于形成所述颗粒的所述聚合物的量和/或分子量来加以控制。在一些实施例中，所述颗粒的直径范围可以是1-50μm，例如，1-40μm、1-30μm、1-20μm、1-5μm、1-4μm、1-3μm或1-2μm。在特定实施例中，所述颗粒的直径范围为1-2μm。在一些实施例中，所述颗粒的直径范围可以是50-1000nm，例如，50-1000nm、50-800nm、50-500nm或100-500nm。
本文所述的聚合物颗粒可以由可生物降解且基本上无毒的聚合物制成。术语“可生物降解的聚合物”是指可在体内降解的聚合物。可生物降解的聚合物可以是均聚物、共聚物或包含两个以上不同聚合物单元的聚合物。所述聚合物颗粒可在向有相应需求的受试者施用100天、30天、10天或3天(例如，3-100天、3-10天、3-4天)后基本上完全降解。在某些实施例中，可以基于所需的体内停留时间来调节所述颗粒的生物降解性。例如，可以基于所需的体内半衰期来选择用于形成所述颗粒的所述聚合物的分子量。可以选择低分子量聚合物来形成具有较短体内半衰期的颗粒，反之亦然。
在某些实施例中，用于生成所述颗粒的所述聚合物的分子量可以小于100kDa，例如，小于90kDa、小于80kDa、小于70kDa、小于60kDa、小于50kDa，例如，5-100kDa、15-90kDa、20-80kDa、30-70kDa、30-60kDa或30-50kDa。
在某些实施例中，用于形成所述单链核酸—聚合物缀合物的所述聚合物的分子量可以不同于用于形成所述颗粒核的所述聚合物的分子量。例如，用于生成所述颗粒的所述聚合物的分子量可以小于100kDa，例如，小于90kDa、小于80kDa、小于70kDa、小于60kDa、小于50kDa，例如，5-100kDa、15-90kDa、20-80kDa、30-70kDa、30-60kDa或30-50kDa；用于形成所述单链核酸—聚合物缀合物的所述聚合物的分子量可以小于30kDa，例如，小于20kDa、小于15kDa或小于10kDa，例如，1kDa-30kDa、3kDa-20kDa、5kDa-20kDa、5kDa-15kDa、5kDa-10kDa。在某些实施例中，用于生成所述单链核酸—聚合物缀合物的所述聚合物可以是共聚物，其中所述聚合物中的一种的分子量可以为10kDa-30kDa，而另一种聚合物的分子量可以为3kDa-8kDa。
所述第一结合成员—核酸缀合物可以包括与所述第一结合成员共价连接的第二单链核酸。所述第二单链核酸可以由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或肽核酸组成，并且其长度至少为5个碱基且至多为200个碱基。在某些实施例中，所述核酸的长度可以是5-100个碱基。在某些实施例中，所述核酸的长度可以是10-25个碱基。在某些实施例中，所述核酸的长度可以是10-25个碱基或10-20个碱基，且可以是脱氧核糖核苷酸的聚合物。所述第一和第二单链核酸可以包括彼此互补的至少4个碱基的连续延伸片段。所述第一和第二单链核酸可以包括彼此互补的至少4个碱基的多个连续延伸片段，所述连续延伸片段由彼此不互补的碱基隔开。在某些实施例中，所述互补区域可以是约7-20个碱基、7-19个碱基、7-18个碱基、7-10个碱基或4-10个碱基。在某些实施例中，所述碱基的连续延伸片段的互补性可以低于100％。例如，在至少7个碱基的延伸片段中，互补性可以至少为99％、98％、97％、96％或95％。在某些实施例中，所述互补区域可以是约7-20个碱基、7-19个碱基、7-18个碱基、7-10个碱基或4-7个碱基，其中所有碱基都是互补的。
所述核酸可以通过共价键直接或间接地与所述第一结合成员—核酸缀合物中的所述第一结合成员缀合。在某些实施例中，所述第二单链核酸通过反应性基团与所述第一结合成员共价连接。例如，可对所述第二单链核酸进行修饰，以在所述3'端处引入氨基，并且可对所述第一结合成员进行修饰，以引入羧基，所述羧基可以发生反应，使所述核酸与所述第一结合成员共价连接；或者，可对所述第二单链核酸进行修饰，以在所述3'端处引入硫醇基，并且可对所述第一结合成员进行修饰，以引入马来酰亚胺基团，所述马来酰亚胺基团可以发生反应，使所述核酸与所述第一结合成员共价连接。在一些实施例中，所述第二单链核酸与所述第一结合成员之间的共价连接可通过连接子间接实现。例如，可对所述第二单链核酸进行修饰，以在所述3'端处引入氨基，所述氨基与所述连接子中的羧基反应，所述连接子可以进一步包括马来酰亚胺基团，以与所述第一结合成员中的硫醇基反应。
在某些实施例中，所述第一结合成员和所述第二结合成员可以是包括抗体—抗原、受体—配体等的特异性结合对的成员。在某些实施例中，所述第一结合成员可以是抗原，而所述第二结合成员可以是抗体。在某些实施例中，所述第一结合成员可以是抗体，而所述第二结合成员可以是抗原。
在某些实施例中，所述第二结合成员可以存在于细胞表面上，例如，癌细胞、干细胞或免疫细胞。免疫细胞的示例包括T细胞(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞或调节性T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样免疫细胞和B细胞。在某些实施例中，所述第二结合成员可以存在于T细胞表面上。在某些实施例中，所述第二结合成员可以是可溶的，例如，可以存在于受试者的组织或血液内的细胞外基质中。
在某些实施例中，所述第二结合成员可以存在于已经过基因工程改造的细胞表面上，例如已经过基因工程改造的T细胞。“基因工程”意指操纵细胞的基因组，以表达通常并非由细胞天然表达的表达产物。已经过基因工程改造的细胞示例包括嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(即，已经过基因工程改造以表达CAR的T细胞)以及经过改造以表达结合触发的转录开关(例如synNotch受体)的细胞。
“结合触发的转录开关”或“BTSS”意指具有细胞外结构域(包括与特异性结合对的第一成员结合的所述特异性结合对的第二成员，例如，抗原)、结合转导子和细胞内结构域的合成模块化多肽或相互作用多肽***。当所述特异性结合对的所述第一成员与所述BTTS结合时，所述结合信号被转导至所述细胞内结构域，使得所述细胞内结构域处于激活状态并在所述细胞(若无所述结合信号，则不执行功能)内执行功能，例如转录激活。
BTSS的示例包括synNotch***、MESA***、TANGO***、A2 Notch***等。例如，所述synNotch受体请参见第9,670,281号美国专利，且下文对此提供了更为详细的描述。所述MESA***请参见WO 2018/081039A1，其包含自容式感测和信号转导***，使得配体(所述特异性结合对的第一成员)与所述受体(所述特异性结合对的第二成员)结合，从而诱导信号传导以调节靶基因的表达。在所述MESA***中，所述配体与所述受体结合可诱导二聚化，使得所述***出现蛋白水解反式裂解，以释放先前螯合于所述质膜上的转录激活因子。所述TANGO***请参见以下出版物：Barnea等人，2008，美国科学院院报，105(1):64-9。简而言之，所述TANGO***通过将转录因子与膜结合受体(例如，GPCR、受体激酶、Notch、类固醇激素受体等)物理连接而使其螯合于细胞膜上。所述受体融合蛋白的活化使得融合的信号传导蛋白募集至蛋白酶处，而后，所述蛋白酶裂解并释放所述转录因子以激活所述细胞中的基因。所述A2Notch***请参见WO 2019099689 A1。简而言之，所述A2 Notch***涵盖力传感器裂解域，所述裂解域在配体与所述受体结合而诱导的裂解时，将所述细胞内结构域释放至所述细胞内。
在某些实施例中，所述第二结合成员可以存在于经基因工程改造的细胞表面上，例如，在所述BTTS的控制下表达BTTS和CAR的细胞。在某些实施例中，所述第二结合成员可以存在于经基因工程改造的细胞表面上，例如，在所述BTTS的控制下表达所述BTTS和CAR的细胞。
在某些情况下，所述第一结合成员可与如第9,670,281号美国专利中所述的synNotch受体结合。例如，所述synNotch受体可以包括细胞外结构域(其包括所述第二结合成员)，其中所述第二结合成员是单链Fv(scFv)或纳米抗体，并且存在于所述颗粒上的所述第一结合成员是与所述单链Fv(scFv)或纳米抗体结合的抗原。在某些情况下，所述第二结合成员可以是抗CD19、抗间皮素、抗GFP抗体、scFv或纳米抗体，并且所述第一结合成员可以分别是CD19、间皮素、GFP。
在某些实施例中，所述第一结合成员包含白介素-2(IL-2)，而所述第二结合成员可以是与在所述聚合物颗粒表面呈递的IL-2特异性结合的受体。所述IL-2可以是人IL-2，并且可以具有UniProt登录号Q0GK43-1(第1版，上一次修改于2006年10月3日)中列出的氨基酸序列。在某些实施例中，所述第一结合成员可以包含与IL-2特异性结合的抗IL-2抗体，以在所述聚合物颗粒表面呈递IL-2。在某些示例性实施例中，所述抗IL-2抗体是克隆号为5355的抗体，例如，可从ThermoFisher(编号：MA523696)获取。
在某些情况下，所述颗粒可以通过附着特异性结合对中一个以上的成员来实现官能化。例如，本发明的颗粒可以包括第一生物分子和第二生物分子。所述第一生物分子可以是第一特异性结合对的成员，而所述第二生物分子可以是第二特异性结合对的成员。在其他实施例中，所述颗粒可以通过附着作为治疗药剂的生物分子来实现官能化。虽然所述治疗药剂可以游离形式施用，但以固定形式施用时可以增加其体内半衰期。在其他实施例中，所述颗粒可以包括将所述颗粒靶向特定组织或细胞的第一结合成员，并且所述颗粒可以包括在所述靶组织或细胞中释放的治疗药剂。
在某些实施例中，治疗性抗体可以附着于所述颗粒上，其中所述治疗性抗体是抑制来自受体(例如，HER2受体)的细胞信号传导或激活来自受体的细胞信号传导的抗体。在某些实施例中，治疗性抗体可以附着于所述颗粒上，其中所述治疗性抗体是与可溶性分子(例如，细胞因子或抗体)结合并螯合的抗体。在某些实施例中，所述颗粒上的所述第一结合成员可以是英夫利昔单抗、阿达木单抗和赛妥珠单抗(抗TNFα)、贝伐单抗(抗血管内皮生长因子)、西妥昔单抗和帕尼单抗[抗EGFR(表皮生长因子受体)或HER1(人表皮生长因子受体)]或曲妥珠单抗(抗HER2)中的一种或更多种。
在某些情况下，第一特异性结合对的第一结合成员和第二特异性结合对的第一结合成员可与所述聚合物颗粒连接。使用单链核酸将所述结合成员与所述颗粒连接，从而控制连接至所述颗粒的结合成员的数量。例如，为了获得50:50的比例，可以使用相同量的第一核酸—聚合物缀合物和第二核酸—聚合物缀合物。利用比例为10:1的所述第一核酸—聚合物缀合物和所述第二核酸—聚合物缀合物制备颗粒，其中与所述第一核酸—聚合物连接的生物分子数量是与所述第二核酸—聚合物连接的生物分子数量的10倍。例如，所述聚合物颗粒可在其表面上包括与在CAR-T表面表达的嵌合Notch多肽结合的抗原，所述多肽与所述抗原结合时，会在所述细胞表面表达癌症相关CAR，而且所述聚合物颗粒可以进一步包括与所述癌症相关CAR结合的抗原，其中所述颗粒上的抗原与所述癌症相关CAR结合可在无明显的细胞因子表达的情况下使所述T细胞活化。
在某些实施例中，一种或更多种抗体可以附着于所述颗粒上，其中所述抗体与位于免疫细胞(例如T细胞)表面的结合成员结合。在某些实施例中，所述聚合物颗粒上所述第一特异性结合对的所述第一结合成员是与所述第一特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，而所述第二结合成员是与所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员均在T细胞表面表达。在某些实施例中，在所述T细胞表面表达的所述第二结合成员中的其中一个成员是CD3，另一个成员是CD28。在某些实施例中，与CD3结合的所述第一结合成员(抗CD3)和与CD28结合的所述第一结合成员(抗CD28)的存在比例为1:5至5:1、1:4至5:1、1:3至5:1、1:2至5:1、1:1至5:1、1:5至4:1、1:4至4:1、1:3至4:1、1:2至4:1、1:1至4:1、2:1至5:1、2:1至4:1。在某些示例性实施例中，抗CD3抗体与抗CD28抗体的比例为3:1。
在某些实施例中，所述颗粒可与自身肽连接，以便在施用于受试者时减少或避免对所述颗粒产生免疫应答。例如，所述颗粒可与自身肽连接，所述自身肽使得吞噬细胞能够将细胞识别为未被吞噬的内源性细胞。在某些示例中，所述自身肽可以是人CD47肽，例如，以下出版物中所述的肽：科学，2013年2月22日；339(6122):971-5。
在某些实施例中，所述颗粒包括(i)包含与所述聚合物共价连接的第一单链核酸的第一核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；包含与所述第一结合成员共价连接的第二单链核酸的第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第一结合成员；以及(ii)包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸的第二核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸；包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸的第二第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员。如本文所述，所述第一和第二核酸—聚合物缀合物的比例可以基于所需的待由所述颗粒呈递的结合成员的量而变化。在某些情况下，所述第一和第二核酸—聚合物缀合物的比例可以是100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:50或1:100。在某些情况下，所述第一和第二核酸—聚合物缀合物的比例可以是10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5或1:10。
可以选择所述核酸的序列，以仅使互补序列发生杂交，同时使非互补序列基本上不发生杂交。例如，仅互补性至少为95％或更高的序列发生杂交。因此，所述第一单链核酸的序列明显不同于所述第三单链核酸的序列，这使得所述第二单链核酸仅与所述第一单链核酸杂交，而所述第四单链核酸与所述第三单链核酸特异性杂交。
在某些实施例中，本文提供的聚合物颗粒可另外包括包囊于所述聚合物核中的生物分子。例如，所述聚合物颗粒可以包囊核酸、肽或多肽中的一种或更多种。所述聚合物颗粒可用于在体内长时间释放所述包囊的生物分子。
本发明还提供包含本文所揭示的聚合物颗粒以及药学上可接受的赋形剂的组合物。
可将本发明的药物组合物配制成适用于预期施用方法或给药途径；示例性给药途径详见本文。此外，所述药物组合物可与其他治疗活性药剂或化合物联合使用，以治疗或预防本发明所预期的疾病、病症和病状。合适的药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇，对羟基苯甲酸甲酯，乙基或正丙基、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、疏松剂、去污剂、缓冲液、溶媒、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的溶媒可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能添加了适用于肠胃外给药的药物组合物中常见的其他材料。其他示例性溶媒为中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水。典型的缓冲液包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。例如，所述缓冲液组分可以是水溶性材料，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐类。可接受的缓冲剂包括，例如，Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
另外，本发明还提供了包括本文所揭示的聚合物颗粒以及细胞(包含BTTS)的试剂盒，其中所述BTTS包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)结合转导子；以及c)包含转录激活因子的细胞内结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合可激活所述细胞内结构域；以及响应于所述转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接。在某些实施例中，所述BTTS是嵌合Notch多肽，其从N末端至C末端以共价键合的方式包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员并非天然存在于Notch受体多肽中，但与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)包含Lin 12-Notch重复序列、S2蛋白水解裂解位点和跨膜结构域(包含S3蛋白水解裂解位点)的Notch调节区；c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，所述细胞内结构域与所述Notch调节区异源并取代天然存在的细胞内Notch结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合，可诱导在S2和S3蛋白水解裂解位点发生裂解，从而释放所述细胞内结构域；以及响应于所述转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接。在某些情况下，所述细胞可以是T细胞，例如，第9,670,281号美国专利中所述的T细胞，该专利中的内容以引用方式并入本文中。
