JP2023506381A - 細胞外小胞をプログラムするための組換えポリペプチド - Google Patents

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Abstract

細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え腫瘍選択性ウイルス粒子であって、前記組換えポリペプチドは、前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分；少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド；及び少なくとも１つの小胞内ポリペプチドを含む、腫瘍選択性ウイルス粒子が本明細書に提供される。ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルスに由来してもよい。特定分子を標的にするようにＥＶをプログラムするための組換えポリペプチドも提供される。例えばワクチン又は無細胞「ＣＡＲ－Ｔ」様適用におけるペイロードポリペプチド（及び／又はカーゴ分子）を標的細胞に送達するための治療用ＥＶについても、ＥＶ媒介性ＢｉＴＥ様適用における免疫細胞を標的細胞に動員するためのＥＶとともに記載される。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染させ、プログラムされたＥＶを投与することで、さらなる治療効果をもたらすように改変されてもよい。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１１月２８日に出願された「細胞外小胞をプログラムするための組換えポリペプチド」という表題の米国仮特許出願第６２／９４１，７６８号の優先権の利益を主張し、それは参照により本明細書で援用される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願、並びに添付文書は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に指示される場合と同程度まで、参照により本明細書中に援用される。
分野
本開示は、一般に分子の細胞への送達に関する。より詳細には、本開示は、分子の細胞への標的化送達に関する。
背景
生体系内部への治療用分子の標的化送達は、疾患治療の重要な構成要素である。しかし、分子の特定の細胞型への標的化送達は、不安定性、標的細胞に至る前のオフターゲット効果、他の状況下での分子の毒性に起因する課題及び他の課題が残る。
したがって、標的細胞のみを治療する安定な標的化治療用分子を提供することが望ましい。
概要
先行手法の少なくとも１つの不利益を除去又は軽減することが本開示の目的である。
第１の態様では、本開示は、腫瘍選択性のある組換えウイルス粒子であって、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドをコードする核酸を含み、前記組換えポリペプチドは、前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び少なくとも１つの小胞内ポリペプチドを含む、腫瘍選択性のある組換えウイルス粒子を提供する。
別の態様では、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドであって、前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び少なくとも１つの小胞内ポリペプチドを含む組換えポリペプチドが提供される。
一態様では、本明細書のとおりの組換えポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むベクターが提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含む組換えウイルスゲノムが提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むウイルス粒子が提供される。
一態様では、定義されるとおりの核酸、ベクター、組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子を含む宿主細胞が提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの組換えポリペプチドを含む標的化細胞外小胞（ＥＶ）が提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを；薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に含む組成物が提供される。
一態様では、標的化部分を標的細胞の標的分子に結合させる方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、ペイロード分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、カーゴ分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、ここで前記標的細胞は免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは抗原を含む、方法が提供される。
一態様では、標的細胞を殺傷する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、ここで前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは細胞傷害性分子を含む、方法が提供される。
一態様では、免疫細胞を再プログラムする方法であって、免疫細胞を、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含み、ここで少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロード分子は免疫調節分子を含む、方法が提供される。
一態様では、標的疾患細胞に対する免疫応答を導く方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、ここで前記組換えポリペプチドは、少なくとも２つの異なる標的分子に各々が特異的に結合する少なくとも２つの標的化部分を含み、前記少なくとも２つの異なる標的分子は各々、免疫細胞及び疾患細胞により発現される、方法が提供される。
一態様では、対象における治療標的化ＥＶを調製する方法であって、対象から得られた細胞を、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子と接触させることと、標的化ＥＶを収集することと、を含む方法が提供される。
一実施形態では、標的化ＥＶを作製する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸を細胞内で発現させるか、又は本明細書で定義されるとおりの宿主細胞を培養することでＥＶを作製することと；ＥＶを収集することと、を含む方法が提供される。
本開示の他の態様及び特徴は、貼付の図面と併せて、具体的な実施形態の以下の説明のレビュー時、当業者にとって明白となる。
本開示の実施形態は、ここではあくまで例として、貼付の図面を参照しながら説明されることになる。
本開示によって検討された異なる構築物の模式図を示す。 ＰＤ１標的化部分、ＬＡＭＰ２Ｂ膜貫通ドメイン及びＨＡタグ小胞内ポリペプチドが本発明に従う細胞外小胞内に包埋されたポリペプチドの模式図（パネルＡ）並びに全細胞ライセート及び単離された細胞外小胞中のワクシニアウイルスプラットフォームからのパネルＡに示されるポリペプチドの発現の成功を示す免疫ブロット（パネルＢ）を示す。 図２に示されるポリペプチド中のＰＤ１標的化部分の形態が正確である（外部指向的である）ことを示す免疫ブロットを示す。 パネルＡでは、パネルＢにおけるデータを得るために実施された競合的結合ＥＬＩＳＡ実験設計の模式図を示し、図２に示されるとおりのポリペプチド中のＰＤ１部分がそのＰＤＬ－１受容体にうまく結合することを示す。 パネルＡでは、パネルＢで表されるデータにおけるタイムラインを示し、図２の構築物が、ウイルスで発現されるとき、Ｔ細胞をうまく活性化することを示す。 パネルＡでは、２つの異なる細胞型（１つががん、１つが免疫性の殺傷細胞）を標的にするＥＶに包埋された二重特異性のテトラスパニンに基づく構築物を示す模式図を示し、パネルＢでは、腫瘍細胞がパネルＡの構築物でトランスフェクトされ、次に免疫細胞と組み合わされるとき、細胞死が増強されたことを示す明視野顕微鏡画像を示す。 細胞のトランスフェクション時の本発明に従う６つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時の本発明に従う５つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時の本発明に従う６つの異なる構築物の適切な発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時の本発明に従う４つの異なる構築物の適切な発現を示すウエスタンブロットを示す。 樹状細胞上のＤＥＣ２０５に標的化された４つの異なる構築物のウエスタン免疫ブロットを示し、ＣｄａＡペイロードを有する小さいＥＶ、又は標的化ＥＶがＤＥＣ２０５表面分子を有する樹状細胞内のＳＴＩＮＧ経路を活性化することを示す。 細胞表面上にＤＥＣ２０５を有しないマウス線維芽細胞が、ＣｄａＡペイロードを有するＤＥＣ２０５を標的にする図１１の構築物を有する小さいＥＶ、又は標的化ＥＶで処理されるときに活性化されたＳＴＩＮＧ経路を有しないことを示すウエスタン免疫ブロットを示す。 樹状細胞上のＤＥＣ２０５を標的にする本発明に従う３つの構築物を示すウエスタン免疫ブロットを示し、ＣｄａＡペイロードを有するエキソソーム、又は標的化ＥＶが樹状細胞内のＳＴＩＮＧ経路を活性化することを示す。 パネルＡでは、本発明に従う２つの構築物の適切な発現を示すウエスタンブロットを示し、パネルＢでは、樹状細胞を標的にする本発明に従う構築物の発現を示す免疫蛍光画像を示す。 ロタウイルス抗原ペイロードを有する樹状細胞を標的にする本発明に従う構築物の細胞発現を示す免疫蛍光画像を示す。 例えば構築物が腫瘍選択性ウイルスにより発現される場合における免疫毒素媒介性細胞死（アポトーシス）及び腫瘍退縮（ウイルス媒介性細胞死）のための細胞傷害性ペイロードを運搬する本発明に従うプログラムされた単一標的化(mono-targeting)細胞外小胞の作用機構を図示する模式図を示す。 ＶＳＶＧ膜貫通ドメイン及びｍＧＺＭＢペイロードとともに、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）を標的にする一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）標的化部分を有するキメラ融合構築物の模式図を示す。 ３つの異なる細胞型における、プラスミド又はウイルスから発現され、且つ単離された細胞外小胞、又は標的化ＥＶ内に豊富に存在する、本発明に従う２つの構築物の適切な発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞傷害性ペイロードを有する本発明に従うワクシニアウイルス(vaccinia virus)から発現された２つの構築物についての陰性対照に対して低下した細胞生存度を示す棒グラフを示す。 細胞表面上に標的表面分子を提示する細胞であって、これらの細胞表面分子を標的にし、本発明に従う細胞傷害性ペイロードを運搬する構築物がトランスフェクトされた細胞における細胞死の増強を示す明視野顕微鏡画像を示す。 本発明に従う細胞傷害性ペイロードを運搬する２つの構築物における、非トランスフェクト細胞、標的化部分が欠如した構築物及び細胞傷害性ペイロードが欠如した構築物と比較しての陰性対照に対して低下した細胞生存度を示す棒グラフを示す。 ２つの異なる細胞型における本発明に従う細胞傷害性ペイロードを運搬する２つの構築物についての陰性対照に対して低下した細胞生存度を示す棒グラフを示す。 上清移植についての方法を示す模式図を示す。 上清移植実験における細胞の明視野顕微鏡画像を示し、ＭＣ３８細胞を標的にする構築物を含有する上清（細胞外小胞画分）を受けるＭＣ３８細胞に限られる細胞死を示す。 上清移植実験における細胞の明視野顕微鏡画像を示し、本発明に従う構築物を発現するウイルスで感染させた細胞からの上清で処理されるときの、標的化細胞表面分子を提示する細胞に限られる細胞死を示す。 