使用方法
本发明提供了使用本文所揭示的聚合物颗粒的方法。所述聚合物颗粒可用于各种体外、离体和体内方法。
在某些实施例中，所述颗粒可用于体内治疗方法。例如，所述颗粒可用于施用治疗药剂，例如，肽或蛋白质，例如抗体。本文中使用的术语“肽”是指相对较短的氨基酸链，而术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指更长的氨基酸链，例如，长度超过50个氨基酸的氨基酸链。在一些情况下，所述颗粒通过使细胞与所述颗粒接触，可用于向表达特异性结合对的第二成员的所述细胞提供所述特异性结合对的第一结合成员。在一些情况下，所述颗粒可用于以可溶形式(例如，细胞因子、分泌的抗体，例如IgE抗体)向表达特异性结合对的第二成员的受试者提供所述特异性结合对的第一结合成员。在一些情况下，所述颗粒可用于向靶器官、组织或细胞提供所述第一结合成员。在一些情况下，所述颗粒可用于递送需要在几天至几周内释放的生物分子。例如，可将诸如核酸、肽和/或多肽的治疗性生物分子包囊于所述颗粒中，而后在所述聚合物溶解(例如，通过水解作用实现)时于几天至几周内释放。本发明还提供了用于本文所述的体内治疗方法的聚合物颗粒。
所述颗粒可用于向有相应需求的受试者提供抗体。例如，特异性结合对的所述第一结合成员可以是抗体，例如，靶向α4β1的a4亚基和a47整合素的那他珠单抗(用于治疗MS和克罗恩病)；靶向α4β7整合素的维多珠单抗(用于治疗UC和克罗恩病)；靶向BAFF的贝利尤单抗(用于治疗SLE)；靶向BAFF和APRIL的阿塞西普(TACI-Ig；Merck/Serono)(用于治疗SLE)；靶向CD2的阿法西普(用于治疗斑块状银屑病、GVHD)；靶向CD3的奥昔珠单抗(用于治疗TID)；靶向CD3的替利组单抗(用于治疗TID)；靶向CD20的利妥昔单抗(用于治疗非霍奇金淋巴瘤、RA(对TNF阻断反应不足的患者)和CLL)；靶向CD20的奥法木单抗(用于治疗CLL、RA)；靶向CD20的奥美珠单抗(用于治疗RA和SLE)；靶向CD22的依帕珠单抗(用于治疗SLE和非霍奇金淋巴瘤)；靶向CD52的阿仑单抗(用于治疗CLL、MS)；靶向CD80和CD86的阿巴西普(用于治疗RA和JIA、UC和克罗恩病、SLE)；靶向C5补体蛋白的依库丽单抗(用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿)；靶向IgE的奥马珠单抗(用于治疗中度至重度持续性过敏性哮喘)；靶向IL-Ιβ的康纳单抗(用于治疗隐热蛋白相关周期综合征、全身性JIA、新生儿多发性炎症性疾病和急性痛风)；靶向IL-5的美泊利单抗(用于治疗嗜酸性粒细胞增多综合征)；靶向IL-5的瑞利珠单抗(用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎)；靶向IL-6R的托珠单抗(用于治疗RA、JIA)；靶向IL-12和IL-23的优特克单抗(用于治疗斑块状银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病)；靶向IL-12和IL-23的布雷奴单抗(用于治疗银屑病和斑块状银屑病)；靶向TNF的依那西普(用于治疗RA、JIA、银屑病性关节炎、AS和斑块状银屑病)；靶向TNF的英夫利昔单抗(用于治疗克罗恩病、RA、银屑病性关节炎、UC、AS和斑块状银屑病)；靶向TNF的阿达木单抗(用于治疗RA、JIA、银屑病性关节炎、克罗恩病、AS和斑块状银屑病)；靶向TNF的赛妥珠单抗(用于治疗克罗恩病和RA)；靶向TNF的戈利木单抗(用于治疗RA、银屑病性关节炎和AS)；等等。
在一些情况下，所述聚合物颗粒上或包囊于所述聚合物颗粒中或由对本发明的synNotch多肽的细胞内结构域的诱导做出反应的细胞表达的所述抗体是用于治疗癌症的治疗性抗体。所述抗体包括，例如，靶向CTLA-4的伊匹单抗(用于治疗黑色素瘤、***癌、RCC)；靶向CTLA-4的曲美木单抗(用于治疗CRC、胃癌、黑色素瘤、NSCLC)；靶向PD-1的纳武单抗(用于治疗黑色素瘤、NSCLC、RCC)；靶向PD-1的MK-3475(用于治疗黑色素瘤)；靶向PD-1的匹地利珠单抗(用于治疗恶性血液病)；靶向PD-L1的BMS-936559(用于治疗黑色素瘤、NSCLC、卵巢癌、RCC)；靶向PD-L1的MEDI4736；靶向PD-L1的MPDL33280A(用于治疗黑色素瘤)；靶向CD20的利妥昔单抗(用于治疗非霍奇金淋巴瘤)；替伊莫单抗和托西莫单抗(用于治疗淋巴瘤)；靶向CD30的本妥昔单抗(用于治疗霍奇金淋巴瘤)；靶向CD33的吉妥单抗(用于治疗急性髓系白血病)；靶向CD52的阿仑单抗(用于治疗慢性淋巴细胞性白血病)；靶向EpCAM的IGN101和阿德木单抗(用于治疗上皮性肿瘤(乳腺、结肠和肺部))；靶向CEA的拉贝珠单抗(用于治疗乳腺、结肠和肺部肿瘤)；靶向gpA33的huA33(用于治疗结直肠癌)；靶向粘蛋白的培妥莫单抗和奥戈伏单抗(用于治疗乳腺、结肠、肺部和卵巢肿瘤)；靶向TAG-72的CC49(明瑞莫单抗)(用于治疗乳腺、结肠和肺部肿瘤)；靶向CAIX的cG250(用于治疗肾细胞癌)；靶向PSMA的J591(用于治疗***癌)；靶向叶酸结合蛋白的MOv18和MORAb-003(法雷珠单抗)(用于治疗卵巢肿瘤)；靶向神经节苷脂(例如GD2、GD3和GM2)的3F8、chl4.18和KW-2871(用于治疗神经外胚层肿瘤和某些上皮性肿瘤)；靶向Le y的hu3S193和IgN311(用于治疗乳腺、结肠、肺部和***肿瘤)；靶向VEGF的贝伐单抗(用于***血管)；靶向VEGFR的IM-2C6和CDP791(用于治疗上皮源性实体瘤)；靶向整合素αVβ3的埃达珠单抗(用于***血管)；靶向整合素α5β1的伏洛昔单抗(用于***血管)；靶向EGFR的西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗和806(用于治疗神经胶质瘤，肺部、乳腺、结肠和头颈部肿瘤)；靶向ERBB2的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(用于治疗乳腺、结肠、肺部、卵巢和***肿瘤)；靶向ERBB3的MM-121(用于治疗乳腺、结肠、肺部、卵巢和***肿瘤)；靶向MET的AMG 102、METMAB和SCH900105(用于治疗乳腺、卵巢和肺部肿瘤)；靶向IGF1R的AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507和CP 751871(用于治疗神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部癌、***癌和甲状腺癌)；靶向EPHA3的KB004和IIIA4(用于治疗肺部、肾部和结肠肿瘤，黑色素瘤，神经胶质瘤和血液***恶性肿瘤)；靶向TRAILR1的马帕木单抗(HGS-ETR1)(用于治疗结肠、肺部和胰腺肿瘤和血液***恶性肿瘤)；靶向TRAILR2的HGS-ETR2和CS-1008；靶向RANKL的地诺单抗(用于治疗***癌和骨转移癌)；靶向FAP的西罗珠单抗和F19(用于治疗结肠、乳腺、肺部、胰腺和头颈部肿瘤)；靶向Tenascin的81C6(用于治疗神经胶质瘤、乳腺肿瘤和***肿瘤)；靶向CD3的博纳吐单抗(用于治疗ALL)；靶向用于癌症免疫疗法的PD-1的派姆单抗；靶向c-Myc的9E10抗体；等等。
所述接触可以通过以治疗有效量向受试者施用所述颗粒来实现。短语“治疗有效量”是指以单次剂量或作为多次剂量的一部分单独或作为药物组合物的一部分施用于受试者的颗粒数量，所述颗粒数量在施用于患者时，能对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征产生任何可检测到的积极效应。所述治疗有效量可通过测定相关生理效应来加以确定。例如，对于癌症，肿瘤或其他癌细胞大小的缩小或减小可用于确定所述颗粒数量是否有效治疗癌症。
本发明涉及以任何适当的方式施用所揭示的颗粒及其组合物。合适的给药途径包括肠胃外(例如，肌内、静脉内、皮下(例如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(脑实质内)和脑室内)、经口、经鼻、经***、舌下、眼内、直肠、局部(例如，经皮)、舌下、吸入、局部(例如，直接注射至靶器官或组织中，例如肿瘤)给药。
本发明涉及联合施用所揭示的颗粒及其组合物以及细胞，例如，表达合成notch多肽的T细胞或另一种CAR-T细胞。本文中使用的“联合”意在包括可以单独施用的疗法(例如，单独配制以单独施用的疗法(例如，如试剂盒中所提供))以及以单一制剂一同施用的疗法(即“共制剂”)。在某些实施例中，本文所揭示的颗粒和细胞按顺序施用，例如，其中颗粒在施用一种或更多种细胞之前或之后施用。在其他实施例中，所述颗粒和细胞同时施用，例如，其中细胞或颗粒同时或几乎同时施用；所述颗粒和细胞可以两种或更多种单独制剂的形式存在或组合成单一制剂(即，共制剂)。
在一些实施例中，所述颗粒可用于使表达特异性结合对的第二结合成员的细胞与所述特异性结合对的第一成员接触的方法中。所述接触可以在体外、离体或体内进行。在某些实施例中，所述细胞可以位于体内，例如在受试者体内，并且所述颗粒可以施用于所述受试者。在某些实施例中，所述细胞和所述颗粒可以施用于所述受试者。
在某些实施例中，所述方法可以包括活化T细胞的方法，例如CAR-T细胞，例如，表达本文所述的嵌合Notch多肽的CAR-T细胞。在某些实施例中，本发明的方法可用于诱导T细胞增殖，且不会使所述T细胞产生的细胞因子产量明显增加。例如，所述方法可以包括施用表达嵌合Notch多肽的CAR-T细胞以及表面显现出抗原的颗粒，其中所述抗原与所述Notch多肽结合，以在所述细胞表面表达癌症相关CAR。所述聚合物颗粒进一步包括与癌症相关CAR结合的抗原，其中所述颗粒上的抗原与所述癌症相关CAR结合可在无明显的细胞因子表达的情况下使所述T细胞活化。在某些实施例中，所述T细胞在不存在表达所述CAR抗原的癌细胞的情况下产生的所述细胞因子水平显著低于所述T细胞在存在表达所述CAR抗原的癌细胞的情况下产生的所述细胞因子水平。因此，使用经与所述嵌合Notch多肽结合的蛋白质和与CAR(通过与所述嵌合Notch多肽结合而表达)结合的蛋白质官能化的颗粒，可使所述T细胞增殖，同时显著降低由所述活化T细胞产生的细胞因子产量。
在某些方面，使表达BTTS(例如，本文所述的嵌合Notch受体多肽)的细胞与本发明的颗粒接触可以调节所述细胞的活性。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞或所述细胞周围的细胞的增殖。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞或所述细胞周围的细胞的凋亡。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放通过细胞凋亡以外的机制诱导细胞死亡。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放通过转录调节、染色质调节、转译、运输或转译后加工来调节所述细胞中的基因表达。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞的分化。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞或所述细胞周围的细胞的迁移。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞中分子的表达和分泌。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可调节所述细胞对第二细胞或细胞外基质的粘附力。在一些情况下，所述细胞内结构域的释放可诱导在所述细胞内从头表达基因产物。在一些情况下，如果所述细胞内结构域的释放可诱导在所述细胞内从头表达基因产物，则所述基因产物是转录激活因子、转录阻遏因子、嵌合抗原受体、第二嵌合Notch受体多肽、转译调节因子、细胞因子、激素、趋化因子或抗体。
术语“嵌合抗原受体”和“CAR”在本文中可互换使用，是指能够触发或抑制免疫细胞活化的人造多模块分子，其通常(但不限于)包含细胞外结构域(例如，配体/抗原结合域)、跨膜结构域和一个或更多个细胞内信号传导结构域。术语CAR并未特别限定于CAR分子，其还包括CAR变体。CAR变体包括***CAR，其中CAR的所述细胞外部分(例如，所述配体结合部分)和所述细胞内部分(例如，所述细胞内信号传导部分)存在于两个单独的分子上。CAR变体还包括开关CAR，其是条件性可活化的CAR，例如包含***CAR，其中所述***CAR的两部分的条件性异二聚化在药理学上受到控制。CAR变体还包括双特异性CAR，其包括可以扩增或抑制原代CAR活性的第二代CAR结合域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCARs)，其可以，例如，用作双特异性CAR***的组分，其中第二代CAR结合域的结合可抑制原代CAR活化。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)请参见诸如第US2014/016527号PCT申请案。
在某些实施例中，所述方法可以包括活化T细胞的方法，例如,表达CD3和CD28的T细胞。在某些实施例中，本发明的方法可用于诱导T细胞增殖，且不会使所述T细胞产生的细胞因子产量明显增加和/或使T细胞耗竭。例如，所述方法可以包括使T细胞与表面显现出第一结合成员(例如，抗体)的颗粒接触，其中所述第一结合成员与在所述T细胞表面表达的第二结合成员(例如CD3和CD28)结合，并且所述第一结合成员与所述第二结合成员结合可诱导T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加。在某些实施例中，所述T细胞在存在本文所述的颗粒的情况下产生的所述细胞因子水平低于所述T细胞在存在具有相同第一结合成员的非聚合物颗粒(例如，磁珠)的情况下产生的所述细胞因子水平。在某些实施例中，所述T细胞在存在本文所述的颗粒的情况下展示出的耗竭曲线低于所述T细胞在存在具有相同第一结合成员的非聚合物颗粒(例如，磁珠)的情况下展示出的耗竭曲线。
细胞增殖可以利用诸如细胞计数器来确定和量化，例如，如本文示例中进一步描述所示。T细胞产生的所述细胞因子水平可以通过诸如测定由所述细胞产生的(细胞外和/或细胞内)干扰素γ水平来确定和量化，例如，如本文示例中进一步描述所示。所述耗竭曲线可以通过诸如测定T细胞耗竭标记物(例如LAG-3、PD-1和/或TIM-3)的水平来确定，例如，如所述示例中进一步描述所示。较低耗竭曲线可由LAG-3、PD-1和TIM-3中的一项、两项或三项的较低表达曲线揭示。
制造聚合物颗粒的方法
本发明还提供了制造本文所揭示的聚合物颗粒的方法。所述方法可以包括形成乳剂，以生成用其表面至少一种生物分子(例如，其表面第一、第二、第三等生物分子)实现官能化的聚合物颗粒。在某些实施例中，所述方法可以包括形成双乳剂，以生成其内包囊生物分子且用其表面至少一种生物分子(例如，其表面第一、第二、第三等生物分子)实现官能化的聚合物颗粒。
在某些实施例中，制造聚合物颗粒的方法可以包括使核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物，其中所述核酸是第一单链核酸；对包括所述核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液进行超声处理以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物)的聚合物颗粒，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物核连接；以及使所述第二单链核酸与特异性结合对的第一结合成员共价或非共价连接，以生成所述聚合物颗粒。
杂交可在足以于所述核酸的互补碱基之间形成特异性碱基配对(例如，用于形成DNA:DNA或DNA:RNA或RNA:RNA或DNA:PNA或PNA:PNA双链区)的条件下进行一段时间。在某些情况下，所述杂交可以在至少30℃(例如，30℃-50℃、37℃-50℃或37℃-45℃)的温度下进行至少10分钟，例如，10分钟至60分钟、10分钟至45分钟或10分钟至30分钟。
在某些实施例中，所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之前，使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
在某些实施例中，所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之后，再使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
所述单链核酸与所述第一结合成员可通过连接子直接或间接连接。
在某些实施例中，所述方法包含使所述第二单链核酸与生物素分子共价连接，并且使亲和素—第一结合成员缀合物与所述第二单链核酸非共价连接。
在某些实施例中，所述方法包含生成多种核酸—聚合物缀合物，其中所述多种核酸—聚合物缀合物至少包括第一核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第一单链核酸；以及第二核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第三单链核酸，其中所述第一单链核酸与所述第三单链核酸具有不同的序列。在某些情况下，所述多种核酸—聚合物缀合物包括至少三种、至少四种、至少五种或更多种不同的核酸—聚合物缀合物，每种均包含不同的单链核酸，其中所述序列存在适当差异，以便与依次附着于特异性结合对的不同第一结合成员的不同核酸杂交。
在某些实施例中，所述方法包含对包含所述多种核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液进行超声处理以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物)的聚合物颗粒，其中所述多种核酸—聚合物缀合物的每个聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸和所述第三单链核酸；使以下各项与所述聚合物核连接：具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸(通过杂交连接)和具有与所述第三单链核酸互补的序列的第四单链核酸(通过杂交连接)；以及使以下各项进行共价或非共价连接：所述第二单链核酸与第一特异性结合对的第一结合成员以及所述第四单链核酸与生物分子，以生成所述聚合物颗粒。
在某些情况下，所述生物分子是自身肽。在某些情况下，所述生物分子是第二特异性结合对的第一结合成员。如本文所述，所述多种核酸—聚合物缀合物可以按所需比例引入。例如，包括在所述溶液中的所述第一核酸—聚合物缀合物和所述第二核酸—聚合物缀合物的比例可以是100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:50或1:100。在某些实施例中，如果第一结合成员中的一个成员与CD3结合，而另一个第一结合成员与CD28结合，则包括在所述溶液中的待与结合CD3的所述第一结合成员连接的所述核酸—聚合物缀合物和待与结合CD28的所述第一结合成员连接的所述核酸—聚合物缀合物的比例可以是1:3至5:1、1:1至5:1、2:1至4:1或3:1。在另一示例中，包括在所述溶液中的所述第一核酸—聚合物缀合物、所述第二核酸—聚合物缀合物和所述第三核酸—聚合物缀合物的比例可以是10:1:1、5:1:1、3:1:1、2:1:1、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:5或1:1:10。
将核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物的步骤可以使用适合用于共价连接的反应性基团的标准化学方法进行。合适的反应性基团的示例包括硫醇—马来酰亚胺、氨基和羧基、硫醇基和羧基等。
任何合适的溶液均可用于基于所述聚合物形成乳剂，以生成所述聚合物颗粒。在某些实施例中，所述溶液可以是基本上亲水的溶液。超声处理可以在足以生成所述颗粒的条件下进行一段时间。
在某些实施例中，可以进行双乳剂相关程序，以将基本上亲水的生物分子或两亲性生物分子包囊于所述颗粒的聚合物核中。在某些实施例中，制造聚合物颗粒(包含包囊于聚合物核中的肽、多肽和/或核酸以及核酸—聚合物缀合物(包含与第一聚合物共价连接的第一单链核酸)，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸)的所述方法可以包括对包含所述肽、多肽和/或核酸以及第二聚合物的溶液进行超声处理；将所述核酸—聚合物缀合物加入所述溶液中，并进一步对所述溶液进行超声处理，以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物且包囊所述肽、多肽和/或核酸)的聚合物颗粒，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物核连接；以及使所述第二单链核酸与特异性结合对的第一结合成员共价或非共价连接，以生成所述聚合物颗粒。
在某些情况下，可以在有机溶液中进行初始乳化，使亲水性生物分子分布至所述内部并被所述聚合物包围，然后在水相中进一步乳化，例如，向所述核酸—聚合物缀合物溶于水中所得到的溶液中加入所述乳剂，然后进行超声处理，从而将所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域***所述颗粒中，以生成包囊所述生物分子的所述聚合物颗粒。然后，如本文所述，可使所述颗粒官能化以添加所述第一结合成员。
CAR抗原呈递颗粒(CAPP)
本发明提供了呈递与在细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)结合的抗原的合成颗粒。所述颗粒被称为CAR抗原呈递颗粒(CAPP)。如本文进一步描述所示，在不受理论束缚的情况下，与呈递CAR抗原的非合成颗粒(例如，细胞，例如抗原呈递细胞)相比，CAPP被视为在活化CAR-T细胞方面表现出一定优势。
在某些实施例中，所述合成颗粒是聚合物颗粒、磁性颗粒或脂质体。在某些实施例中，所述合成颗粒是聚合物颗粒，例如，具有前一部分所述的特征和性质以及如本文进一步详述的聚合物颗粒。本文描述了CAPP生产方法，其中所述颗粒是聚合物颗粒。例如，在所述颗粒是聚合物颗粒的情况下，如上文所详述，可以通过使用核酸—聚合物缀合物于所述聚合物颗粒表面呈递所述CAR抗原。
可以通过任何合适的方式于所述合成颗粒表面呈递所述CAR抗原。例如，这可能涉及使用两端具有官能团(例如，NH2-、-SH、NHS、MAL、叠氮化物、炔基、DBCO、环氧、醛、生物素、亲和素、链霉亲和素等)的聚合物，例如PEG(聚乙二醇)。所述PEG的分子量可能介于50–10,000Da之间。一个官能团可与所述合成颗粒相互作用，而另一个官能团可与所述抗原相互作用。本发明还考虑了用亲和素或生物素实现官能化的磁珠的用途。可以将生物素化CAR抗原添加至包括表面链霉亲和素的合成颗粒中，具体如本文示例中更为详细的描述所示。
在某些实施例中，与在细胞上表达的CAR结合的所述抗原可以是CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。在某些实施例中，与在细胞上表达的CAR结合的所述抗原选自由CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9组成的群组。在某些实施例中，与在细胞上表达的CAR结合的所述抗原选自由CD19、HER2和表皮生长因子受体(EGFR)组成的群组。所述CAR可以在效应T细胞或调节性T细胞上表达。
在某些实施例中，所述抗原与在调节性T细胞(CAR-Tregs)上表达的CAR结合。所述抗原可用于诱导CAR-Treg细胞增殖，并且可用于移植和自身免疫疾病的细胞疗法中。CAR-Treg细胞及其靶向的抗原的示例请参见以下出版物：Zhang等人，2018，免疫学前沿，9:2359，此出版物中的内容以引用方式并入本文中。请参见，尤其是，Zhang等人相关文献的表1。
本发明提供了使用本文所揭示的CAPP的方法。所述CAPP可用于各种体外、离体和体内方法。
在某些实施例中，本发明提供了增强CAR-T细胞增殖的方法，所述方法包含使所述CAR-T细胞与本文所述的CAR抗原呈递颗粒(CAPP)接触。在某些实施例中，本发明的方法可用于增强CAR-T细胞增殖，且不会使所述CAR-T细胞产生的细胞因子产量明显增加和/或使CAR-T细胞耗竭。在某些实施例中，所述CAR-T细胞在与本文所述的CAPP接触后产生的所述细胞因子水平低于所述CAR-T细胞在与细胞(例如，呈递所述CAR抗原的抗原呈递T细胞)接触后产生的所述细胞因子水平。在某些实施例中，CAR-T细胞在与本文所述的CAPP接触后展示出的耗竭曲线低于CAR-T细胞在与细胞(例如，呈递所述CAR抗原的抗原呈递T细胞)接触后展示出的耗竭曲线。本文描述了测量细胞增殖、细胞因子产量和细胞耗竭的示例性方法。
在某些实施例中，增强CAR-T细胞增殖的所述方法离体进行。在某些实施例中，所述离体方法包含接触T细胞群体(包含所述CAR-T细胞)，其中所述T细胞群体已从受试者体内分离出来。在某些实施例中，所述方法进一步包含在增殖后向所述受试者施用所述CAR-T细胞。
在某些实施例中，增强CAR-T细胞增殖的所述方法在体内进行。在某些实施例中，所述体内方法包含向所述受试者施用所述合成颗粒。本发明还公开了用于本文所述的体内方法的CAPP和CAR-T细胞。
在本文所述的离体或体内方法中，所述受试者可能患有癌症，例如B细胞癌。在某些实施例中，所述B细胞癌是白血病。在某些实施例中，所述白血病是复发性或难治性CD 19+白血病。在某些实施例中，所述受试者正在接受或先前已接受过CAR-T细胞免疫疗法。
另外，本发明还提供了包括本文所揭示的CAPP以及与在所述CAPP上呈递的抗原特异性结合的CAR-T细胞的试剂盒。本发明还提供了包括本文所揭示的CAPP以及编码所述CAR的核酸或病毒颗粒的试剂盒，其中所述CAR一旦在T细胞上表达，即与在所述CAPP上呈递的抗原特异性结合。编码所述CAR的所述核酸可以是载体的一部分，例如，病毒载体，例如慢病毒载体。编码所述CAR的所述病毒颗粒可以是慢病毒颗粒，例如，收获的慢病毒颗粒。
生物分子包覆薄膜
本发明提供了通过附着一种或更多种目的生物分子而实现官能化的生物分子包覆薄膜。在某些实施例中，提供了通过附着两种或更多种目的生物分子而实现官能化的生物分子包覆薄膜，任选地，其中所述两种或更多种生物分子各自的占比均受控制。在某些实施例中，提供了通过附着一种或更多种目的生物分子而实现官能化的生物分子包覆薄膜，其中各生物分子的所述密度均受控制。在某些实施例中，除了具有在聚合物颗粒表面呈递的一种或更多种生物分子之外，所述生物分子包覆薄膜还可以包囊生物分子。所述生物分子可以在本文中作进一步描述。在某些实施例中，所述生物分子是CAR抗原，并且可以具有所述CAPP的特征和性质和/或用于本文进一步描述的增强CAR-T细胞增殖的方法中。
在某些实施例中，所述生物分子包覆薄膜包含聚合物薄膜(其包含一个或更多个孔)；包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物薄膜共价或非共价缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一单链核酸；以及包含与生物分子共价连接的第二单链核酸的第一生物分子—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一生物分子。
在某些实施例中，所述核酸和/或核酸—聚合物缀合物可以是本文在聚合物颗粒部分中所详述的核酸和/或核酸—聚合物缀合物。
在某些实施例中，用于形成所述聚合物薄膜的所述聚合物可以是任何聚合物，例如，可生物降解的聚合物和生物相容性聚合物。在某些情况下，所述聚合物可以是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乙二醇(PEG)和/或聚(e-己内酯)(PCL)。在另一方面，所述聚合物可以是共聚物，例如，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)聚(e-己内酯)(PLGA/PCL)。在某些实施例中，用于形成所述聚合物薄膜的所述聚合物可以是PLA、PGA、PEG、PCL、PLGA和PLGA/PCL中的一项或更多项的组合。在某些实施例中，所述聚合物薄膜包含PCL和PEG。
在某些实施例中，所述聚合物薄膜包含直径为0.1μm至10μm的孔。例如，所述孔的直径可以为0.1μm至5μm、0.1μm至3μm、0.1μm至2μm、0.5μm至10μm、0.5μm至5μm、0.5μm至3μm、0.5μm至2μm、1μm至10μm、1μm至5μm、1μm至3μm或1至2μm。在某些实施例中，所述聚合物薄膜包含直径为1μm至2μm的孔。在某些实施例中，所述聚合物薄膜包含直径为10nm至100nm的孔。例如，所述孔的直径可以为10nm至90nm、10nm至80nm、20nm至90nm、30nm至90nm、30nm至80nm、40nm至90nm、40nm至80nm、50nm至90nm或50nm至80nm。
在某些实施例中，所述聚合物薄膜的厚度为0.1μm至100μm。例如，所述聚合物薄膜的厚度可以为0.1μm至1μm、1μm至80μm、1μm至70μm、1μm至60μm、50μm、1μm至40μm、1μm至30μm、1μm至20μm、5μm至80μm、5μm至70μm、5μm至60μm、5μm至50μm、5μm至40μm、5μm至30μm、5μm至20μm、10μm至80μm、10μm至70μm、10μm至60μm、10μm至50μm、10μm至40μm、10μm至30μm或10μm至20μm。在某些实施例中，所述聚合物薄膜的厚度为10μm至20μm。
在某些实施例中，所述生物分子包覆薄膜包含选自由蛋白质、肽、抗体和核酸组成的群组的生物分子。在某些实施例中，所述生物分子包覆薄膜包含属于第一结合成员的生物分子，其中所述第一结合成员是特异性结合对的成员，其中所述第一结合成员与第二结合成员(其为所述特异性结合对的成员)特异性结合。所述生物分子可以具有本文在聚合物颗粒部分中所述的第一结合成员的性质和特征。在某些实施例中，所述第一结合成员是抗原，而所述第二结合成员是在CAR-T细胞上表达的CAR。在某些情况下，所述生物分子包覆薄膜可以包含特异性结合对的一个以上的成员。例如，本发明的生物分子包覆薄膜可以包括第一生物分子和第二生物分子。所述第一生物分子可以是第一特异性结合对的成员，而所述第二生物分子可以是第二特异性结合对的成员。
在某些实施例中，所述生物分子是可用于局部调节免疫细胞的共刺激受体激动剂。例如，所述共刺激受体激动剂可以是与CD28、CD137、OX40、GITR、ICOS、CD27、CD30和HVEM结合的结合成员，例如，抗体。在某些实施例中，所述生物分子是细胞因子，例如，选自由IL-2、IL-15、IL-12和GM-CSF组成的群组的细胞因子。在某些实施例中，所述生物分子是与检查点抑制剂结合的结合成员，例如，与检查点抑制剂结合的抗体，例如选自由PD-1、PD-L1、CTLA、B7-H1、IDO、TGF-β、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H4、精氨酸酶、MICA、MICB和TIM-3组成的群组的抗体。在某些实施例中，所述生物分子是佐剂，例如CpG、TLR激动剂或STING激动剂。
本发明提供了使用本文所揭示的生物分子包覆薄膜的方法。所述生物分子包覆薄膜可用于各种体外、离体和体内方法。
在某些实施例中，所述生物分子包覆薄膜可用于体内治疗方法。例如，所述生物分子包覆薄膜可用于施用治疗药剂，例如，肽或蛋白质(例如抗体)或小分子(例如药物)。本文中使用的术语“小分子”是指分子量通常为500道尔顿或更低的合成或天然存在的有机化合物。在一些情况下，所述生物分子包覆薄膜通过使细胞与所述生物分子包覆薄膜接触，可用于向表达特异性结合对的第二成员的所述细胞提供所述特异性结合对的第一结合成员。在一些情况下，所述生物分子包覆薄膜可用于以可溶形式(例如，细胞因子、分泌的抗体，例如IgE抗体)向表达特异性结合对的第二成员的受试者提供所述特异性结合对的第一结合成员。在一些情况下，所述生物分子包覆薄膜可用于向靶器官、组织或细胞提供所述第一结合成员。在一些情况下，所述生物分子包覆薄膜可用于递送治疗药剂。例如，治疗药剂(例如核酸、肽、多肽和/或小分子)可以包囊于所述生物分子包覆薄膜中并通过所述孔释放。在其他情况下，所述生物分子包覆薄膜可用于递送分泌治疗药剂的细胞。例如，细胞或细胞群体可以包囊于所述生物分子包覆薄膜中，且所述细胞分泌的治疗药剂通过所述孔释放。本发明还提供了用于本文所述的体内治疗方法的生物分子包覆薄膜。
在某些实施例中，所述生物分子包覆薄膜用于增强CAR-T细胞增殖的方法中。在某些实施例中，所述方法涉及使用包含属于第一结合成员的生物分子的生物分子包覆薄膜，其中所述第一结合成员是与第二结合成员(其为在CAR-T细胞上表达的CAR)特异性结合的抗原。所述CAR-T细胞可以是效应T细胞或调节性T细胞。所述生物分子可以具有本文在聚合物颗粒部分中所述的第一结合成员的性质和特征。在某些实施例中，所述第一结合成员是抗原，而所述第二结合成员是在CAR-T细胞上表达的CAR。所述方法可以在体内或离体进行，例如，如本文在涉及CAPP的方法部分中所详述。
本发明提供了制造本文所揭示的生物分子包覆薄膜的方法。在某些实施例中，所述方法包含使核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物，其中所述核酸是第一单链核酸；在溶剂中混合包含所述核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液；对所述溶液进行薄膜流延处理以生成包含所述第二聚合物的聚合物薄膜，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物薄膜非共价缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接；以及使所述第二单链核酸与生物分子共价或非共价连接，以生成所述生物分子包覆薄膜。
在某些实施例中，所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接之前，使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
在某些实施例中，所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接之后，再使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
在某些实施例中，所述方法包含生成多种核酸—聚合物缀合物，其中所述多种核酸—聚合物缀合物包含第一核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第一单链核酸；以及第二核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第三单链核酸，其中所述第一单链核酸与所述第三单链核酸具有不同的序列。
如本文所述，所述多种核酸—聚合物缀合物可以按所需比例引入。例如，包括在所述溶液中的所述第一核酸—聚合物缀合物和所述第二核酸—聚合物缀合物的比例可以是100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:50或1:100。将核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物的步骤可以使用适合用于共价连接的反应性基团的标准化学方法进行。合适的反应性基团的示例包括硫醇—马来酰亚胺、氨基和羧基、硫醇基和羧基等。