mCherryペイロードを有するｈＣＥＡを標的にする本発明に従う構築物の発現を示す上清移植実験における細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を示し、上パネルでは、構築物を発現するウイルスで感染させたＣＥＡ陰性細胞がその構築物を発現し、２つの下パネルでは、ＣＥＡ標的表面マーカーを有し、上清移植を受ける細胞のみがこの細胞表面分子を標的にする構築物を取り込むことを示す。 インビボ、インサイチュ又はインビトロで、本発明に従うプログラムされた細胞外小胞をプロデューサー細胞株から生成するための本発明の一態様の概要を提示する模式図を示す。 テトラスパニンに基づく膜貫通ドメインを有し、且つ細胞傷害性ペイロードを運搬する、本発明に従う５つの異なる構築物を図示する模式図を示す。 図２６に図示される５つの構築物の発現の成功を示すウエスタンブロットを示す。 図示された構築物の６つに対する１つのペイロード、及び７つの図示された構築物の１つに対する２つのペイロード及びフューリン切断部位とともに、ＣＤ１９及びＣＤ２０を標的にするＣＤ６３テトラスパニンに基づく膜貫通ドメインを有する、本発明に従う７つの異なる構築物を図示する模式図を示す。 ＣＴＸ標的化部分、ＶＳＶＧ膜貫通ドメイン及びNanoluc（商標）ペイロードを有する本発明に従う構築物が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたプラスミドから十分に発現されることを示すウエスタンブロットを示す。 上清移植実験における発光を示す棒グラフを示し、ここでは図２９Ａに示されるとおりの構築物を発現する細胞の上清中に限って蛍光が認められる。 ６つの異なるヒト神経膠芽腫細胞株に移された図２９Ｂの上清を示す棒グラフを示し、細胞における発光は、専ら適切な標的化部分を含む構築物における、処理された細胞の外側に提示された標的細胞表面マーカーの割合に対応する。 ワクシニアウイルス(vaccinia virus)（ＶａｃＶ）で感染させた７８６－Ｏがん細胞が非感染細胞よりも多くのＥＶを生成することを示すグラフを示す。 ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)で感染させたいくつかのがん細胞型が非感染細胞よりも多くのＥＶを生成することを示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分での本発明に従う４つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分での本発明に従う構築物の発現を示すウエスタンブロットを示す。 細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分での本発明に従う４つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示す。 ＲＮＡ結合モチーフに融合されたＬＤＬＲＴ（ＬＤＬＲ標的）－ＶＳＶ－を有するプラスミドが、Nanoluc（商標）(Nluc)に融合された青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードするｍＲＮＡをパッケージ化し、それをＬＤＬＲ標的について陽性のレシピエント細胞に送達し得ることを示す蛍光顕微鏡画像を示す。 レシピエント細胞におけるNanoluc（商標）活性が測定された、３５Ａと同じ実験の定量的読み出し。 線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）陽性の膵臓線維芽細胞（ＰａｎＦｉｂ）、膵がん細胞（ＢｘＰＣ３）、及びａＦＡＰ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢ ＥＶで処理された患者サンプル（Ｐ０２５、Ｐ０３２）の細胞生存度のグラフ表示を示す。 樹状細胞上のＤＥＣ２０５を標的にし、ＣｄａＡペイロードを有するａＤＥＣ２０５－ｍＣＤ６３－ＣｄａＡを発現するＰＥＶが、樹状細胞内のＳＴＩＮＧ経路を活性化する能力があることを示すウエスタン免疫ブロットを示す。 マクロファージ上のＭＡＲＣＯに標的化された３つの異なる構築物のウエスタン免疫ブロットを示し、ＣｄａＡペイロードを有する小さいＥＶ、又は標的化ＥＶが、細胞表面上にＭＡＣＲＯを発現する骨髄由来マクロファージ内のＳＴＩＮＧ経路を活性化することを示す。 抗ＭａｒｃＯに連結されたＣｄａＡ ＰＥＶ構築物の、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達経路の刺激における効力を実証するアッセイを示す。 αＣＤ３構築物を有するＥＶの存在下で、モック対照と比較して、マウス脾細胞によるＭＣ３８細胞の細胞死が増強されること（脾細胞：ＭＣ３８が１０：１）を実証するヒストグラムを示す。 ナイーブＥＶ、又はａＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＯＶＡ若しくはａＤＥＣ２０５－ＣＤ６３Ｄ－ＣｄａＡ－Ｆｌａｇ及びａＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＯＶＡの双方で装飾されたＥＶを用いるワクチン接種実験の結果の棒グラフを示し、両方の樹状細胞標的化抗原［例えば、オバルブミン（ＯＶＡ）］及び免疫アジュバント（例えばＣｄａＡ酵素）の組み合わせがインビボで免疫応答を誘導することを実証する。 インターフェロン応答を刺激することにより免疫アジュバントとして作用する樹状細胞由来のＰＥＶ構築物を示すアッセイを示す。
詳細な説明
一般に、本開示は、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え腫瘍選択性ウイルス粒子であって、前記組換えポリペプチドは、前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分；少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド；及び少なくとも１つの小胞内ポリペプチドを含む、組換え腫瘍選択性ウイルス粒子を提供する。ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルスに由来してもよい。さらに、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドであって、前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び少なくとも１つの小胞内ポリペプチドを含む組換えポリペプチドが提供される。
ＥＶプログラミング組換えポリペプチドを含むウイルス粒子
一態様では、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え腫瘍選択性ウイルス粒子であって、前記組換えポリペプチドは、
－前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、
－少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び
－少なくとも１つの小胞内ポリペプチド
を含む、ウイルス粒子が提供される。
一実施形態では、組換え腫瘍選択性ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルスに属する。
組換えポリペプチド
一態様では、細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドであって、
－前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、
－少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び
－少なくとも１つの小胞内ポリペプチド
を含む組換えポリペプチドが提供される。
「単一特異性」単一膜貫通（ＴＭ）ドメイン構築物
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチドは、前記少なくとも１つの標的化部分に連結されたＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドを含む。
一実施形態では、前記ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、ＬＡＭＰ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ８１、ＣＤ８２、又はＬＡＭＰ１からの膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、前記ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、フニンウイルス糖タンパク質、ラッサ熱ウイルス糖タンパク質、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質、タミアミウイルス糖タンパク質、グアナリトウイルス糖タンパク質、パラナウイルス糖タンパク質、マチュポウイルス糖タンパク質、サビアウイルス糖タンパク質、又はＣｄａＡからの膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、ラブドウイルス糖タンパク質からの膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、アレナウイルス糖タンパク質からの膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的細胞は、哺乳動物細胞を含む。
一実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞である。
一実施形態では、前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージである。一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一実施形態では、前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、細胞表面マーカー又は細胞表面受容体である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、
－健常対照細胞によってではなく、疾患細胞により発現される、又は
－前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
疾患特異的細胞表面分子を含む。
一実施形態では、前記疾患特異的細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＤＡＲＰｉｎを含む。
一実施形態では、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。
一実施形態では、前記抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰα外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、ＰＤ１を含む。
一実施形態では、前記小胞内ポリペプチドは、小胞内空間に突出するための短いアミノ酸尾部を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも９アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１１アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１２アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１３アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１４アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも１５アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、少なくとも９アミノ酸を含んでもよい。前記小胞内ポリペプチドは、９～１５アミノ酸を含んでもよい。
一実施形態では、前記小胞内ポリペプチドは、前記ＥＶアンカーポリペプチドを介して前記少なくとも１つの標的化部分に連結された少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドを含む。ＥＶペイロードポリペプチドは、例えば、治療用ポリペプチド、イメージング用のポリペプチド、診断用ポリペプチド、自殺タンパク質、又はバイオマーカー用の受容体を含んでもよい。