混合包含所述核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液的步骤可以在适合于薄膜流延处理的任何溶剂中进行。可以使用的合适的常规溶剂的示例包括但不限于草酸二甲酯(DMO)、碳酸亚乙酯(EC)、N-甲基乙酰胺(NMA)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸(AA)、1,4-二恶烷(DO)、碳酸二甲酯(DMC)、氯仿、二氯甲烷(DCM)、萘、磺胺林、三甲基脲、乙二醇或其他二醇类和聚乙二醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、碳酸亚乙酯、己烷、环己烷、三氟乙醇(TFE)、乙醇、乙酸和水及其组合。在某些实施例中，所述溶剂是TFE和水的组合。
示例
从上文提供的内容中可以得出，本发明具有多种应用方式。因此，提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制发明人所认为其发明的范围，也无意表示以下实验是全部或唯一进行的实验。本领域技术人员应当认识到，可以更改或修改各种非关键参数，以得出基本相似的结果。因此，提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制发明人所认为其发明的范围，也无意表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所使用数字(例如数量、尺寸等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。
材料与方法
1.合成硫醇修饰的DNA
使用Expedite 8909 DNA合成仪，在3'端巯基修饰剂6S-S CPG磁珠(GlenResearch，编号：10-1936-02)上合成具有17个碱基的3'端硫醇修饰的DNA。在AMA溶液(氢氧化铵:甲胺＝1:1，v/v)存在的情况下，将磁珠置于70℃下孵育20分钟，而后从磁珠中回收DNA，然后真空蒸发(SpeedVac，ThermoFisher，编号：SPD121P-230)3小时以去除AMA。然后，将在TE缓冲液(Tris-EDTA，10mM，pH7.5)中重构的DNA用0.22μm过滤器(Millipore，编号：UFC30GV00)过滤，并置于-20℃下保存。
2.合成两亲性聚合物-DNA
在37℃下用100x摩尔过量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(TCEP，Sigma，编号：646547)处理已合成的DNA 1小时以去除二硫化保护，然后使用尺寸排阻色谱法纯化(GlenResearch，编号：61-5010)。在掺有0.2％三乙醇胺的二甲基甲酰胺(DMF)/H2O(90:10,v/v)溶剂中将新制备的硫醇-DNA与200μM马来酰亚胺官能化的聚合物(即聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-马来酰亚胺，Mw 10,000:5000Da，Akina，编号：AI053，PLGA-PEG-MAL)以不同比例混合，然后在室温下孵育过夜以完成相应反应。第二天，将反应物真空蒸发(加热至70℃)3小时以去除溶剂，然后将聚合物-DNA置于-20℃下保存。产物质量通过TBE-尿素凝胶电泳处理(15％，Invitrogen，编号：EC68855)来确定。
3.制备含DNA支架的聚合物颗粒
使用单乳剂法在水性缓冲溶液和有机溶剂的混合物中制备PLGA聚合物颗粒。在200μL溶剂混合物(乙酸乙酯:H2O＝1:1，v/v)中重构两亲性聚合物-DNA，使其与一定量的溶于乙酸乙酯或二氯甲烷(DCM)(根据目标粒径和降解曲线判断)的主流(未改性)聚合物(聚-丙交酯-共-乙交酯，50:50，Mw 38,000-54,000，Sigma，编号：719900；或聚乳酸，Mw 60,000，Sigma，编号：38534)混合，并加入水性缓冲溶液(10mM柠檬酸钠，600mM Na+，pH3.0)。对于直径为1-5μm的PLGA微米颗粒，在0.5mL乙酸乙酯和0.5mL水性缓冲溶液中混合100nmol PLGA-DNA和50mg PLGA(Sigma，编号：719900)；对于直径为1-5μm的PLA微米颗粒，在0.5mL DCM和0.5mL水性缓冲溶液中混合200nmol PLGA-DNA合50mg PLA(Sigma，编号：38534)；对于直径约为500nm的PLGA颗粒，在0.5mL乙酸乙酯和1mL水性缓冲溶液中混合100nmol PLGA-DNA和10mg PLGA(Sigma，编号：719900)；以及对于直径约为200nm的PLGA颗粒，在0.5mL乙酸乙酯和1mL水性缓冲溶液以及1％聚乙烯醇(PVA，Sigma，编号：81381)中混合100nmol PLGA-DNA和10mg PLGA(Sigma，编号：719900)。然后，涡旋振荡全部混合物，并在冰上于7-8W下进行5x5s的探针式超声处理，间隔10s，然后立即添加9mL 0.2％PVA，并在通风橱中搅拌3小时以使乙酸乙酯蒸发。用40μm的细胞过滤网(Sigma，编号：CLS431750)过滤颗粒，使其在10,000x g下离心10分钟以收集沉淀物，然后将其重悬于含有0.01％Tween-20的TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0)中以便洗涤。除非特别说明，否则此方案在后续洗涤步骤中保持不变。洗涤三遍后，将颗粒重悬于含有1％PVA的TE缓冲液中并冻干以长期保存。
4.表面杂交和逐步缀合以附着生物分子
在水中重构冻干颗粒，然后在550nm下测量光密度，作为颗粒浓度的指标。在～200nM/OD550下加入与支架互补的NH2修饰的DNA链(Biosearch Technologies)，使其在37℃下孵育30分钟以便进行杂交，然后离心以洗去未杂交的DNA。在6μM/OD550下加入大量过量的MAL-dPEG4-NHS连接子(Quanta Biodesign，编号：10214)，并在室温下孵育1小时，使颗粒具有硫醇反应功能，然后洗涤三遍以去除过量物质。接着，在50nM/OD550下加入具有游离硫醇的生物分子，并在室温下孵育1小时以便与颗粒表面缀合。将载有生物分子的颗粒洗涤三遍，并在加入1％PVA的PBS缓冲液中冻干。一旦颗粒上载有用荧光染料标记的生物分子，便可通过将颗粒溶于95％二甲基亚砜(DMSO)中并进一步在PBS中稀释10倍(以便进行基于荧光的定量分析)来分析相应效率。
为了制备不含DNA支架的对照颗粒，在由0.5mL乙酸乙酯和0.5mL H2O组成的溶剂中混合100nmol嵌段共聚物PLGA-PEG-MAL(Akina，编号：AI053)和50mg PLGA(Sigma，编号：719900)。在完成上述探针式超声处理之后，用40μm过滤器(Sigma，编号：CLS431750)过滤所形成的颗粒，并离心洗涤。然后，在50nM/OD550下向MAL呈递颗粒中加入生物分子(含有暴露的游离硫醇)，并在37℃下孵育1小时以便缀合。
5.DNA与抗体或Fc标记蛋白的连接及其纯化
抗体(抗PD-L1，Bio-X-Cell，编号：BE0285；抗CD28，Bio-X-Cell，编号：BE0248)或Fc标记蛋白(HER2，Acro Biosystems，编号：HE2-H5253)通过尺寸排阻色谱法(Zeba脱盐离心柱，Thermo Scientific，编号：89882)将缓冲液转化为还原性缓冲液(加入10mM EDTA的PBS)，而后通过加入4.5摩尔过量的TCEP并在37℃下孵育1小时来选择性地还原铰链区的二硫键。过量TCEP可以通过尺寸排阻色谱法去除。在37℃下，在HEPES缓冲液(pH7.0)中将与支架(Biosearch Technologies)互补的3'端NH2修饰的DNA与30倍摩尔过量的MAL-dPEG4-NHS连接子(Quanta Biodesign，编号：10214)缀合1小时，然后通过70％乙醇沉淀法和尺寸排阻色谱法去除未缀合的连接子。将已还原的抗体或Fc标记蛋白和已缀合的DNA按1:10的摩尔比率混合，使其在37℃下孵育1小时，并在4℃下孵育过夜。第二天，采用蛋白G亲和色谱法(Genscript，编号：L00209)纯化DNA-蛋白缀合物，以去除未缀合的DNA。
6.DNA与his标记GFP的连接及其纯化
His标记GFP在大肠杆菌表达培养基(MagicMedia，Invitrogen，编号：K6803)中由经pRSET-EmGFP载体(ThermoFisher，编号：V35320)转导的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)表达，并用细胞裂解试剂(Sigma，编号：B7435)提取，然后用镍次氮基三乙酸亲和色谱法(Invitrogen，编号：R90115)纯化。将MAL-PEG4-NHS连接子与30倍摩尔过量的GFP混合，并在37℃下孵育1小时，然后通过尺寸排阻色谱法去除过量物质。在37℃下用100摩尔过量的TCEP处理硫醇化互补DNA(Biosearch Technologies)1小时，以去除保护帽，并在70％乙醇中沉淀以去除过量的TCEP。将经修饰的GFP和硫醇-DNA按1:10的摩尔比率混合，使其在37℃下孵育1小时，并在4℃下孵育过夜。第二天，使用镍次氮基三乙酸亲和色谱法纯化GFP-DNA缀合物，以去除未缀合的DNA。
7.生物素化蛋白的表面负载
采用上述方案使与支架(Biosearch Technologies)互补的3'端生物素化DNA与颗粒表面杂交。然后，在1.1mg/mL/OD550下加入大量过量的链霉亲和素(Prozyme，编号：SA10)，立即混合，并在室温下孵育30分钟，然后洗涤三遍。随后加入生物素化抗体、蛋白质或肽，并在室温下孵育30分钟，以与链霉亲和素结合从而实现颗粒表面负载，然后洗涤三遍。
8.具有预定比例的多种蛋白质的聚合物颗粒的表面官能化
合成具有不同序列的3'端硫醇化DNA：R(5’AGTGGGAGCGCGTGATG3’)；G(5’GTTCATCTGCACCACCG3’)；B(5’GCCTTTACGATGTCCTT3’)。与PLGA-PEG-MAL(Akina，编号：AI053)缀合后，将预定比例的具有不同序列的聚合物-DNA与主流聚合物和溶剂混合，并如上所述制备颗粒。在60nM/OD550(总计)下，在颗粒上杂交预先与蛋白质(如上所述)缀合的互补DNA链或生物素化互补链(Biosearch Technologies)，相应比例与制备期间的投入比例相同。对于生物素化DNA链的占比，如上所述，在颗粒表面组装链霉亲和素和生物素化蛋白质/肽/抗体。表面蛋白种类通过荧光标记的DNA部分或蛋白部分加以量化。
9.酶攻击测定
在5U/1OD550 x 50μL下，用DNase(不含RQ1 RNase的DNase，Promega，编号：M6101)处理与荧光标记的互补链杂交的颗粒(有或无IgG覆盖)，使其在37℃下孵育20分钟，然后在10,000x g下离心10分钟，以分析上清液中的荧光信号。
10.基于IVIS成像的颗粒稳定性测定
在室温下，使溶于DMF中的NH2修饰的PLGA聚合物(聚(丙交酯-共-乙交酯)-NH2，LG50:50，Mw 30,000-40,000Da)与30倍摩尔过量的IR800CW-NHS Ester(Li-COR，P/N号：929-70020)染料反应1小时，然后进行重复70％乙醇沉淀和DMF再溶解，以去除未缀合的染料。将1mg IR800CW标记的聚合物与50mg主流聚合物和100nmol PLGA-DNA混合，以采用上述方案制备直径为1-5μm的颗粒。杂交5'端Quasar705修饰的互补链(Biosearch Technology)以追踪表面DNA支架，而杂交IR800则用于核心追踪。在NSG小鼠(雌性，约8-12周龄)左侧腹和右侧腹分别经皮下植入异种移植肿瘤——5×106个K562肿瘤细胞。肿瘤植入后10天，瘤内注射50μL 200OD550荧光标记颗粒，并用IVIS 100临床前成像***(Xenogen，编号：124262)进行成像，在前48小时内，每3-4小时成像一次，在该周的剩余时间内，每8小时成像一次。使用Living Image软件(PerkinElmer)分析图像。
11.在含DNA支架的颗粒中包囊肽和DNA
使用双乳剂法制备表面具有DNA支架、核心含有肽/DNA的PLGA聚合物颗粒。将溶于50μL PBS中的0.25mg肽(Genscript)和50nmol DNA(Bioresearch Technologies)与溶于0.5mL乙酸乙酯中的50mg PLGA(Sigma，编号：719900)合并、混合，并在冰上于7-8W下进行5x5s的探针式超声处理，间隔10s。然后，加入在100μL溶剂混合物(乙酸乙酯:H2O＝1:1，v/v)中重构的100nmol两亲性聚合物-DNA和400μL水性缓冲溶液(10mM柠檬酸钠，600mM Na+，pH3.0)。迅速涡旋振荡全部混合物，并在冰上于7-8W下进行5x5s的探针式超声处理，间隔10s，然后立即添加9mL0.2％PVA，并在通风橱中搅拌3小时以使乙酸乙酯蒸发。用40μm的过滤器过滤颗粒，使其在10,000x g下离心10分钟以收集沉淀物，然后将其重悬于含有0.01％Tween-20的TE缓冲液中以便洗涤。洗涤三遍后，将颗粒重悬于含有1％PVA的TE缓冲液中并冻干以长期保存。
12.原代人T细胞的分离和培养
通过阴性选择，从单采术后得到的匿名供体血液中分离出原代CD4+和CD8+T细胞(STEMCELL Technologies，编号：15062和15063)。血液获取自经大学机构审查委员会(University Institutional Review Board)批准的太平洋血液中心(Blood Centers ofthe Pacific)。将T细胞冷冻保存在含有20％人AB血清(Valley Biomedical，编号：HP1022)和10％DMSO的RPMI-1640(UCSF细胞培养基核心)中。对于所有实验，解冻后，将T细胞置于加入了30个单位/mL IL-2(NCI BRB Preclinical Repository)且由X-VIVO 15(Lonza，编号：04-418Q)、5％人AB血清和10mM中和N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich，编号：A9165)组成的人T细胞培养基中培养。
13.转导合成Notch CAR T细胞
SynNotch受体是通过将LaG17纳米抗体与小鼠Notch1(NM_008714)最小调节区(Ile1427至Arg1752)和Gal4 DBD VP64融合而构建的。SynNotch受体还包含用于膜靶向的n末端CD8a信号肽(MALPVTALLLPLALLL HAARP)和myc标记(EQKLISEEDL)，以便通过a-mycA647(细胞信号传导，编号：2233)轻松确定表面表达。此类受体被克隆至含有PGK启动子的经修饰的pHR'SIN:CSW载体中，以用于所有原代T细胞实验。此外，还对pHR'SIN:CSW载体进行了修饰，以制备应答元件质粒。将Gal4 DNA结合域靶序列(GGAGCACTGTCCTCC GAACG)的五个拷贝克隆50份至最小CMV启动子中。应答元件质粒中还包括PGK启动子，其可组成性地驱动mCherry表达，从而轻松识别已转导的T细胞。对于诱导性HER2-CAR载体，CAR通过多克隆位点30中的BamHI位点克隆至Gal4应答元件中。所有构建体通过融合克隆(Clontech，编号：ST0345)进行克隆。
泛嗜性VSV-G假型慢病毒通过使用Fugene HD(Promega，编号：E2312)转染含有pHR'SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G的Lenti-X 293T细胞(Clontech，编号：11131D)来生产。同一天解冻原代T细胞，置于培养基中培养24小时后，用人T激活剂CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies，编号：11131D)以1:3的细胞:磁珠比例刺激。在48小时时，收获病毒上清液，并将原代T细胞暴露于病毒中24小时。在T细胞刺激后的第4天，取出Dynabeads，并扩增T细胞直至第9天——即处于静息状态且可用于分析。用Beckton Dickinson(BD)FACs ARIA II分选T细胞以便进行测定。在分选过程中，剔除表现出基础CAR表达的与门T细胞。
14.癌细胞系
所使用的癌细胞系是K562骨髓性白血病细胞(ATCC，编号：CCL-243)和A375恶性黑色素瘤细胞(ATCC，编号：CRL-1619)。K562和A375经慢病毒转导以稳定表达人HER2和GFP。对所有细胞系进行分选以表达转基因。在含有10％胎牛血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养K562细胞，并在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养A375细胞。
15.T细胞体外刺激和增殖测定
对于所有体外synNotch T细胞测定，在最终0.075OD550 x 200μL(由100μL T细胞培养基和100μL癌细胞培养基组成)下，将2.5×104个T细胞与靶向癌细胞按1:1的比例共培养，同时加入PLGA微米颗粒。在圆底96孔组织培养板中混合T细胞和癌细胞后，以300g的离心力将细胞离心2分钟以促使细胞相互作用。在24小时时，分析培养物中T细胞活化的标志物(例如CD69)。为了进行增殖测定，在共培养之前，用CellTrace Violet细胞增殖试剂盒(Invitrogen，编号：34557)对T细胞进行预染色，并在96小时时进行分析。所有流式细胞术分析均在FlowJo软件(TreeStar)中进行。