一実施形態では、少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを含む。
「単一特異性」テトラスパニン構築物
一実施形態では、前記ＥＶアンカーポリペプチド及び前記小胞内ポリペプチドは、それらの２つの膜貫通ドメイン間に挿入された前記少なくとも１つの標的化部分を含むＥＶ誘導性組換えテトラスパニンを一緒に含む。
一実施形態では、前記組換えテトラスパニンは、ヒトＣＤ６３又はＣＤ９を含むか又はそれに由来する。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的細胞は、哺乳動物細胞を含む。
一実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞である。
一実施形態では、前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージである。一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一実施形態では、前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、細胞表面マーカー又は細胞表面受容体である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、
－健常対照細胞によってではなく、疾患細胞により発現される、又は
－前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
疾患特異的細胞表面分子を含む。
一実施形態では、前記疾患特異的細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はＤＡＲＰｉｎを含む。
一実施形態では、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。
一実施形態では、前記抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰａ外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、ＰＤ１を含む。
一実施形態では、組換えポリペプチドは、前記組換えテトラスパニンのＮ末端及び／又はＣ末端に連結された少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドをさらに含む。ＥＶペイロードポリペプチドは、例えば、治療用ポリペプチド、イメージング用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、自殺タンパク質、又はバイオマーカーに対する受容体を含んでもよい。
一実施形態では、少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療ポリペプチドを含む。
「二重特異性」テトラスパニン構築物
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、少なくとも２つの標的化部分を含み、ここで前記ＥＶアンカーポリペプチド及び前記小胞内ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、１、２、３、及び４と付番された４つの膜貫通ドメインを含むＥＶ誘導性組換えテトラスパニンを一緒に含み、ここで前記２つの標的化部分の第１は、膜貫通ドメイン１及び２の間に挿入され、且つ前記２つの標的化部分の第２は、膜貫通ドメイン３及び４の間に挿入される。
一実施形態では、前記ＥＶ誘導性組換えテトラスパニンは、ヒトＣＤ６３又はＣＤ９に由来する。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的化部分は、少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する。
同じ標的細胞の標的化
一実施形態では、前記少なくとも２つの異なる標的分子は、同じ標的細胞によって発現される。
一実施形態では、前記標的細胞は、哺乳動物細胞を含む。
一実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含む。
一実施形態では、前記標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞を含む。
一実施形態では、前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージである。一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一実施形態では、前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的分子の各々は、細胞表面分子である。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的分子の各々は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的分子の各々は、
－健常対照細胞によってではなく、疾患細胞により発現される、又は
－前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
疾患特異的細胞表面分子を含む。
一実施形態では、前記疾患特異的細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的分子の各々は、独立して、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む。
一実施形態では、前記少なくとも２つの標的化部分の各々は、独立して、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＤＡＲＰｉｎを含む。
一実施形態では、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。
一実施形態では、前記抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰα外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、ＰＤ１を含む。
異なる標的細胞の標的化
一実施形態では、前記少なくとも２つの異なる標的分子は、異なる標的細胞によって発現される。
一実施形態では、前記異なる標的細胞は、疾患細胞及び免疫細胞を含み、ここで前記少なくとも２つの標的化部分は各々、疾患細胞表面分子及び免疫細胞表面分子に導かれる。
一実施形態では、前記異なる標的細胞は、腫瘍細胞及び免疫細胞を含み、ここで前記少なくとも２つの標的化部分は各々、腫瘍細胞表面分子及び免疫細胞表面分子に導かれる。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞であり、前記免疫細胞表面マーカーは、Ｔ細胞表面分子である。
一実施形態では、前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、前記免疫細胞表面マーカーは、ＮＫ細胞表面分子である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｂ細胞であり、前記免疫細胞表面マーカーは、Ｂ細胞表面分子である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージであり、前記免疫細胞表面マーカーは、マクロファージ細胞表面分子である。一実施形態では、前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、樹状細胞であり、前記免疫細胞表面マーカーは、樹状細胞表面分子である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、好中球であり、前記免疫細胞表面マーカーは、好中球細胞表面分子である。
一実施形態では、前記腫瘍細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記腫瘍細胞表面分子は、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰα、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体の１つを含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つの標的化部分は、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＤＡＲＰｉｎを含む。
一実施形態では、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。
一実施形態では、前記抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である。
一実施形態では、組換えポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドをさらに含む。ＥＶペイロードポリペプチドは、例えば、治療用ポリペプチド、イメージング用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、自殺タンパク質、又はバイオマーカーに対する受容体を含んでもよい。
一実施形態では、少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを含む。
一実施形態では、前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記組換えテトラスパニンの前記Ｎ末端及び／又はＣ末端に連結される。
ペイロード
これらのペイロードは、必要に応じて、本明細書に記載の実施形態に対して意図される。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドを放出するための切断部位を介して連結される。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを放出するための切断部位を介して連結される。
一実施形態では、前記切断部位は、自己切断ペプチド、ｐＨ依存性切断部位、又は酵素切断のための部位を含む。
一実施形態では、前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む。
一実施形態では、前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、細胞傷害性分子を含む。
一実施形態では、前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む。
一実施形態では、前記ペイロードポリペプチドは、免疫調節分子を含む。
一実施形態では、免疫調節分子は、免疫原性分子を生成する酵素を含む。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む。
一実施形態では、前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む。
一実施形態では、前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む。
一実施形態では、前記ペイロードポリペプチドは、酵素を含む。
一実施形態では、前記ペイロードポリペプチドは、核酸結合ドメインを含む。
一実施形態では、前記核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、核酸結合ドメインは、Ｃａｓ１３ファミリーメンバータンパク質からのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ａからのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ｂからのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ｄからのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、ＰｕｍからのＲＮＡ結合モチーフ（Ｐｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン１）を含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｓｔｕ１（Ｓｔａｕｆｅｎ－１）からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、アルファウイルスカプシドタンパク質Ｌ７２ＡＥからのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、核酸結合は、ＭＳ２コートタンパク質（本明細書中で「ＭＳ２」）からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、ＶＥＥＶカプシドタンパク質からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡ結合モチーフは、核酸リガンドシステムを含む。
一実施形態では、前記ペイロードポリペプチドは、抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、腫瘍関連抗原である。
一実施形態では、前記抗原は、病原体に由来する。
一実施形態では、前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む。
一実施形態では、前記アジュバントは、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む。
一実施形態では、前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む。
一実施形態では、前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドに連結される。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、切断部位により、前記少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドに連結される。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、少なくとも２つのＥＶ膜貫通ドメインにより、前記少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドから分離される。
核酸分子
一態様では、本明細書のとおりの組換えポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
一実施形態では、前記核酸は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、ＲＮＡは、表１２中の配列からの標的配列を含む。一実施形態では、組換えポリペプチドは、カーゴの標的配列に対応する表１２中の配列からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの、本明細書で定義されるとおりのＥＶペイロードを含む組換えポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの、本明細書で定義されるとおりのＥＶ治療用ペイロードを含む組換えポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
一実施形態では、前記核酸は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
ベクター
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むベクターが提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むベクターが提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
組換えウイルスゲノム
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含む組換えウイルスゲノムが提供される。
一実施形態では、ウイルスゲノムは、レンチウイルス(lentivirus)、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)のＴｉａｎ Ｔａｎ株、又はアデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)（ＡＡＶ）に由来する。
一実施形態では、ウイルスゲノムは、腫瘍選択的であるウイルスに由来する。
一実施形態では、前記ウイルスゲノムは、腫瘍溶解性ウイルスに由来する。
一実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含む組換えウイルスゲノムが提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
一実施形態では、ウイルスゲノムは、腫瘍選択的であるウイルスに由来する。
一実施形態では、前記ウイルスゲノムは、腫瘍溶解性ウイルスに由来する。
一実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である。
ウイルス粒子
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むウイルス粒子が提供される。
一実施形態では、前記ウイルス粒子は、レンチウイルス(lentivirus)、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)のＴｉａｎ Ｔａｎ株、又はアデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)（ＡＡＶ）に属する。
一実施形態では、前記ウイルス粒子は、腫瘍選択的ウイルスに属する。
一実施形態では、前記ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルスに属する。
一実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸を含むウイルス粒子が提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
一実施形態では、前記ウイルス粒子は、腫瘍選択的ウイルスに属する。
一実施形態では、前記ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルスに属する。
一実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である。
宿主細胞
一態様では、定義されるとおりの核酸、ベクター、組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子を含む宿主細胞が提供される。
一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞又は昆虫細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は好中球である。
一実施形態では、宿主細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記宿主細胞は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、核酸結合ドメインは、Ｃａｓ１３ファミリーメンバータンパク質からのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ａからのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ｂからのＲＮＡ結合モチーフを含む。一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｃａｓ１３ｄからのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｐｕｍ（Ｐｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン１）からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、Ｓｔｕ１（Ｓｔａｕｆｅｎ－１）からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、アルファウイルスカプシドタンパク質Ｌ７２ＡＥからのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、核酸結合は、ＭＳ２コートタンパク質（本明細書中で「ＭＳ２」）からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡ結合モチーフは、ＶＥＥＶカプシドタンパク質からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、組換えポリペプチドは、上記のＲＮＡ結合モチーフの１つを含み、ＥＶカーゴは、ＲＮＡ結合モチーフにおける同族ＲＮＡ標的配列を含む。ＲＮＡ結合モチーフ及び同族標的配列の例が表１２の配列に提示される。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
一態様では、定義されるとおりの核酸、ベクター、組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子を含む宿主細胞が提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞又は昆虫細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は好中球である。
一実施形態では、宿主細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記宿主細胞は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
標的化細胞外小胞（ＥＶ）
一態様では、本明細書で定義されるとおりの組換えポリペプチドを含む標的化細胞外小胞（ＥＶ）が提供される。
一実施形態では、標的化ＥＶは、別々のＥＶカーゴ分子をさらに含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、ＲＮＡは、表１２中の配列からの標的配列を含む。一実施形態では、組換えポリペプチドは、カーゴの標的配列に対応する表１２中の配列からのＲＮＡ結合モチーフを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ＡＰＩを含む。
一実施形態では、標的化ＥＶは、エキソソームである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、マイクロベシクルである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、エクトソームである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、アポトーシス小体である。
一実施形態では、標的化ＥＶは、ウイルス様粒子である。
一実施形態では、標的化ＥＶは、マクロベシクル(macrovesicle)である。
一実施形態では、標的化ＥＶは、オンコソームである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、ゲシクル(gesicles)である。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの組換えポリペプチドを含む標的化細胞外小胞（ＥＶ）が提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
一実施形態では、標的化ＥＶは、別々のＥＶカーゴ分子をさらに含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。
一実施形態では、前記核酸は、ＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。
一実施形態では、前記ＥＶカーゴ分子は、ＡＰＩを含む。
一実施形態では、標的化ＥＶは、エキソソームである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、マイクロベシクルである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、エクトソームである。