16.细胞因子分析
如上所述，用靶向癌细胞系和PLGA微米颗粒刺激原代CD4+或CD8+synNotch与门T细胞48小时，并收集相应上清液。通过IL-2ELISA(eBiosciences，编号：BMS2221HS)确定CD4+T细胞上清液中的IL-2水平，并通过IFNγELISA(Invitrogen，编号：KHC4021)确定CD8+T细胞的IFNγ水平。
17.体外靶细胞杀伤测定
对于所有体外靶细胞杀伤测定，将2.5×104个A375细胞接种于平底96孔组织培养板上，培养8小时以使其沉降，然后在最终0.075OD550 x 200μL下，将CD8+T细胞与癌细胞按1:1的比例共培养，同时加入PLGA微米颗粒。48小时后，将细胞用PBS轻轻洗涤2次，然后加入PrestoBlue细胞活力检测试剂(Invitrogen，编号：A13262)以分析细胞活力。
18.体内肿瘤靶向
在NSG小鼠左侧腹和右侧腹分别经皮下植入两种异种移植肿瘤——5×106个GFP+K562肿瘤细胞。肿瘤植入后7天，将5×106个原代人CD4+和CD8+T细胞(总计1×107个T细胞)经静脉注入小鼠体内。这些T细胞未经转导(对照)，或经a-GFP synNotch Gal4VP64受体和相应的调节HER2 4-1BBδCAR表达的应答元件改造。在两侧腹中的任一侧腹处瘤内注射官能化PLGA微米颗粒，另一侧腹则作为对照。在T细胞注射后20天内，用卡尺监测肿瘤大小。在Kaplan-Meier实验中，使用相同的方案，但仅将单一肿瘤注射入小鼠体内。当肿瘤大小达到安乐死实施标准时，小鼠被视为已死亡。
示例1：PLGA微米颗粒利用DNA支架实现的多官能化
图1.PLGA微米颗粒利用DNA支架实现的多官能化。(a)多种治疗性蛋白通过DNA支架负载于可生物降解的聚合物微米颗粒表面的示意图。在颗粒上预先与DNA链(与支架互补)缀合的治疗性蛋白通过DNA杂交在表面组装。(b)用于制备PLGA微米颗粒的两亲性嵌段共聚物的合成以及DNA支架呈递。硫醇化DNA和马来酰亚胺(Mal)官能化聚合物通过Michael加成化学反应缀合，形成两亲性共聚物(另请参见图6)，然后混合PLGA聚合物(Resomer，38-54kDa，50:50)与超声介导的乳剂，以产生微米颗粒。具有硫醇化DNA 17mer的PLGA(10k)-PEG(5k)-Mal(PolySciTech Inc.)最适合用于微米颗粒形成和有效的DNA呈递。(c)在缀合过程中，DNA支架的表面密度可以通过DNA与聚合物的不同比例来控制。通过这种策略负载生物分子的效率明显高于当前最佳表面缀合化学方法的相应效率。(d)具有不同序列的DNA支架可以按预定比例在表面上进行调整，以实现多种货物负载。与不同染料标记的互补链杂交的颗粒的荧光图像与化学分析生成的颜色(图像上方的条)相匹配。(e)修饰抗体互补DNA及其表面负载策略。用TCEP处理抗体，以选择性地还原铰链区二硫键，从而通过MAL-PEG-NHS连接子与胺官能化DNA缀合。DNA预缀合抗体通过杂交实现的表面负载效率高于通过逐步化学缀合法达到的效率。(f)以受控比例负载多种蛋白质靶标。利用游离胺，用DNA修饰GFP蛋白。
示例2：用于抗原特异性癌症靶向的SYNNOTCH CAR-T细胞通过可生物降解的聚合 物微米颗粒实现的活化
图2.用于抗原特异性癌症靶向的合成回路人原代T细胞通过可生物降解的聚合物微米颗粒实现的活化。(a)合成Notch T细胞通过用于CAR表达以靶向癌细胞上的HER2抗原的GFP呈递PLGA微米颗粒而引发的示意图。用新型模块化合成Notch(synNotch)受体对原代T细胞进行基因工程改造，该受体具有用于结合GFP的细胞外识别域以及在结合细胞外结构域后即予以释放以激活HER2-CAR表达的转录激活域。(b)用人原代CD4 T细胞和HER2过表达的黑色素瘤细胞A375共孵育GFP呈递PLGA微米颗粒有助于分泌IL-2细胞因子，并且分泌量随着颗粒上GFP密度的增加而增多。(c)A375细胞随着CD4 synNotch T细胞被PLGA-GFP颗粒引发而丧失活力，这主要是由于细胞因子水平升高引起。(d)PLGA-GFP造成的CD8 synNotchT细胞引发和A375促成的CAR结合有助于表达早期活化标记CD69。(e)用人原代CD8 T细胞和HER2过表达的黑色素瘤细胞A375共孵育GFP呈递PLGA微米颗粒有助于分泌干扰素γ细胞因子，并且分泌量随着颗粒上GFP密度的增加而增多。(f,g,h)由GFP呈递PLGA微米颗粒引发的CD8 synNotch T细胞靶向并杀伤HER2阳性癌细胞。(i)用不同类型的synNotch CAR-T细胞处理2天后，对靶标Her2+A375靶细胞进行细胞存活测试，该synNotch CAR-T细胞经靶向PNE肽(加入(“PNE+ICEp”)或未加入(“ICEp-“off””)PNE呈递微米颗粒)的synNotch受体改造。数据为平均值±s.d.(n＝4个生物学独立样本)。加入PNE+ICEp可以显著增强杀伤力。
在无微米颗粒ICEp的情况下，靶细胞与synNotch CAR-T细胞的共孵育也表现出中等细胞毒性(图2g和图2i)，这可能是由于同样在以往的报告中观察到的诱导性CAR表达的泄漏所引起，可以通过进一步优化synNotch受体来加以改善。
示例3：PLGA微米颗粒的多官能化及其对原代SYNNOTCH T细胞活性的影响
图3.PLGA微米颗粒的多官能化及其对原代synNotch T细胞活性的影响。(a,b)将免疫检查点抑制剂抗PD-L1和T细胞共刺激激动剂抗CD28抗体负载于GFP呈递PLGA微米颗粒上，以增强T细胞对靶细胞的活性。(c)负载于PLGA微米颗粒的抗PD-L1和抗CD28抗体分别与PD-L1阳性癌细胞和CD8原代T细胞有效结合。(d,e)在不同患者供体中，共同呈递PLGA微米颗粒的抗PD-L1和抗CD28抗体对CD4和CD8synNotch T细胞的细胞因子分泌谱的影响有所不同。(f)在体外测定中，PLGA微米颗粒的多官能化对靶标杀伤无明显优势。(g)一旦被GFP引发，便将HER2抗原共同负载于PLGA微米颗粒上以与CAR结合。(h)与靶细胞A375提供的抗原相比，存在于PLGA微米颗粒上的CAR抗原能够促进CD4和CD8 T细胞的增殖，但会显著降低细胞因子分泌(i)。
示例4：DNA支架在PLGA微米颗粒上的稳定性
图4.DNA支架在PLGA微米颗粒上的稳定性。(a)一旦在体外负载有蛋白质(即，抗体)，便可保护DNA支架免受酶促降解。(b)DNA支架在NSG小鼠K562肿瘤中相对稳定，此状态持续一周。瘤内注射后，通过IVIS成像追踪在表面DNA上和核心内用近红外染料标记的PLGA微米颗粒的相应强度。(c)“自身”肽由于“别吃我”信号而在PLGA微米颗粒上被官能化，以防止被巨噬细胞摄取。
示例5：用于HER2特异性抗原靶向的SYNNOTCH CAR T细胞通过瘤内注射PLGA颗粒 而实现的局部活化
用与synNotch CAR T细胞特异性结合以激活HER2特异性CAR表达的结合成员官能化PLGA颗粒，将此类颗粒注射至植入了HER2表达肿瘤的小鼠体内。通过尾静脉向小鼠注射HER2表达肿瘤细胞。在肿瘤构建后约14天，通过尾静脉将synNotch T细胞或未转导的对照细胞(例如，CD4/CD8 T细胞)经静脉注射至小鼠体内。小鼠随后将接受呈递synNotch抗原的官能化PLGA颗粒的瘤内注射。在小鼠于28天左右达到安乐死实施标准之前，监测肿瘤大小和/或生长情况。
图5.用于HER2特异性抗原靶向的synNotch CAR T细胞通过瘤内注射PLGA颗粒而实现的局部活化。
示例6：适用于人T细胞离体活化的具有按比例计量控制部分的颗粒的设计
载有蛋白质的聚合物颗粒(例如，PLGA颗粒)在本文中可互换地指代人造免疫细胞接合剂(AICE)颗粒和免疫细胞接合颗粒(ICEp)。我们按照不同的比例(1:5至5:1)将抗CD3和抗CD28抗体负载于AICE颗粒上。载有抗CD3/CD28抗体的AICE颗粒相对于载有抗CD3和抗CD28抗体的市售Dynabeads在相同的颗粒/细胞比率下进行了基准测试，以比较其以最低耗竭率来扩增人原代T细胞的能力(图7A)。载有抗CD3/抗CD28抗体的AICE颗粒(“官能化AICE”)活化了T细胞(图7B)，并且与Dynabeads在三个人T细胞供体上的扩增情况相比，其T细胞扩增水平相当或更高(图7C、7D)。尽管供体之间存在较大差异(也针对Dynabeads进行了观察)，但我们观察到CD4+和CD8+T细胞的细胞产量在第14天呈线性增长趋势，即从AICE-[1:5，抗CD3:抗CD28]至AICE-[3:1，抗CD3:抗CD28](图7C)。然后，通过测定CD45RA和CCR7表面标记的表达情况来探索扩增的T细胞在第14天时的表型(图7E)。有趣的是，4种分化状态(包括幼稚、中央记忆(CM)、效应记忆(EM)和终末分化中央记忆(EMRA))的群体分布显示出与AICE(具有不同的抗CD3与抗CD28比率(图7C))中的细胞扩增趋势相对应的模式(图7F)。通过对T细胞耗竭标记LAG-3、PD-1和TIM-3进行染色，我们发现，在最佳条件AICE-[3:1，抗CD3:抗CD28]下，已耗竭的细胞数量始终低于三个供体中由Dynabeads活化的细胞数量(图7J)。所有这些数据表明，合成材料上官能化部分的表面比率控制对于T细胞离体扩增得到的细胞数量和质量至关重要。
作为针对离体T细胞培养在培养基中加入游离IL-2的常规方案的替代方案，我们通过表面呈递其抗体(克隆号：5355)使IL-2负载于AICE上(图7G)。此特定抗IL-2抗体经基因工程改造，可促进IL-2与其在T细胞上的β和γ受体结合，从而促进非Treg T细胞的增殖(图7G)。基于最佳条件AICE[3:1]，我们通过两种方式，在IL-2剂量(游离与表面结合)相同的情况下，比较了对原代T细胞扩增的影响。表面IL-2负载使得CD4+和CD8+T细胞的扩增增强，特别是在第8天后，CD4+原代T细胞扩增有所改善(图7H、7I)，这补偿了游离IL-2在第14天产量相对降低的情况。另外，在两个受试供体中，LAG-3和PD-1阳性CD4+T细胞数量减少，这表明在AICE表面负载细胞因子或能减少离体扩增期间的T细胞耗竭。
综上所述，此平台利用生物相容性材料和可生物降解的材料以及免疫调节信号精确控制功能，可以为适用于过继细胞疗法(ACT)的T细胞生产优化提供新的机会(图4K)。
图7A-7K.适用于人原代T淋巴细胞离体扩增的具有按比例计量控制部分的AICE。(a)AICE的示意图(在此图中，适用于原代T细胞扩增、载有比例范围为[1:5]至[5:1]的CD3和CD28抗体的PLGA微米颗粒与市售T细胞扩增剂Dynabeads(Invitrogen)作比较)。(b)与AICE[1:1]共孵育过夜的人原代CD8+T细胞的代表性共聚焦显微镜图像，其显示了AICE诱导的细胞团块(n＝3个生物学独立样本)。(c)相对于Dynabeads，在(a)中，CD4+和CD8+T细胞在用载有不同比例的CD3和CD28抗体的AICE活化后第14天的细胞产量。数据为平均值±s.e.m，且P值通过单因素方差分析检验确定呈线性趋势(n＝两项独立实验中的三个独立供体)。(d)与Dynabeads对照相比，来自三个不同供体的原代T细胞经AICE[3:1]活化后的生长曲线。数据为平均值±s.e.m.(n＝两项独立实验中的三个独立供体)。(e)在特定分化阶段(幼稚、中央记忆(CM)、效应记忆(EM)和终末分化效应记忆(EMRA))通过CCR7和CD45RA表达水平来区分细胞的设门策略。(f)T细胞在经AICE(具有不同比例的表面部分)活化14天后的分化图。数据为n＝3个独立供体的平均值。(g)通过其抗体(克隆号：5355)在颗粒上呈递的IL-2的示意图展示了其在T细胞上的受体的β和γ单元的表位，有助于促进细胞增殖。(h)相对于Dynabeads方法，由具有表面结合IL-2或游离IL-2的AICE[3:1]活化的原代CD4+T细胞在第8天和第14天的细胞产量。数据为平均值±s.d.(n＝2个独立供体)。(i)与Dynabeads对照相比，用具有表面结合IL-2或游离IL-2的AICE[3:1]处理的两个不同供体中的CD4+原代T细胞的生长曲线。数据为n＝2次技术平行测定的平均值。(j)用AICE-[3:1，抗CD3:抗CD28](也被称为“ICEp[3:1]”)刺激14天后，CD8+T细胞的耗竭标记分析表明，与由Dynabeads活化的情况相比，来自所有三个供体的耗竭标记表达谱一致以及有所缩减。(k)AICE具有多种特性，使其适合用于治疗性T细胞生产，如此处未经优化即已实现的有前景的T细胞扩增所示。
示例7：通过引发颗粒和与门T细胞组合处理消除小鼠模型中的局部肿瘤
瘤内注射AICE颗粒(GFP修饰的PLGA微米颗粒)，使其作为全身性施用抗GFPsynNotch/抗HER2 T细胞的局部激活剂(图8A)。在NSG小鼠双侧腹处经皮下植入相同的HER2过表达K562异种移植肿瘤，作为局部肿瘤和远端交叉反应组织的模型。一周后，经静脉向小鼠施用synNotch CAR-T细胞，同时将AICE瘤内注射至一个肿瘤中，然后每隔4天向同一肿瘤中再注射3剂AICE，或者随着肿瘤体积超过500mm3开始施用后续剂量(图8A)。与未注射AICE的同一小鼠(图8B-8C)和注射有AICE加未转导的原代T细胞的小鼠的远端肿瘤相比，注射有AICE的肿瘤大小随时间流逝而减小(图8B)。我们还对在早期时间点处死的小鼠的固定肿瘤样本进行了荧光显微镜检查，并观察到在注射有AICE的肿瘤中出现选择性T细胞浸润(图8D)。这些结果表明，AICE可以在体内为synNotch CAR-T细胞的局部活化以及诱导精确的肿瘤清除提供空间控制信号，同时避免受到潜在交叉反应远端组织攻击。
图8.synNotch CAR-T细胞利用AICE局部活化来选择性杀伤体内肿瘤。图8A.AICE引发的synNotch CAR-T细胞活化通过局部瘤内注射实现的选择性清除的两种肿瘤模型示意图以及总体处理时间线。图8B.用未转导的原代T细胞和GFP包覆的AICE联合处理后的19天内，注射有AICE的肿瘤相对于远端肿瘤的肿瘤体积。数据为均值±s.e.m.(n＝6只小鼠)，且P值通过双尾配对t检验确定。图8C.用synNotch CAR-T细胞和GFP包覆的AICE联合处理后的19天内，注射有AICE的肿瘤相对于远端肿瘤的肿瘤体积。数据为均值±s.e.m.(n＝8只小鼠，其中2只在第13-15天符合安乐死实施标准)，且P值通过双尾配对t检验确定。图8D.静脉注射synNotch CAR-T细胞的小鼠的代表性图像，其显示AICE注射部位的肿瘤缩小，但远端部位的肿瘤却在生长。图8E.收集自小鼠8的肿瘤中CD3+T细胞固定染色的代表性图像，此小鼠在早期因符合安乐死实施标准而被处死(n＝10次技术平行测定)。个体小鼠的肿瘤体积请见图8F。
示例8：用于细胞因子释放的SYNNOTCH受体的密度依赖性活化
如上文示例2所述，synNotch T细胞表现出与门杀伤行为，其在GFP呈递PLGA微米颗粒(称为“AICE”颗粒；也称为“ICEp”)存在的情况下，以最大密度的GFP选择性地杀伤HER2+A375细胞。此外，我们在CD4+和CD8+CAR-T细胞中观察到用于细胞因子释放的synNotch受体出现密度依赖性活化(图9a和b)，还观察到CD8+细胞对靶标的杀伤(图9c)。呈递低密度GFP抗原的PLGA微米颗粒可能导致HER2-CAR在T细胞上的呈递活性不足，这也解释了起初使用通过传统表面缀合化学反应实现官能化且GFP密度偏低的颗粒未能激活synNotch CAR-T细胞毒性的原因(图9c)。这进一步强调了这种新蛋白质负载策略对于逻辑门控细胞调节的重要性。
图9.(a)原代人CD4+在与GFP呈递微米颗粒(ICEp-GFP)和Her2+A375靶细胞共培养48小时后进行的IL-2分泌，其分泌量取决于ICEp-GFP密度。数据为平均值±s.d.(n＝4个生物学独立样本的2次技术重平行测定)。(b)CD8+T细胞在与具有不同GFP密度的ICEp和HER2+A375靶细胞共孵育2天后进行的IFN-γ分泌。数据为平均值±s.d.(n＝4个生物学独立样本的2次技术重平行测定)。(c)与门T细胞的靶标杀伤效力由不同密度的ICEp-GFP引发，只有GFP密度高于采用传统化学方法可能达到的密度的颗粒才能引发强力杀伤效果。数据为平均值±s.d.(n＝2项独立实验的8次生物学平行测定)。
示例9：DNA支架化颗粒的血清细胞因子和趋化因子量化及临床化学检测
通过静脉内注射将DNA支架化颗粒构建体注射到BALB/c小鼠体内，然后量化血清细胞因子/趋化因子(小鼠细胞因子/趋化因子31-plex)，并对在2天后收集的血液进行临床化学检测。用载有DNA支架和小鼠同种型IgG的PLGA纳米颗粒(直径约为250nm)和微米颗粒(直径约为1.5μm)处理后，结果显示血液细胞因子水平与PBS处理对照品的相应水平类似(图10a)。同时，其血液临床化学检测值通常与PBS对照品的相应值类似，位于参考文献中每个参数的正常范围内(图10b)。
图10.BALB/c小鼠在静脉注射同种型IgG负载纳米颗粒(直径约为250nm)和微米颗粒(直径约为1.5μm)2天后的血清细胞因子检测套组(a)和血液测试(b)情况。(a)中的数据是n＝3只小鼠的相应数据平均值，(b)中的数据是n＝6只小鼠的相应数据平均值，并且处理A与B之间以及A与C之间存在显著性。P值通过双尾配对t检验确定。除MIP-1B外，纳米颗粒和微米颗粒处理的细胞因子分泌水平(32检测套组)与PBS对照品的相关分泌水平无差异。所有三种处理的临床化学检测值均低于每项测试正常范围的上限，具体请参阅亚利桑那大学动物护理和TREAT-NMD.SOP。除肌酐(CREA)外，纳米颗粒和微米颗粒处理的血液化学检测值与PBS对照品的相应值无差异。
示例10：使用在合成颗粒上呈递的CAR抗原活化CAR-T细胞