一実施形態では、標的化ＥＶは、アポトーシス小体である。
医薬組成物
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に含む組成物が提供される。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に含む組成物が提供され、ここで組換えポリペプチドは、ＥＶ治療用ペイロードを含む。
方法及び使用
標的への結合
一態様では、標的化部分を標的細胞の標的分子に結合させる方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、標的化部分を標的細胞の標的分子に結合させるための本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの使用が提供される。
一態様では、標的化部分の標的細胞の標的分子への結合における使用のための本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶが提供される。
ペイロードの送達
一態様では、ペイロード分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、ペイロード分子を標的細胞に送達するための本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの使用が提供される。
一態様では、ペイロード分子の標的細胞への送達における使用のための本明細書で定義されるとおりのＥＶが提供される。
カーゴの送達
一態様では、カーゴ分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法が提供される。
一態様では、カーゴ分子を標的細胞に送達するための本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの使用が提供される。
一態様では、カーゴ分子の標的細胞への送達における使用のための本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶが提供される。
免疫応答の刺激
一態様では、抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、ここで前記標的細胞は免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは抗原を含む、方法が提供される。
一実施形態では、前記抗原は、疾患細胞特異的抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、腫瘍特異抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、病原体に由来する。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの抗原に対する免疫応答を刺激するための使用であって、前記標的細胞は免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは抗原を含む、使用が提供される。
一実施形態では、前記抗原は、疾患細胞特異的抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、腫瘍特異抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、病原体に由来する。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む。
一態様では、抗原に対する免疫応答の刺激における使用のための、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶが提供され、ここで前記標的細胞は免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、疾患細胞特異的抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、腫瘍特異抗原を含む。
一実施形態では、前記抗原は、病原体に由来する。
一実施形態では、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む。
標的細胞の殺傷
一態様では、標的細胞を殺傷する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは細胞傷害性分子を含む、方法が提供される。
一実施形態では、前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む。
一実施形態では、前記標的細胞は、疾患細胞を含む。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞である。
一態様では、標的細胞を殺傷するための、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの使用であって、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは細胞傷害性分子を含む、使用が提供される。
一実施形態では、前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む。
一実施形態では、前記標的細胞は、疾患細胞を含む。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞である。
一態様では、標的細胞の殺傷における使用のための、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶが存在し、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは細胞傷害性分子を含む。
一実施形態では、前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む。
一実施形態では、前記標的細胞は、疾患細胞を含む。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞である。
免疫細胞の再プログラム
一態様では、免疫細胞を再プログラムする方法であって、免疫細胞を本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含み、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロード分子は免疫調節分子を含む、方法が提供される。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む。
一実施形態では、前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む。
一実施形態では、前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージを含む。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ経路活性化剤を含み、前記免疫細胞は、マクロファージを含み、且つ前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを有する免疫細胞の、免疫細胞を再プログラムするための使用であって、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロード分子は免疫調節分子を含む、使用が提供される。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む。
一実施形態では、前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む。
一実施形態では、前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージを含む。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ経路活性化剤を含み、前記免疫細胞は、マクロファージを含み、且つ前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
一態様では、免疫細胞の再プログラミングにおける使用のための、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを有する免疫細胞であって、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロード分子は免疫調節分子を含む、免疫細胞が提供される。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む。
一実施形態では、前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む。
一実施形態では、前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。一実施形態では、前記免疫細胞は、マクロファージを含む。
一実施形態では、前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ経路活性化剤を含み、前記免疫細胞は、マクロファージを含み、且つ前記少なくとも１つの標的分子は、マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）である。
標的に対する免疫応答の誘導
一態様では、標的疾患細胞に対する免疫応答を導く方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶを対象に投与することを含み、前記組換えポリペプチドは、各々が少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する少なくとも２つの標的化部分を含み、ここで前記少なくとも２つの異なる標的分子は各々、免疫細胞及び疾患細胞によって発現される、方法が提供される。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞を含む。
一実施形態では、前記少なくとも２つの異なる標的分子の一方は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である。
一態様では、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶの、標的疾患細胞に対する免疫応答を導くための使用であって、前記組換えポリペプチドは、各々が少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する少なくとも２つの標的化部分を含み、ここで前記少なくとも２つの異なる標的分子は各々、免疫細胞及び疾患細胞によって発現される、使用が提供される。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞を含む。
一実施形態では、前記少なくとも２つの異なる標的分子の一方は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である。
一態様では、標的疾患細胞に対する免疫応答の誘導における使用のための、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子、又は本明細書で定義されるとおりの標的化ＥＶが提供され、前記組換えポリペプチドは、各々が少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する少なくとも２つの標的化部分を含み、ここで前記少なくとも２つの異なる標的分子は各々、免疫細胞及び疾患細胞によって発現される。
一実施形態では、前記疾患細胞は、腫瘍細胞を含む。
一実施形態では、前記少なくとも２つの異なる標的分子の一方は、腫瘍関連抗原を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である。
治療標的化ＥＶの調製
一態様では、対象における治療標的化ＥＶを調製する方法であって、
－対象から得られた細胞を、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子と接触させることと、
－標的化ＥＶを回収することと、
を含む方法が提供される。