在急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤中使用靶向B细胞抗原CD19的嵌合抗原受体(CAR)T细胞可得到显著的临床反应。然而，CAR-T细胞在更为广泛的临床应用中仍然面临诸多挑战，包括：i)扩增足够数量的工程化T细胞以用于临床治疗，从而使T细胞无能和耗竭；以及ii)维持有效记忆CAR-T细胞的持久性和活性，以消除体内持久性白血病，这是实现患者有意义的临床反应的重要预后因素。在B细胞癌中，CD19抗原会随着治疗过程中健康B细胞和恶性B细胞的清除而耗尽。因此，CAR-T计数下降且最终难以在患者体内检测到。通过在作为人造抗原呈递细胞(TAPC-CD19)的工程化T细胞上提供补充的CD19抗原来改善CAR-T细胞体内持久性的方法目前正处于临床试验阶段(clinicaltrials.gov，NCT03186118)。改善CAR-T细胞体内扩增、持久性和杀伤潜力的策略对于B细胞恶性肿瘤以外的适应证至关重要。
出乎意料的是，存在于合成颗粒(CAPP)上的CAR抗原可以活化CAR-T细胞，使其大量增殖，并且其细胞因子产量远低于通过经靶向人白血病细胞(K562)活化达到的细胞因子产量。合成颗粒的示例包括聚合物颗粒、磁性颗粒和脂质体。这种效果可以通过各种抗原(包括HER2、EGFR、CD22和GFP)观察到。耗竭标记的染色表明，与经靶细胞活化的情况相比，经CAPP扩增的细胞耗竭率更低。CAPP活化后扩增的细胞的杀伤效力与原始细胞相同，而靶细胞活化后扩增的细胞的杀伤力有所下降。只需施用CAPP，即可利用这些特性生产CAR-T细胞，实现离体扩增，同时将其转化为增加患者体内CAR-T细胞丰度的治疗方法。与T APC-CD19临床试验中使用的当前策略相比，该方法的优势包括：易于生产制造；有可能减少细胞因子释放综合征；作用持续时间更长；CAR-T细胞耗竭减少。同时，局部施用CAPP可改善CAR-T在实体瘤治疗中的疗效。
图11.用于CAR-T细胞增殖的CAR抗原呈递颗粒(CAPP)。(a,b)图解说明CAPP用于CAR T细胞扩增的示意图。生成靶向特定抗原的CAR-T细胞(a)。呈递抗原的合成颗粒(CAPP)可用于驱动CAR T细胞扩增(b)。(c)CAPP可用作增加患者体内CAR-T细胞丰度的治疗方法，尤其是在表达抗原的细胞随时间而耗尽，导致CAR-T细胞计数下降的患者中(例如，B细胞癌)。
图12.CAPP使具有不同抗原的CAR-T细胞活化。(a)产生呈递不同抗原的聚合物颗粒，这些抗原是HER2、EGFR、GFP和CD19，它们分别能够活化HER2-CAR、EGFR-CAR、GFP-CAR和CD19-CAR。如上文材料与方法部分中所述，产生聚合物CAPP。(b)呈递HER2、EGFR、GRP和CD19的CAPP能够诱导相应CAR-T细胞的增殖。
CAR-T细胞增殖测定方案：
按照说明，用CellTrace Violet染料(目录号：C34557)对组成性CAR-T细胞进行染色。将CAR抗原呈递颗粒(包括PLGA纳米颗粒/微米颗粒、脂质体或磁性颗粒)与细胞以10:1(颗粒:细胞)的比例混合，并在37℃下孵育4天。然后，使用流式细胞术分析细胞的增殖情况。
图13.CAPP在一系列粒径和抗原密度范围内诱导细胞扩增的能力。(a)CAPP呈递EGFR在一系列不同粒径范围内诱导EGFR-CAR细胞扩增。(b)CAPP上的CAR抗原密度对CAPP介导的细胞扩增无影响。
为了确定呈递CAR抗原的合成颗粒(聚合物颗粒除外)能否诱导细胞扩增，生成呈递CAR抗原的磁性颗粒和脂质体颗粒。
具有表面生物素的磁性颗粒购自Invitrogen(目录号：11047)。使用以下方案制备具有表面生物素的脂质体颗粒：将10mg/mL DSPE(Avanti)与19％(重量比)DSPE-PEG(2000)-生物素(Avanti 880129)混合，通过传统挤出方法制备脂质体。简而言之，将溶于氯仿中的脂质混合物沉积于试管中，并在氮气流下干燥成脂质膜，然后高真空处理2小时。随后，将样本置于PBS缓冲液中水合，然后挤出。接着，将链霉亲和素添加至如上所述的颗粒中，然后加入生物素化蛋白(EGFR或GFP)用于颗粒表面负载。
图14.合成颗粒(聚合物颗粒除外)上的CAR抗原呈递也能诱导细胞扩增。(a,b)磁珠呈递EGFR(a)和抗原呈递T细胞呈递EGFR(APT-EGFR)(b)能够诱导EGFR-CAR的增殖。(c)APT呈递GFP(APT-GFP)和脂质体呈递GFP能够诱导GFP/CD19-CAR的增殖。
图15.CAPP介导的细胞增殖不会诱导细胞因子的产生(细胞外和细胞内)，也不会引起细胞耗竭。(a,b)使用聚合物CAPP时，观察到最小IFN-γ细胞外释放(a)且无细胞内IFN-γ累积(b)，而使用呈递CAR抗原的K562细胞时，观察到细胞因子释放。(c)耗竭标记的染色表明，与经靶细胞活化的情况相比，经CAPP扩增的细胞耗竭率更低。(d)CAPP活化后扩增的细胞的杀伤效力与原始细胞相同，而靶细胞活化后扩增的细胞的杀伤力有所下降。
图16.磁珠和脂质体上的CAR抗原呈递不会引起细胞耗竭，也不会诱导明显的细胞因子释放。(a)通过磁性EGFR颗粒扩增的CAR-T细胞的细胞耗竭曲线与经PLGA-EGFR(CAPP-EGFR)活化的细胞的相应曲线类似，两者的细胞耗竭率均明显低于经K562-EGFR活化的细胞的耗竭率。(b)使用呈递CAR抗原的脂质体、磁性颗粒和聚合物颗粒(分别称为“脂质体”、“磁性颗粒”和“CAPP”)时，在扩增的CAR-T细胞中观察到最小IFN-γ释放，而在使用呈递CAR抗原的K562细胞时，观察到IFN-γ释放。
示例11：具有DNA悬挂孔的PCL薄膜
将DNA支架掺入由生物相容性聚合物(例如，PCL、PLGA、PLA等)制成的多孔薄膜中，从而提供一种附着具有极高密度且实现比例计量控制的官能化生物分子(例如，蛋白质、抗体、肽、核酸等)的便捷方法。具有官能化生物分子的薄膜可植入装置通过这种方式可用于各种生物医学应用中，例如适用于糖尿病、癌症治疗、自身免疫性疾病等的过继细胞移植，其中官能化生物分子包覆薄膜可为工程化细胞提供友好的环境。该装置也可用于其他局部药物递送应用中。
薄膜流延。在室温下，使PCL(4k)-PEG(2k)-Mal(Creative PEGWorks Inc.，目录号：DCM-2k4k)与200μM 3'端硫醇修饰的DNA 17mer(5'GTTCATCTGCACCACCG 3')在DMF:H2O(v/v，90:10)溶剂中按1:1的摩尔比反应过夜。然后在70℃下真空蒸发3小时以干燥反应混合物。使用3mL注射器将预溶于60μL溶剂(TFE:H2O v/v，50:50)的30nmol至100nmol聚合物—DNA缀合物与预溶于800μL TFE中的0.12mg PCL(Sigma，编号：440744，Mn 80,000)和0.12mg PEG(Sigma，编号：295906，Mn 2050)混合。将该溶液涂覆在干净的玻璃板上，然后立即使用多间隙方形涂布器(Thomas Scientific Mfr.，编号：5363，第3侧)进行薄膜流延处理。将玻璃板置于通风橱中风干25分钟，然后撕下薄膜，同时用水冲洗。接着，将薄膜置于超纯水中振荡孵育过夜，而后置于纸巾上风干。
DNA支架分析。在37℃下，在掺有600mM Na+和0.01％Tween-20的PBS缓冲液中，用过量的5'FITC标记的互补链(5'CGGTGGTGCAGATGAACTTCAG 3')孵育直径为0.25英寸的薄膜凸模30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤三遍。接着，对洗涤过的薄膜进行共聚焦成像，或使其溶于50uL TFE中，并在Tris-EDTA缓冲液中稀释10倍以便进行基于荧光的分析。
图17.多孔薄膜装置中DNA支架的演示。(a)使用PCL(4k)-PEG(2k)-Mal(CreativePEGWorks Inc.)进行PCL-PEG-DNA缀合。凝胶显示存在PCL-PEG-DNA缀合物。(b)在TFE+PCL-PEG-DNA(30、70、100nmol)中使用4.5mg PCL(80k)+4.5mg PEG(2k)进行薄膜流延处理。(c)DNA杂交测试。含FITC标记的23nt互补链。结果表明，在所有受试PCL-PEG-DNA浓度下都发生了DNA杂交。(d)DNA孔共聚焦显微镜Z轴堆栈扫描，载玻片之间为0.6μm。
出于完整性考虑，在以下编号的条款中阐述了本发明的各个方面：
条款1一种向包含特异性结合对的第二成员的细胞提供所述特异性结合对的第一成员的方法，所述方法包含：使聚合物颗粒与所述细胞接触，所述颗粒包含：聚合物核；包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；以及包含与所述第一结合成员共价连接的第二单链核酸的第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第一结合成员，其中所述第一结合成员与所述第二结合成员特异性结合，其中所述第二结合成员存在于所述细胞表面，其中所述颗粒是纳米颗粒或微米颗粒。
条款2根据条款1所述的方法，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(乳酸)(PLA)。
条款3根据条款1所述的方法，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(e-己内酯)(PCL)或聚乙二醇(PEG)。
条款4根据条款1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸—聚合物缀合物中的聚合物包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)或聚(D,L-丙交酯)(PLA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLA-嵌段-PEG)或聚(e-己内酯)(PCL)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PCL-嵌段-PEG)。
条款5根据条款1-4中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。
条款6根据条款5所述的方法，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
条款7根据条款1-6中任一项所述的方法，其中所述第二单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)，任选地，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
条款8根据条款1-7中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸包含与所述第二单链核酸中的至少4个连续碱基互补的至少4个连续碱基。
条款9根据条款1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞是i)选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样免疫细胞和B细胞组成的群组的免疫细胞，任选地，其中所述免疫细胞已经过基因工程改造，并且任选地，其中所述T细胞包含调节性T细胞；或ii)干细胞。
条款10根据条款1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞包含结合触发的转录开关(BTSS)，所述转录开关包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)结合转导子；以及c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合可激活所述细胞内结构域。
条款11根据条款10所述的方法，其中所述BTTS是嵌合Notch多肽，其从N末端至C末端以共价键合的方式包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员并非天然存在于Notch受体多肽中，但与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)包含Lin 12-Notch重复序列、S2蛋白水解裂解位点和跨膜结构域(包含S3蛋白水解裂解位点)的Notch调节区；c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，所述细胞内结构域与所述Notch调节区异源并取代天然存在的细胞内Notch结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合，可诱导在S2和S3蛋白水解裂解位点发生裂解，从而释放所述细胞内结构域。
条款12根据条款1-11中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员或所述第二结合成员选自由以下各项组成的群组：抗体、基于抗体的识别支架、基于非抗体的识别支架、抗原、受体的配体、受体、基于非抗体的识别支架的靶标、细胞外基质组分和粘附分子。
条款13根据条款1-12中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员包含IL-2，使得IL-2在所述聚合物颗粒表面呈递，任选地，其中所述第二结合成员是与在所述聚合物颗粒表面呈递的IL-2特异性结合的受体。
条款14根据条款1-12中任一项所述的方法，其中所述第二结合成员是与抗原特异性结合的单链Fv(scFv)或纳米抗体，其中所述第一结合成员是所述抗原。
条款15根据条款10-14中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含响应于所述转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接。
条款16根据条款1-14中任一项所述的方法，其中所述颗粒包含第二核酸—聚合物缀合物，所述第二核酸—聚合物缀合物包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸，并且所述颗粒包含第二第一结合成员—核酸缀合物，所述第二第一结合成员—核酸缀合物包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员与所述第二特异性结合对的所述第一结合成员的存在比例为10:1至1:10。
条款17根据条款16所述的方法，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与在肿瘤细胞的细胞表面表达的所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述方法包含使表达所述第一特异性结合对的所述第二结合成员的细胞以及表达所述第二特异性结合对的所述第二结合成员的肿瘤细胞与所述颗粒接触，其中表达所述第一特异性结合对的所述第二结合成员的所述细胞是T细胞。
条款18根据条款16所述的方法，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员是与所述第一特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员均在T细胞的细胞表面表达；以及其中所述方法包含使表达所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员的T细胞与所述颗粒接触，其中所述第一结合成员与所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员结合可诱导T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加。
条款19根据条款18所述的方法，其中所述第一或第二特异性结合对的所述第二结合成员中的其中一个成员是CD3，另一个成员是CD28，任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为1:3至5:1，进一步任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为3:1。
条款20根据条款15所述的方法，其中所述颗粒包含第二核酸—聚合物缀合物，所述第二核酸—聚合物缀合物包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸，并且所述颗粒包含第二第一结合成员—核酸缀合物，所述第二第一结合成员—核酸缀合物包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与由所述细胞表达(响应于所述第一特异性结合对的所述第一成员与由所述细胞表达的BTTS的结合)的CAR结合的抗原，其中所述细胞是T细胞，并且其中所述CAR抗原与所述T细胞结合可诱导T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加，任选地，其中所述BTTS是嵌合Notch多肽。
条款21根据条款1-20中任一项所述的方法，其中所述接触包含将所述颗粒施用于受试者的肿瘤或静脉内。
条款22根据条款1-20中任一项所述的方法，其中所述接触包含向所述受试者施用所述细胞。
条款23根据条款1-22中任一项所述的方法，其中所述颗粒是直径范围为50nm-500nm的纳米颗粒。
条款24根据条款1-22中任一项所述的方法，其中所述颗粒是直径范围为0.5μm-50μm的微米颗粒。
条款25一种聚合物颗粒，其包含：聚合物核；包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价连接，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；包含与所述第一结合成员共价缔合的第二单链核酸的第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第一结合成员，其中所述第一结合成员是特异性结合对的成员，其中所述第一结合成员与第二结合成员(其为所述特异性结合对的成员)特异性结合。