一実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞である。
一実施形態では、前記細胞は、免疫細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
一態様では、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子の、対象における治療標的化ＥＶを調製するための使用が提供される。
一実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞である。
一実施形態では、前記細胞は、免疫細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
一態様では、対象における治療標的化ＥＶの調製における使用のための、本明細書で定義されるとおりの核酸、本明細書で定義されるとおりのベクター、本明細書で定義されるとおりの組換えウイルスゲノム、又は本明細書で定義されるとおりのウイルス粒子が提供される。
一実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞である。
一実施形態では、前記細胞は、免疫細胞である。
一実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む。
作製方法
一実施形態では、標的化ＥＶを作製する方法であって、本明細書で定義されるとおりの核酸を細胞内で発現させる、又は本明細書で定義されるとおりの宿主細胞を培養することで、ＥＶを生成することと；ＥＶを回収することと、を含む方法が提供される。
定義及び実施形態
以下の定義は、本明細書で用いられる用語の理解を促進するため、提供される。
「腫瘍選択的」ウイルスは、腫瘍細胞内で優先的に増殖又は複製するウイルスを意味する。
「腫瘍溶解性ウイルス」は、活性があるとき、インビトロ又はインビボで腫瘍細胞を複製及び殺滅することが示されている多くのウイルスのいずれか１つを意味する。これらのウイルスは、天然には腫瘍溶解性ウイルス、又は腫瘍溶解活性をもたらし、若しくは改善するように修飾されているウイルスであってもよい。腫瘍溶解性ウイルスは、ラブドウイルス(Rhabdoviruses)を含む。ラブドウイルス(Rhabdoviruses)は、カラジャス(Carajas)ウイルス、チャンディプラ(Chandipura)ウイルス、コカル(Cocal)ウイルス、イスファハン(Isfahan)ウイルス、ピリー(Piry)ウイルス、水疱性口内炎アラゴアス(Alagoas)ウイルス、ＢｅＡｎ１５７５７５ウイルス(BeAn157575)、ボテケ(Boteke)ウイルス、カルチャキ(Calchaqui)ウイルス、ウナギウイルスアメリカン(EelvirusAmerican)、グレイロッジ(Gray Lodge)ウイルス、ユロナ(Jurona)ウイルス、クラマス(Klamath)ウイルス、クワッタ(Kwatta)ウイルス、ラ・ホージャ(La Joya)ウイルス、マルパイススプリング(Malpais Spring)ウイルス、マウントエルゴン(MountElgon)コウモリウイルス、ペリネト(Perinet)ウイルス、チュパイア(Tupaia)ウイルス、ファーミントン(Farmington)、バヒア・グランデ(Bahia Grande)ウイルス、ムイル・スプリングス(Muir Springs)ウイルス、リードランチ(Reed Ranch)ウイルス、ハートパーク(Hart Park)ウイルス、フランダース(Flanders)、カメセ(Kamese)ウイルス、モスケイロ(Mosqueiro)ウイルス、モスリル(Mossuril)ウイルス、バルー(Barur)ウイルス、フクオカ(Fukuoka)ウイルス、カーン峡谷(Kern Canyon)ウイルス、コルビッソン(Nkolbisson)ウイルス、ルダンテック(Le Dantec)ウイルス、キューラリバ(Keuraliba)ウイルス、コネチカット(Connecticut)ウイルス、ニューミント(New Minto)ウイルス、ソーグラス(Sawgrass)ウイルス、チャコ(Chaco)ウイルス、セナ・マドレイラ(SenaMadureira)ウイルス、ティンボ(Timbo)ウイルス、アルムピウォー(Almpiwar)ウイルス、アルアク(Aruac)ウイルス、バンゴラン(Bangoran)ウイルス、ビンボ(Bimbo)ウイルス、ビベンスアーム(Bivens Arm)ウイルス、ブルークラブ(Blue crab)ウイルス、チャールビル(Charleville)ウイルス、海岸平野(Coastal Plains)ウイルス、DakArK7292ウイルス、エントアメーバ(Entamoeba)ウイルス、ガルバ(Garba)ウイルス、ゴサス(Gossas)ウイルス、ハンプティドゥー(Humpty Doo)ウイルス、ジョインジャカカ(Joinjakaka)ウイルス、カンナマンガラム(Kannamangalam)ウイルス、コロンゴ(Kolongo)ウイルス、コールピンヤ(Koolpinyah)ウイルス、コトンコン(Kotonkon)ウイルス、ランジャ(Landjia)ウイルス、マニトバ(Manitoba)ウイルス、マルコ(Marco)ウイルス、ナソウル(Nasoule)ウイルス、ナバロ(Navarro)ウイルス、ガインガン(Ngaingan)ウイルス、オークベール(Oak-Vale)ウイルス、オボジャング(Obodhiang)ウイルス、オイタ(Oita)ウイルス、オウァンゴ(Ouango)ウイルス、パリークリーク(Parry Creek)ウイルス、リオグランデカワスズメ(RioGrandecichlid)ウイルス、サンジンバ(Sandjimba)ウイルス、シグマ(Sigma)ウイルス、スリプル(Sripur)ウイルス、スイートウォーターブランチ(Sweetwater Branch)ウイルス、チブロガルガン(Tibrogargan)ウイルス、キシブレマ(Xiburema)ウイルス、ヤタ(Yata)ウイルス、ロードアイランド(Rhode Island)、アデレードリバー(AdelaideRiver)ウイルス、ベリマー(Berrimah)ウイルス、キンバレー(Kimberley)ウイルス、マラバ(Maraba)ウイルス、ウシ流行熱(Bovine ephemeral fever)ウイルス、又はその改変された変異体を含む。
「細胞外小胞」（ＥＶ）は、エキソソーム、マイクロベシクル、ウイルス様粒子、マクロベシクル、オンコソーム、ゲシクル、及びアポトーシス小体を含む、細胞由来の膜状構造である。これらの細胞外小胞は、一般に、それらのサイズ、特定のマーカー、細胞起源及び生合成プロセスに基づいてカテゴリー化される。エキソソームは、多胞体（ＭＶＢ）膜の原形質膜との融合時、細胞から放出されるエンドソーム起源の３０～１６０ｎｍの小胞である。エキソソームは、あらゆる細胞型により生成され、それらの放出は、ストレス、低酸素、細胞死、及びウイルス感染を含む種々の刺激により誘導され得る。古典的なマイクロベシクル（微小粒子としても公知）は、原形質膜の脱落により細胞から放出される１００ｎｍ～１μｍの小胞である。がん細胞は、オンコソームと称されるより大きいマイクロベシクル（＞１μｍ）も分泌し得、専らそれらのサイズに関して古典的なマイクロベシクルと異なる。エキソソーム同様、マイクロベシクルの放出は、ストレス及びウイルス感染により誘導される可能性があり、それらの内容物は異質性である。アポトーシス小体は、小疱形成によりアポトーシス細胞から放出される大きいＥＶであり、サイズが２００ｎｍ～５μｍの範囲である。これらのホスファチジルセリン及びアネキシンＶでコーティングされたＥＶは、死細胞からの細胞質内容物を含有する。伝統的に、１００，０００ｇでペレット化したＥＶはエキソソームと称されたが、実際、このペレットは、マイクロベシクル及びエキソソームの組み合わせを含有する。それらの生合成経路は異なるが、エキソソームとマイクロベシクルは多くの類似性を有し、一旦細胞から放出されると、互いに識別することは困難である。近年、国際細胞外ベシクル会議(International Society for Extracellular Vesicles)は、小さいＥＶ（ｓＥＶ）という用語が、サイズが２００ｎｍ未満の粒子に使用されるべきである一方で、大きいＥＶ（ｌＥＶ）という用語が、２００ｎｍより大きい粒子に使用されるべきであることを提案した。
用語「プログラムされたＥＶ」（ＰＥＶ）及び「標的化ＥＶ」は、本明細書で定義されるとおり、組換えポリペプチドを含み、それ故、標的分子に対する（標的化部分によって提供される）改変され、獲得された親和性を有するＥＶを指すように本明細書で同義的に使用される。
「組換え」は、異なる起源のセグメントを有する核酸又はポリペプチド分子、例えば（限定はされないが）組換えＤＮＡ技術による遺伝子工学の産物を意味する。
「ＥＶアンカーポリペプチド」は、組換えポリペプチドをＥＶ膜に係留するポリペプチドを意味する。
「ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチド」は、ＥＶのリン脂質二重層膜の全体にわたり、且つＥＶ膜を生得的に標的にする（それに輸送される）膜貫通タンパク質の一部を意味する。
かかるＥＶ誘導性膜貫通ドメインを有するタンパク質は、ウイルス（例えばＶＳＶＧ）に由来し得る、又は細胞（例えばＣＤ６３及びＩａｍｐ２ｂ）に由来し得る。ドメインにわたる膜は、単一通過であってもよく、又は膜を複数回、例えば４回通過（４パス、又はテトラスパニン）してもよい。
単一通過及びテトラスパニンドメインは、単一又は複数のペイロードを保有するようにリンカー配列を介して改変可能であり、単一通過ドメインは、単一又は複数の標的化部分をタンデムに保有するように同様に改変され得る。
同様に、「ＥＶ誘導性テトラスパニン」は、ＥＶ膜に輸送されるテトラスパニンのサブセットを意味する。テトラスパニンは、全ての多細胞真核生物中に見出され、膜貫通４スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）タンパク質とも称される膜タンパク質のファミリーである。それらは、４つの膜貫通αヘリックス及び２つの細胞外ドメイン、１つの短い細胞外ドメイン又はループ、及び１つのより長い細胞外ドメイン／ループを有する。いくつかのタンパク質ファミリーが４つの膜貫通αヘリックスを有するが、テトラスパニンは、ＥＣ２ドメイン内に４つ以上のシステイン残基に加え、高度に保存された「ＣＣＧ」モチーフ内に２つのシステイン残基を含む保存的アミノ酸配列によって定義される。
テトラスパニンは、直接的には、最大で２つの標的化部分、及び最大で２つのペイロード、又は一緒に連結される場合にはより多くを保有するように改変され得る。
表１は、ＥＶ膜に特異的に導き、及びＥＶ膜内に豊富に存在するタンパク質の数例を提示する。これらの例は、単一通過及びテトラスパニンドメインを含む。
Figure 2023506381000002
Figure 2023506381000003
「～に由来する」は、組換えテトラスパニンとの関連で、天然テトラスパニンが、外因性配列、例えば細胞外ループの一方若しくは双方に挿入される標的化部分及び／又はテトラスパニンに連結されたペイロードを含むように修飾されることが理解されるであろう。
「標的化部分」は、標的分子を発現する標的細胞に対してＥＶを標的にすることができるような十分な親和性及び特異性で標的分子に結合する能力がある分子を意味する。標的化部分の非限定例として、抗体、その機能断片、その改変された断片、（受容体を標的にする）リガンド、（標的タンパク質に結合する）設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、及び特定のタンパク質－タンパク質相互作用を媒介するドメインが挙げられる。組換えポリペプチドの標的化部分が、ＥＶとの関連で、外部指向的であることが意図されることは理解されるであろう。
表２は、標的化部分の数例を示す。
Figure 2023506381000004
Figure 2023506381000005
Figure 2023506381000006
Figure 2023506381000007
Figure 2023506381000008
ナノボディとしても公知の「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。全抗体と同様、それは特異的抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２～１５ｋＤａである単一ドメイン抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる共通抗体よりもはるかに小さい。ｓｄＡＢは、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ若しくはサメの免疫により産生されるか、又は４つの鎖を有する共通ＩｇＧから設計可能である。
「機能断片」は、（相補性決定領域、即ちＣＤＲを含む）パラトープを維持し、且つその由来元である親抗体と同じ標的分子に結合する能力がある抗体の一部を意味する。例として、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。
「改変された断片」は、親抗体に由来し、且つパラトープを保持することから、親抗体と同じ標的分子に結合することができる組換えポリペプチドを意味する。一例が、典型的には１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
「ＤＡＲＰｉｎ」は、通常は３３アミノ酸のいくつかの反復構造ドメイン（一般に４～６リピート）を含むリピートタンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、それらの標的抗原に高い親和性及び特異性で結合し得ることから、特異的標的化における代替的なスキャフォールドとして選択及び使用され得る。モノクローナル抗体と比較してＤＡＲＰｉｎを使用する主な利点は、ＤＡＲＰｉｎが一般に低い分子量を有し、４０～１００の間のアミノ酸残基を有することである。例えば、ＨＥＲ２は、乳がん細胞内で頻繁に過剰発現される。ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合するＤＡＲＰｉｎは、ＨＥＲ２を発現する悪性細胞の方へ治療用ＥＶを導くため、選択及び使用され得る。
「標的分子」は、標的化部分が結合する対象の分子を意味する。かかる分子は、標的化部分により特異的に結合され得る細胞表面分子、例えば、ポリペプチド、脂質、又は多糖などであってもよい。
「標的細胞」は、標的化部分によって結合され、且つペイロード（適用可能な場合）及び／又はカーゴ（適用可能な場合）が導かれる対象の、標的分子を発現する細胞を意味する。
「小胞内ポリペプチド」は、内部的にＥＶに広がる組換えポリペプチドのポリペプチド部分を意味する。血管内ポリペプチドが小胞内空間に突出する（例えば少なくとも９アミノ酸の）短いポリペプチドを含んでもよいことは理解されるであろう。しかし、本明細書に記載の他の立体配置では、血管内ポリペプチドがＥＶペイロードポリペプチドを含んでもよいことは理解されるであろう。さらに他の立体配置では、ＥＶ誘導性膜貫通ドメイン及び血管内ポリペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に連結されてもよい、少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドを含んでも又は含まなくてもよい、ＥＶ誘導性組換えテトラスパニンを一緒に含んでもよい。
「単一標的化された」は、ＥＶの集団が標的分子に標的化されることを示す。しかし、「少なくとも１つ」の標的が特定される場合、これが２つ以上の標的分子に導かれたＥＶを包含し、それ故、ＥＶが最低でも単一標的化されることも意図されることは理解されるであろう。
同様に、「二重特異性」は、ＥＶが２つの標的分子を標的にすることを意味する。「少なくとも２つ」が特定される場合、これが３つ以上の標的分子に導かれたＥＶを包含し、ＥＶが最小に二重特異性であることも意図されることは理解されるであろう。
「細胞表面分子」は、細胞表面に固定される、又はそうでなければそれと会合させ、標的化部分を介する組換えポリペプチドによる細胞の標的化を可能にする任意の分子を意味する。かかる分子は、例えば、ポリペプチド、多糖、又は脂質を含んでもよい（ポリペプチドに対する多糖及び脂質修飾を含む）。例として、膜内在性タンパク質、表在性膜タンパク質、及びそれらの修飾が挙げられる。
「細胞表面マーカー」は、特定の細胞型に特有の（又は内部に豊富に存在する）細胞表面分子である。細胞表面マーカー又は細胞表面マーカーの組み合わせは、所与の細胞型、又は細胞状態（病態など）に特有であってもよい。
「腫瘍間質」は、例えばがん関連線維芽細胞など、がん細胞自身以外の腫瘍環境下の細胞を意味する。
「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞に関連し、且つ健常細胞又は（適用及び要求に応じた）対応する健常細胞に不在であるか又は大して豊富でない、任意の免疫原を意味する。例えば、腫瘍関連抗原は、生物との関連で、腫瘍細胞に特有であってもよい。ＴＡＡは、例えば、腫瘍特異的突然変異、異常にスプライスされたタンパク質、がん胎児抗原、又は内因性レトロウイルスタンパク質であってもよい。ＴＡＡは、ネオエピトープを含むネオ抗原であってもよい。ネオ抗原は、免疫系によって以前に認識されていない新規に形成された（非自家）抗原であり、例えば腫瘍突然変異から生じ得る。
用語「ペイロード」及び「カーゴ」は、ここでは区別して使用される。前者が組換えポリペプチドの一部である一方で、後者はＥＶ内で運搬されるべき別の分子であることが意図される。
「ＥＶペイロードポリペプチド」は、組換えポリペプチド自身の一部であり、それ故、同じ核酸分子により共コードされる、任意のポリペプチドを意味する。ＥＶペイロードポリペプチドは、ＥＶを負荷する又はＥＶ媒介性の標的化若しくは送達が望ましい場合の任意のポリペプチドを含む。
「ＥＶ治療用ペイロードポリペプチド」は、組換えポリペプチド自身の一部であり、それ故、同じ核酸分子により共コードされる、治療用ポリペプチドを意味する。ペイロードのカテゴリーは、（限定はされないが）細胞傷害性分子（例えば、ＧＺＭＢ変異体、ジフテリア毒素、ｐｅ３８（シュードモナス外毒素Ａからのドメイン）、又はＴＲＡＩＬ）、免疫リプログラミング分子（例えばＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤、例えば細菌シクラーゼ）、酵素、ヌクレオチド結合ドメイン、及び抗原（腫瘍抗原、又は感染性病原体、例えばデングウイルス(dengue virus)、マラリア(Malaria)、又はロタウイルス(Rotavirus)からの抗原など）を含む。非限定例が表３に提示される。
Figure 2023506381000009
Figure 2023506381000010
それに対し、「ＥＶカーゴ」は、ＥＶ内で運搬される対象であるが、それ以外のＥＶを標的に導く組換えポリペプチドと異なる分子を意味する。したがって、カーゴは、組換えポリペプチドをコードする同じ又は異なる核酸によってコードされてもよい（後者の場合、それらは別のポリペプチドとして発現されると理解されるであろう）。例えば、組換えポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞は、カーゴを別々にコードし得る（又は発現するように修飾され得る）と予想される（又はその逆もいえる）。カーゴ分子は、組換えポリペプチドに対して別々の分子であることで、ポリペプチドである必要がない。例えば、カーゴ分子の場合、小分子、例えば小分子薬又はイメージング剤であり得る。カーゴの場合、核酸、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡであり得る。例えばペイロードが核酸結合ドメインを含む実施形態では、核酸は優先的に小胞に負荷され得る。かかる結合ドメインは、核酸分子内部の配列モチーフに対して配列特異的な結合であってもよい。カーゴ分子は、ポリペプチド、例えば、細胞傷害性分子、免疫リプログラミング分子、酵素、又は抗原であっても含み得る。
用語「連結される」は、２つの部分が共有結合的に連結されることを示すが、かかる連結は直接的である必要がない。例えば、「Ａ」及び「Ｂ」が「連結される」場合、連結が追加的なアミノ酸残基又はポリペプチドを含み得ることは理解されるであろう。同様に、ある特徴、例えばリンカーポリペプチド又はペイロード「を介して」連結されるは、その特徴が組換えポリペプチドとの関連で「Ａ」及び「Ｂ」の間に位置する（そしてそれらを分離させる）ことを示す。しかし、「Ａ」と「Ｂ」のいずれでもないは、介在する特徴に直接的に結合される必要がある。
「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強し、及び／又はそれを所望される免疫応答に向けて調節する分子であると理解されるであろう。
核酸及びアミノ酸分子が本明細書中で参照される場合、その配列変異体を包含する実施形態についても明示的に検討されることは理解されるであろう。例えば、かかる配列変異体は、それらの由来元である親分子と実質的に同じ機能、又は同じ機能を保持するポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸分子）を意図してもよい。かかる配列変異体は、親分子に対して少なくとも７０％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも８０％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９０％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９５％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９６％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９７％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９８％同一であってよい。それらは、親分子に対して少なくとも９９％同一であってよい。本明細書で検討される配列変異体は、保存的アミノ酸置換（又はそれらをコードする核酸配列変化）を含んでもよい。本明細書で検討される配列変異体は、サイレント突然変異を含んでもよい。
実施例
以下の実施例は、本発明の実施形態及び／又は本発明に関して実施した試験を概説する。実施例は例示的であるが、本発明は、決して以下の例示的実施形態に限定されない。
実施例の紹介
高価であり、エクスビボであることが求められ、時間がかかる（例えばエレクトロポレーションを介する）可能性があり、且つ長期保存ができず、検証が不十分である、複数の分子、機構及び手段を用いて治療薬を運搬又は送達するため、ＥＶをプログラムする試みがなされている。
それ故、分子を細胞に、例えば限定はされないが、治療薬及び毒素をインビボで標的化細胞に送達するための手段が求められ、又はそれはインビボ、インビトロ、若しくはエクスビボで簡素、安価、安定な方法で簡素且つ継続的に調製される。
組換えペプチドは、分子の細胞への標的化送達を意図して設計している。
図１は、本明細書で検討された構築物の立体配置例の概要を提供する：
図１、パネル（ａ）－単一標的－ペイロードなし
図１、パネル（ｂ）－２つの標的－ペイロードなし
図１、パネル（ｃ）－２つの標的－ペイロードを有する
図１、パネル（ｄ）－単一標的－ペイロードを有する
図１、パネル（ｅ）－対照－標的なし、単一ペイロード
図１、パネル（ｆ）－対照－膜貫通ドメインなし
実施例１
単一標的化－ペイロードなし（２部分構築物）
適用：細胞表面受容体の機能を遮断又は活性化する。
これらのプラットフォームの作動様式：それらは競合的結合又は遮断薬として作用し得る。
利点：安定性及び免疫原性の欠如。ＰＥＶがウイルスプラットフォームから作製される場合、これはインサイチュ送達の可能性を有する。偶然にも、該手法はまた、これらの解決策のおかげで対費用効果がより優れている。
送達／作製様式：ウイルスに基づくプラットフォーム（例えば、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１など）。プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶ。
実施例１（ａ）：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）は、Ｔ，Ｂ，ＮＫ細胞、及び骨髄由来樹状細胞などの免疫細胞内で優先的に発現された表面タンパク質である。ＰＤ１は、そのリガンドＰＤ－Ｌ１との会合時、免疫阻害シグナルを伝達する。ＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１への結合によりＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１相互作用に拮抗する分子（モノクローナル抗体）は、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺傷を促進することが示されている。これらの方法がいくつかの臨床的適応において陽性結果を示している一方、これらの手法は、自らの最終目的地／使用（例えばＰＤ－Ｌ１を発現するエキソソーム）に至らせない消費された抗原を大量にもたらす傾向がある。これらの要素は、生物学的利用率を減少させ、抗ＰＤ１及び抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の毒性リスクを増加させる。