条款26根据条款25所述的聚合物颗粒，其中所述第一结合成员是抗原，且所述第二结合成员是与所述抗原特异性结合的抗体，反之亦然。
条款27根据条款26所述的聚合物颗粒，其中所述抗体是纳米抗体、单域抗体、双抗体、三抗体或微型抗体。
条款28根据条款27所述的聚合物颗粒，其中所述第一结合成员是受体，且所述第二结合成员是与所述受体特异性结合的配体，反之亦然。
条款29根据条款25-28中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(乳酸)(PLA)。
条款30根据条款25-28中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(乳酸)(PLA)以及聚乙二醇(PEG)。
条款31根据条款25-30中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述核酸—聚合物缀合物中的聚合物包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)或聚(D,L-丙交酯)(PLA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLA-嵌段-PEG)。
条款32根据条款25-31中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述第一单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。
条款33根据条款32所述的聚合物颗粒，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
条款34根据条款25-33中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述第二单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
条款35根据条款34所述的聚合物颗粒，其中所述DNA或RNA包含5-200个碱基。
条款36根据条款25-35中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述第一单链核酸包含与所述第二单链核酸中的至少4个连续碱基互补的至少4个连续碱基。
条款37根据条款25-36中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述聚合物颗粒包含被接收所述聚合物颗粒的受试者的巨噬细胞识别为内源性“别吃我”信号的自身肽。
条款38根据条款37所述的方法，其中所述第一结合成员与所述自身肽的存在比例范围为1:10至10:1。
条款39根据条款25-38中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述第一结合成员包含IL-2，使得IL-2在所述聚合物颗粒表面呈递，任选地，其中所述第二结合成员是与在所述聚合物颗粒表面呈递的IL-2特异性结合的受体。
条款40根据条款25-38中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述颗粒包含第二核酸—聚合物缀合物，所述第二核酸—聚合物缀合物包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸，并且所述颗粒包含第二第一结合成员—核酸缀合物，所述第二第一结合成员—核酸缀合物包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员。
条款41根据条款40所述的聚合物颗粒，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员与所述第二特异性结合对的所述第一结合成员的存在比例为10:1至1:10。
条款42根据条款40或条款41所述的聚合物颗粒，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员包含与存在于BTTS(其在T细胞表面表达)细胞外结构域中的抗体特异性结合的抗原，并且所述第二特异性结合对的所述第一结合成员包含与由所述T细胞表达(响应于所述第一特异性结合对的所述第一成员与所述抗体的结合)的CAR结合的CAR抗原，任选地，其中存在于所述BTTS的细胞外结构域中的所述抗体是存在于嵌合Notch多肽的细胞外结构域中的抗体。
条款43根据条款40或条款41所述的聚合物颗粒，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员是与在T细胞的细胞表面表达的所述第一特异性结合对的第一结合成员结合的抗体，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与在T细胞的细胞表面表达的所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体。
条款44根据条款43所述的聚合物颗粒，其中所述第一或第二特异性结合对的所述第二结合成员中的其中一个成员是CD3，另一个成员是CD28，任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为1:3至5:1，进一步任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为3:1。
条款45根据条款25-44中任一项所述的聚合物颗粒，其中所述聚合物颗粒包含核酸、肽和/或包囊于所述聚合物核中的多肽。
条款46一种包含根据条款25-45中任一项所述的聚合物颗粒以及药学上可接受的赋形剂的组合物。
条款47一种试剂盒，其包含：根据条款25-45中任一项所述的聚合物颗粒；以及细胞，其包含：BTTS，其中所述BTTS包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)结合转导子；以及c)包含转录激活因子的细胞内结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合可激活所述细胞内结构域；以及响应于所述转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接，任选地，其中所述细胞是T细胞。
条款48根据条款47所述的试剂盒，其中所述BTTS包含：嵌合Notch多肽，其从N末端至C末端以共价键合的方式包含：a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员并非天然存在于Notch受体多肽中，但与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；b)包含Lin 12-Notch重复序列、S2蛋白水解裂解位点和跨膜结构域(包含S3蛋白水解裂解位点)的Notch调节区；c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，所述细胞内结构域与所述Notch调节区异源并取代天然存在的细胞内Notch结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合，可诱导在S2和S3蛋白水解裂解位点发生裂解，从而释放所述细胞内结构域。
条款49一种制造聚合物颗粒的方法，所述方法包含：使核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物，其中所述核酸是第一单链核酸；对包含所述核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液进行超声处理以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物)的聚合物颗粒，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物核连接；以及使所述第二单链核酸与特异性结合对的第一结合成员共价或非共价连接，以生成所述聚合物颗粒。
条款50根据条款49所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之前，使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
条款51根据条款49所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之后，再使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
条款52根据条款49-51中任一项所述的方法，其中所述第二单链核酸与连接子连接。
条款53根据条款49所述的方法，其中所述方法包含使所述第二单链核酸与生物素分子共价连接，并且使亲和素—第一结合成员缀合物与所述第二单链核酸非共价连接。
条款54根据条款49-53中任一项所述的方法，其中所述方法包含生成多种核酸—聚合物缀合物，其中所述多种核酸—聚合物缀合物包含：第一核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第一单链核酸；以及第二核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第三单链核酸，其中所述第一单链核酸与所述第三单链核酸具有不同的序列。
条款55根据条款54所述的方法，其中所述方法包含：对包含所述多种核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液进行超声处理以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物)的聚合物颗粒，其中所述多种核酸—聚合物缀合物的每个聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸和所述第三单链核酸；使以下各项与所述聚合物核连接：具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸(通过杂交连接)和具有与所述第三单链核酸互补的序列的第四单链核酸(通过杂交连接)；以及使以下各项进行共价或非共价连接：所述第二单链核酸与第一特异性结合对的第一结合成员以及所述第四单链核酸与生物分子，以生成所述聚合物颗粒。
条款56根据条款55所述的方法，其中所述生物分子是自身肽。
条款57根据条款55所述的方法，其中所述生物分子是第二特异性结合对的第一结合成员。
条款58根据条款55-57中任一项所述的方法，其中所述第一核酸—聚合物缀合物和所述第二核酸—聚合物缀合物以1:10至10:1的比例包括在所述溶液中。
条款59一种制造聚合物颗粒(包含包囊于聚合物核中的肽、多肽和/或核酸以及核酸—聚合物缀合物(包含与第一聚合物共价连接的第一单链核酸))的方法，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸，所述方法包含：对包含所述肽、多肽和/或核酸以及第二聚合物的溶液进行超声处理；将所述核酸—聚合物缀合物加入所述溶液中，并进一步对所述溶液进行超声处理，以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物且包囊所述肽、多肽和/或核酸)的聚合物颗粒，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物核连接；以及使所述第二单链核酸与特异性结合对的第一结合成员共价或非共价连接，以生成所述聚合物颗粒。
条款60根据条款59所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之前，使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
条款61根据条款59所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物核连接之后，再使所述第二单链核酸与所述第一结合成员共价连接。
条款62根据条款59-61中任一项所述的方法，其中所述第二单链核酸与连接子连接。
条款63根据条款59所述的方法，其中所述方法包含使所述第二单链核酸与生物素分子共价连接，并且使亲和素—第一结合成员缀合物与所述第二单链核酸非共价连接。
条款64根据条款59-63中任一项所述的方法，其中所述方法包含生成多种核酸—聚合物缀合物，其中所述多种核酸—聚合物缀合物包含：第一核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第一单链核酸；以及第二核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第三单链核酸，其中所述第一单链核酸与所述第三单链核酸具有不同的序列。
条款65根据条款54所述的方法，其中所述方法包含：将所述多种核酸—聚合物缀合物加入所述溶液中，并对所述溶液进行超声处理，以生成包含聚合物核(包含所述第二聚合物和所述肽、多肽和/或核酸)的聚合物颗粒，其中所述多种核酸—聚合物缀合物的每个聚合物区域与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸和所述第三单链核酸；使以下各项与所述聚合物核连接：具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸(通过杂交连接)和具有与所述第三单链核酸互补的序列的第四单链核酸(通过杂交连接)；以及使以下各项进行共价或非共价连接：所述第二单链核酸与第一特异性结合对的第一结合成员以及所述第四单链核酸与生物分子，以生成所述聚合物颗粒。
条款66根据条款1-9中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员是与在所述细胞上表达的CAR结合的抗原，其中所述细胞是CAR-T细胞。
条款67根据条款66所述的方法，其中所述抗原选自由以下各项组成的群组：CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。
条款68根据条款25所述的聚合物颗粒，其中所述第一结合成员是与在细胞上表达的CAR结合的抗原，其中所述细胞是CAR-T细胞。
条款69根据条款68所述的聚合物颗粒，其中所述抗原选自由以下各项组成的群组：CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。
条款70一种增强CAR-T细胞增殖的方法，所述方法包含使所述CAR-T细胞与CAR抗原呈递颗粒接触，其中所述CAR抗原呈递颗粒包含在合成颗粒表面呈递的第一结合成员，其中所述第一结合成员是与在所述CAR-T细胞上表达的CAR特异性结合的抗原，并且任选地，其中所述抗原与所述CAR结合可诱导CAR-T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加和/或不会使CAR-T细胞耗竭。
条款71根据条款70所述的方法，其中所述抗原选自由以下各项组成的群组：CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。
条款72根据条款70或条款71所述的方法，其中所述合成颗粒是聚合物颗粒、磁珠或脂质体。
条款73根据条款72所述的方法，其中所述合成颗粒是条款68中所述的聚合物颗粒。
条款74根据条款70-73中任一项所述的方法，其中所述接触包含接触T细胞群体(包含所述离体CAR-T细胞)，其中所述T细胞群体已从受试者体内分离出来。
条款75根据条款74所述的方法，其中所述方法进一步包含在增殖后向所述受试者施用所述CAR-T细胞。
条款76根据条款70-73中任一项所述的方法，其中接触包含向所述受试者施用所述合成颗粒。
条款77根据条款74-76中任一项所述的方法，其中所述受试者患有B细胞癌，任选地，其中所述B细胞癌是白血病。
条款78根据条款77所述的方法，其中所述白血病是复发性或难治性CD 19+白血病，并且所述抗原是CD 19。
条款79根据条款74-78中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已接受过或正在接受CAR-T细胞免疫疗法。
条款80根据条款74-79中任一项所述的方法，其中所述CAR-T细胞是已经过基因修饰以表达所述CAR的效应T细胞，或者其中所述CAR-T细胞是已经过基因修饰以表达所述CAR的调节性T细胞(Treg)。
条款81一种在增强受试者CAR-T细胞增殖的方法中使用的CAR抗原呈递颗粒，所述方法包含向所述受试者施用CAR抗原呈递颗粒，其中所述CAR抗原呈递颗粒包含在合成颗粒表面呈递的第一结合成员，其中所述第一结合成员是与在所述CAR-T细胞上表达的CAR特异性结合的抗原。
条款82一种在受试者治疗方法中使用的CAR-T细胞，其中所述方法包含：使CAR抗原呈递颗粒与包含所述离体CAR-T细胞的T细胞群体接触；以及在增殖后向所述受试者施用所述CAR-T细胞，其中所述CAR抗原呈递颗粒包含在合成颗粒表面呈递的第一结合成员，其中所述第一结合成员是与在所述CAR-T细胞上表达的CAR特异性结合的抗原。
条款83根据条款81所使用的CAR抗原呈递颗粒，或者根据条款82所使用的CAR-T细胞，其中所述CAR抗原呈递颗粒是条款68中所述的聚合物颗粒。
条款84一种生物分子包覆薄膜，其包含：包含一个或更多个孔的聚合物薄膜；包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物薄膜非共价缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一单链核酸；以及包含与生物分子共价连接的第二单链核酸的第一生物分子—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一生物分子。
条款85根据条款84所述的生物分子包覆薄膜，其中所述聚合物薄膜包含聚己内酯(PCL)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)或聚乙醇酸(PGA)。
条款86根据条款84或条款85所述的生物分子包覆薄膜，其中所述聚合物薄膜包含聚己内酯(PCL)和聚乙二醇(PEG)。
条款87根据条款84-86中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述核酸—聚合物缀合物中的聚合物包含聚己内酯(PCL)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PCL-嵌段-PEG)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)或聚(D,L-丙交酯)(PLA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLA-嵌段-PEG)。
条款88根据条款84-87中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述第一单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。
条款89根据条款88所述的生物分子包覆薄膜，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
条款90根据条款84-89中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述第二单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
条款91根据条款90所述的生物分子包覆薄膜，其中所述DNA或RNA包含5-200个碱基。
条款92根据条款84-91中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述第一单链核酸包含与所述第二单链核酸中的至少4个连续碱基互补的至少4个连续碱基。
条款93根据条款84-92中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述聚合物薄膜包含直径为1至5μm的孔，任选地，其中所述聚合物薄膜包含直径为1至2μm的孔。
条款94根据条款84-93中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述聚合物薄膜的厚度为1至100μm。
条款95根据条款84所述的生物分子包覆薄膜，其中所述生物分子选自由以下各项组成的群组：蛋白质、肽、抗体和核酸。
条款96根据条款84-95中任一项所述的生物分子包覆薄膜，其中所述生物分子是在合成颗粒表面呈递的第一结合成员，其中所述第一结合成员是与在所述CAR-T细胞上表达的CAR特异性结合的抗原。
条款97根据条款96所述的生物分子包覆薄膜，其中所述抗原选自由以下各项组成的群组：CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。
条款98一种制造生物分子包覆薄膜的方法，所述方法包含：使核酸与第一聚合物共价连接以生成核酸—聚合物缀合物，其中所述核酸是第一单链核酸；在溶剂中混合包含所述核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液；对所述溶液进行薄膜流延处理以生成包含所述第二聚合物的聚合物薄膜，其中所述核酸—聚合物缀合物的所述聚合物区域与所述聚合物薄膜非共价缔合，从而在所述聚合物薄膜表面呈递所述第一单链核酸；通过杂交使具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接；以及使所述第二单链核酸与生物分子共价或非共价连接，以生成所述生物分子包覆薄膜。
条款99根据条款98所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接之前，使所述第二单链核酸与所述生物分子共价连接。
条款100根据条款98所述的方法，其中所述方法包含在使所述第二单链核酸与所述聚合物薄膜连接之后，再使所述第二单链核酸与所述生物分子共价连接。
条款101根据条款98-100中任一项所述的方法，其中所述方法包含生成多种核酸—聚合物缀合物，其中所述多种核酸—聚合物缀合物包含：
第一核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第一单链核酸；以及
第二核酸—聚合物缀合物，其包含与第一聚合物分子共价连接的第三单链核酸，
其中所述第一单链核酸与所述第三单链核酸具有不同的序列。
条款102根据条款101所述的方法，其中所述方法包含：在对所述溶液进行薄膜流延处理之前，将包含所述多种核酸—聚合物缀合物和第二聚合物的溶液混合，以生成包含所述第二聚合物的聚合物薄膜，其中所述多种核酸—聚合物缀合物的每个聚合物区域与所述聚合物薄膜非共价缔合，从而在薄膜流延处理之后于所述聚合物薄膜表面呈递所述第一单链核酸和所述第三单链核酸；使以下各项与所述聚合物薄膜连接：具有与所述第一单链核酸互补的序列的第二单链核酸(通过杂交连接)和具有与所述第三单链核酸互补的序列的第四单链核酸(通过杂交连接)；以及
使以下各项进行共价或非共价连接：所述第二单链核酸与生物分子以及所述第四单链核酸与另一生物分子，以生成所述生物分子包覆薄膜。
条款103一种过继细胞移植方法，所述方法包含：用根据条款84-95中任一项所述的生物分子包覆薄膜包囊细胞或细胞群体；以及向有相应需求的受试者施用所述包囊细胞或包囊细胞群体。
条款104一种增强CAR-T细胞增殖的方法，所述方法包含使所述CAR-T细胞与条款96或条款97所述的生物分子包覆薄膜接触。
尽管为了达到清晰理解的目的采用图示和示例的方式详细描述了前述发明，但是鉴于本发明的教学意义，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可对其进行特定的变更和修改。还应当理解，本专利中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种结构，尽管这里没有明确表述或示出，但这些设计反应了本发明的原理，未超出本发明的精神和范围。此外，本文列举的所有示例和条件语言主要为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步拓展本领域所提供的构想，并且应解释为不受这些具体列举的示例和条件的限制。而且，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其在结构和功能上的等同物。此外，所述等同物拟包括目前已知的等同物和日后待开发的等同物，即，开发出的任何功能相同的原件且与结构无关。因此，本发明的范围并不限于本文中显示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求书体现。

Claims (25)

1.一种非治疗目的的向包含特异性结合对的第二成员的细胞提供所述特异性结合对的第一成员的方法，所述方法包含：
使聚合物颗粒与所述细胞接触，所述颗粒包含：
聚合物核，其包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D,L-丙交酯)
(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(e-己内酯)(PCL)或聚乙二醇(PEG)或其组合；
包含与聚合物共价连接的第一单链核酸的核酸—聚合物缀合物，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第一单链核酸，其中所述聚合物包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)或聚(D,L-丙交酯)(PLA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLA-嵌段-PEG)或聚(e-己内酯)(PCL)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PCL-嵌段-PEG)或其组合；以及
包含与所述第一结合成员共价连接的第二单链核酸的第一结合成员—核酸缀合物，其中所述第二单链核酸与所述第一单链核酸互补，且通过杂交与所述第一单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第一结合成员，
其中所述第一结合成员与所述第二结合成员特异性结合，并且其中所述第二结合成员存在于所述细胞表面上，
其中所述颗粒是纳米颗粒或微米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或聚(乳酸)(PLA)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二单链核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)，任选地，其中所述DNA或RNA或PNA包含5-200个碱基。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸包含与所述第二单链核酸中的至少4个连续碱基互补的至少4个连续碱基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞是：
i)选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样免疫细胞和B细胞组成的群组的免疫细胞，任选地，其中所述免疫细胞已经过基因工程改造，并且任选地，其中所述T细胞包含调节性T细胞；或
ii)干细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞包含结合触发的转录开关(BTSS)，所述转录开关包含：
a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；
b)结合转导子；以及
c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合激活所述细胞内结构域。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述BTTS是嵌合Notch多肽，所述多肽从N末端至C末端以共价键合的方式包含：
a)包含所述特异性结合对的所述第二成员的细胞外结构域，所述第二成员并非天然存在于Notch受体多肽中，但与所述特异性结合对的所述第一成员特异性结合；
b)包含Lin 12-Notch重复序列、S2蛋白水解裂解位点和跨膜结构域的Notch调节区，所述跨膜结构域包含S3蛋白水解裂解位点；
c)包含转录激活因子或转录阻遏因子的细胞内结构域，所述细胞内结构域与所述Notch调节区异源并取代天然存在的细胞内Notch结构域，其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的所述第二成员结合，诱导在S2和S3蛋白水解裂解位点发生裂解，从而释放所述细胞内结构域。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员或所述第二结合成员选自由以下各项组成的群组：抗体、基于抗体的识别支架、基于非抗体的识别支架、抗原、受体的配体、受体、基于非抗体的识别支架的靶标、细胞外基质组分和粘附分子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员包含IL-2，使得所述IL-2在所述聚合物颗粒表面呈递，
任选地，其中所述第二结合成员是与在所述聚合物颗粒表面呈递的IL-2特异性结合的受体。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第二结合成员是与抗原特异性结合的单链Fv(scFv)或纳米抗体，其中所述第一结合成员是所述抗原。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含响应于所述转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可操作地连接。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述颗粒包含第二核酸—聚合物缀合物，所述第二核酸—聚合物缀合物包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸，并且所述颗粒包含第二第一结合成员—核酸缀合物，所述第二第一结合成员—核酸缀合物包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员，
其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员与所述第二特异性结合对的所述第一结合成员的存在比例为10:1至1:10。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与在肿瘤细胞的细胞表面表达的所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述方法包含使表达所述第一特异性结合对的所述第二结合成员的细胞以及表达所述第二特异性结合对的所述第二结合成员的肿瘤细胞与所述颗粒接触，其中表达所述第一特异性结合对的所述第二结合成员的所述细胞是T细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一特异性结合对的所述第一结合成员是与所述第一特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与所述第二特异性结合对的第二结合成员结合的抗体，其中所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员均在T细胞的细胞表面表达；以及
其中所述方法包含使表达所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员的T细胞与所述颗粒接触，其中所述第一结合成员与所述第一和第二特异性结合对的所述第二结合成员结合诱导T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一或第二特异性结合对的所述第二结合成员中的其中一个成员是CD3，另一个成员是CD28，
任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为1:3至5:1，进一步任选地，其中与CD3结合的所述第一结合成员和与CD28结合的所述第一结合成员的存在比例为3:1。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述颗粒包含第二核酸—聚合物缀合物，所述第二核酸—聚合物缀合物包含与所述聚合物共价连接的第三单链核酸，其中所述聚合物与所述聚合物核非共价缔合，从而在所述聚合物核表面呈递所述第三单链核酸，并且所述颗粒包含第二第一结合成员—核酸缀合物，所述第二第一结合成员—核酸缀合物包含与第二特异性结合对的所述第一结合成员共价连接的第四单链核酸，其中所述第四单链核酸与所述第三单链核酸互补，且通过杂交与所述第三单链核酸缔合，从而在所述聚合物颗粒表面呈递所述第二特异性结合对的所述第一结合成员，
其中所述第二特异性结合对的所述第一结合成员是与由所述细胞响应于所述第一特异性结合对的所述第一成员与由所述细胞表达的BTTS的结合而表达的CAR结合的抗原，
其中所述细胞是T细胞，并且其中所述CAR抗原与所述T细胞结合诱导T细胞增殖，且不会使细胞因子产量明显增加，
任选地，其中所述BTTS是嵌合Notch多肽。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述颗粒是直径范围为50nm-500nm的纳米颗粒。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述颗粒是直径范围为0.5μm-50μm的微米颗粒。
21.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一结合成员是与在所述细胞上表达的CAR结合的抗原，其中所述细胞是CAR-T细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗原选自由以下各项组成的群组：CD19、HER2、表皮生长因子受体(EGFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、CD20、CD38、CD30、CA125、MUC-1、***特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、MET、GPC3、CD70、EphA2、EpCAM、CLDN18、BCMA和CA9。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物核包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)并且所述聚合物包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)-聚乙二醇(PEG)嵌段聚合物(PLGA-嵌段-PEG)。
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