そのようにして、ＰＤ１をＰＤ－Ｌ１とともに標的化部分として標的にし、それによりその機能を遮断するＰＥＶについてここで検討する。標的化部分：（ＩＣＩにおける適用／アジュバントを遮断する）ＰＤ－Ｌ１。
ペイロード：不在又は任意選択的。
膜貫通ドメイン（ＴＤドメイン）：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
実施例１（ｂ）：同様に、Ｔ細胞は、ＣＤ３標的化部分、例えば抗ＣＤ３抗体を使用し、ＣＤ３表面タンパク質を介して活性化可能であった（Ｔ細胞活性化／エンゲージャーの適用）。
ペイロード：不在又は任意選択的。
膜貫通ドメイン（ＴＤドメイン）：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
Figure 2023506381000011
結果：ＰＤ１標的化についてのデータは、図２～５に見出すことができる。
図２：腫瘍溶解性ワクシニアウイルス(vaccinia virus)（ＶＶ又はＶａｃＶ）は、ＰＤ１の外部ドメインをコードする「キメラブロッキング構築物」によりＥＶをプログラム可能である。ＶＶ骨格を作出し、ＥＶがマウスＰＤ－１外部ドメイン（ｍＰＤ－１）をＥＶの表面上に提示させるようにプログラム可能にするＰＥＶ構築物を発現させた。ＰＤ－１を提示するこれらのＥＶは、マウス内でＰＤ－Ｌ１を表面上に発現する腫瘍細胞に特異的に結合し得る。
図２Ａ：「キメラブロッキング構築物」であって、それによりｍＰＤ－１はＰＥＶの細胞外表面上に提示され、標的化部分として作用する場合の模式図である。ｍＰＤ－１は、構築物のＰＥＶへの往復を援助する膜貫通ＬＡＭＰ２Ｂドメインに融合される。注目すべきは、ＬＡＭＰ２ｂは、一般にＥＶ内に豊富に存在する。この全ＰＥＶ構築物は、キメラ導入遺伝子構築物の細胞内部分上でＨＡ標識され、ＰＥＶの追跡及び可視化を可能にする。
図２Ｂ：ヒト腎細胞がん７８６－Ｏ細胞は、ＶＶ－Ｅｘｏ対照（この対照構築物は構築物のＣ末端上でＬＡＭＰ２Ｂ膜貫通ドメイン及びＨＡタグを発現するが、ＥＶ標的化部分はＦＬＡＧタグで置換された）、又はＶＶ－Ｅｘｏ－ＰＤ１でモック感染又は感染させた（パネル図２Ａに示すＰＥＶ構築物、１のＭＯＩ（感染多重度）で４８時間）。感染の４８時間後、免疫ブロット分析のため、細胞を収集し、溶解させた。同様に、細胞外小胞を連続遠心分離法により培地から単離した。次に、（適切なキメラ導入遺伝子発現を確認するため）ＥＶ画分及び全細胞ライセート（ＷＣＬ）のウエスタンブロット解析をｍＰＤ－１に対する抗体及びＨＡタグを用いて実施した。ＥＶ単離及びＶＶ感染の各々を適切に示すため、ＥＶマーカーＡｌｉｘ、及びＶＶ抗原Ａ２７Ｌについても試験した。
図３：図２Ａに示される構築物を発現するＰＥＶが抗ＰＤ１抗体を用いて単離可能であることを示し、免疫ブロットは、キメラタンパク質構築物がＥＶに組み込み、外部に標的化部分を有するＰＥＶを形成することを示す。抗ＰＤ１抗体に結合された分子は、Ａｌｉｘ及びフロチリン（ＥＶマーカー）を発現し、それらがＥＶに組み込まれることを示す。腫瘍溶解性ワクシニアウイルス(vaccinia virus)（ＶＶ）は、ＰＤ１をそれらの表面上に提示する「キメラブロッキング構築物」により感染細胞由来のＥＶをプログラムし得る。図２中の上記のキメラＰＥＶ構築物及びその対照を発現するＶＶプラットフォームを用いて、７８６がん細胞を１のＭＯＩで４８時間感染させ、次に細胞ライセート及びＥＶを単離した。この図面中の画像は、抗ＰＤ１抗体を用いるインタクトなＥＶの免疫沈降（ＩＰ）プルダウン後に収集したＥＶ画分の免疫ブロットを示す。生じているＷＣＬも示す。ＥＶ及びＷＣＬをモック又は感染細胞（１のＭＯＩで４８時間）から収集した。さらに、膜をＥＶマーカーＡｌｉｘ及びフロチリン１でプローブした。交差反応性に起因する抗体の重鎖の検出は、各条件における負荷対照として使用した。
ｍＰＤ－１－ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡタグ構築物を発現するＶＶに感染させた細胞に由来するＥＶのみが抗ＰＤ１抗体でプルダウンされたことは注目される。このデータは、該構築物がＥＶに発現され、組み込まれるだけでなく、ＥＶ内のＰＥＶ構築物の「形態又は配向性」が予想とおりであることを示す。
図４は、結合パートナーＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するＰＤ１を提示するように、ＶＶがＥＶを「ＰＥＶブロッキング構築物」でプログラム可能であることを示す。
図４Ａ：パネルＢに示されるデータを得るための実施した競合的結合ＥＬＩＳＡセットアップの模式図：ＳＡ－ストレプトアビジン；ＨＲＰ－西洋わさびペルオキシダーゼ。この実験セットアップでは、ビオチンにコンジュゲートされたｍＰＤ－Ｌ１タンパク質は、Ｅｘｏ－ＰＤ１構築物からのｍＰＤ－１に対照としてのＢ１４Ｒとともに結合し、定量化可能な蛍光シグナルをもたらし；それ故、（Ｅｘｏ－ＰＤ１キメラの不在に起因し）ｍＰＤ－１の発現を欠いているサンプルは、ｍＰＤ－Ｌ１に結合しないはずであり、蛍光シグナルをほとんど又は全くもたらさない。これは、図４Ｂに示されるデータを得るために使用された競合的結合の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）実験の模式図を示す。ここで細胞ライセートは、抗ｍＰＤ１抗体で覆われたウェルプレート全体にわたり洗浄される。したがって、ｍＰＤ１を提示する構築物は、プレートに結合することになる。プレートを洗浄することで、結合された構築物のみが残存し、次にそれらを、ビオチンと融合されたＰＤ１の天然結合リガンドｍＰＤ－Ｌ１とともにインキュベートする。このインキュベーション後、次に２－ＳＡ－ＨＲＰ（２はこれが二次抗体洗浄であることを表し、一次はＰＤ１である）はプレート全体にわたり洗浄され、それはビオチンと相互作用し、定量化可能な蛍光シグナルを生成する。そのようなことから、機能的ＰＤ－１を細胞ライセートＥＶの外部に提示するウェルプレートは、図４ｂに示すとおり、蛍光を示すはずである。
図４Ｂ：Ｅｘｏ－ＰＤ１キメラがｍＰＤ－Ｌ１に結合し得るか否かを実証するため、図２中の本明細書に記載のキメラＰＥＶ構築物及びその対照を発現するＶＶプラットフォームを使用した。マウス結腸直腸ＣＴ２６がん細胞を１０のＭＯＩで４８時間感染させ、次に細胞ライセートを調製した。細胞ライセートは、パネルＡに図示のとおりの適応させた競合的結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。この結合ＥＬＩＳＡにおいて、各条件におけるサンプルを最初にビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ＢＣＡ）分析にかけ、タンパク質濃度を決定した。この分析に基づき、既知の総入力タンパク質濃度を各条件に使用した。各ウイルス処置においては、ライセートを抗ｍＰＤ－１抗体とともにＥＬＩＳＡセットアップへの添加前の２時間プレインキュベートする場合の追加的な実験条件（陰性対照）を含め；これは（Ｅｘｏ－ＰＤ１キメラの）ｍＰＤ－１とｍＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するために実施し、観察された任意の蛍光がこの相互作用に起因することを確認した。各条件における陰性対照に対する吸光度読み取り値を、指定どおり、ＣＴ２６細胞ライセートサンプル中の総入力タンパク質の関数としてプロットした。細胞ライセートサンプルを抗ｍＰＤ－１抗体とともに２時間プレインキュベートする場合の追加的な条件を含めた。パネルＢに示す結果は、観察された最大蛍光シグナルがＶＶ－Ｅｘｏ－ＰＤ１条件に対応したことを示す。ＶＶ－Ｅｘｏ－ＰＤ１条件における蛍光シグナルが、ライセートを抗ｍＰＤ－１抗体（陰性対照）とともにプレインキュベートするときに失われることを認め；それ故、観察されたシグナルがｍＰＤ－１のｍＰＤ－Ｌ１への結合に起因することを確認することも重要である。これは、モック感染及びＶＶ対照ウイルス条件（抗ＰＤ－１抗体の存在下及び不在下）において、吸光度における差異がほとんど又は全く認められないという観察結果によりさらに確認される（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。この図面は、入力タンパク質の濃度による蛍光を示し、ＰＤ１を発現する（抗ＰＤ１の同時発現を伴わない）ワクシニアウイルス(Vaccinia Virus)がタンパク質の濃度増加に伴う蛍光増強を示すことが示される。
図５は、実験の時間経過におけるタイムラインの模式図、及びＰＤ－１を発現するＰＥＶがＴ細胞上のＰＤ－Ｌ１にうまく結合し、それによりこれらのＴ細胞内で様々なｍＲＮＡの免疫マーカーを活性化することを示すデータを提供する。
図５のパネルａ）：パネルＢに示されるＰＥＶ処理時、Ｔ細胞活性化のｑＰＣＲ分析における実験の時間経過セットアップの模式図。要するに、Ｔ細胞をマウス脾臓から単離し；次に細胞を抗ＣＤ３ｅ及び抗ＣＤ２８抗体による一晩活性化を施した。並行して、モック感染、ＶＶ－Ｅｘｏ対照ウイルスで感染、又はＶＶ－Ｅｘｏ－ＰＤ１ウイルス（図２に記載）で１０のＭＯＩで４８時間感染のいずれかのＣＴ２６細胞からＥＶを収集した。ＥＶを各条件における分画遠心により精製し、次に活性化Ｔ細胞に４８時間かけて移した。次に、ＲＮＡをＴ細胞から抽出し、ｑＰＣＲ分析にかけた。さらに、ＥＶを活性化Ｔ細胞に全く移さない場合（Ｔ細胞単独）の追加的な実験条件、並びにＴＧＦ－β ｍＲＮＡレベル（このマーカーは、ＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１阻害系によって改変されることが知られるサイトカインの１つでないことから非標的化対照として機能する）の分析を含めた。ＥＶを移す前、各条件におけるＥＶを正規化したことで、等しい濃度を各条件に使用したことを言及することは重要である。
図５のパネルＢ：Ｅｘｏ－ＰＤ１ ＥＶがマウスＴ細胞において様々な免疫マーカーをｍＲＮＡレベルで活性化できることを示すデータ。マウスＴ細胞から収集したｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析を、等しい濃度のＥＶによる処理後、実施した。ＥＶは、グラフに示すとおり、処理したＣＴ２６－ＷＴ細胞（モック感染細胞又は対照ＶＶウイルス若しくはＶＶ－ｅｘｏ－ＰＤ１で感染させた細胞）から収集した。この試験で使用した免疫Ｔ細胞活性化マーカーは、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１２である。ＴＧＦ－βは、非標的対照として含めた。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
実施例２
２部分構築物の多重標的化－（ＥＶ－ＢｉＫｅ及びＥＶ－ＢｉＴｅ）（ペイロードなし）
背景：天然には、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識し、殺傷するために必要である。しかし、大部分の腫瘍は、（ＭＨＣ）の発現を下方制御し、免疫攻撃を回避する。当該技術分野における腫瘍の回避機構を回避するための既存の一方法は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞を近傍に導くように改変された二重特異性抗体によるものである。これらの二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又はＢｉＴＥとも称される。
これらのＢｉＴＥは、Ｔ細胞の、腫瘍細胞をＭＨＣ非依存的様式で認識し、殺傷する能力を媒介することができる。ＢｉＴＥは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３及び特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な連結された可変鎖抗体断片からなる。同様に、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー又はＢｉＫＥは、ＮＫ細胞上の活性化受容体及び表面腫瘍抗原への同時結合を媒介することで、腫瘍細胞のＮＫ細胞依存性殺傷を促進し得る。既存のＢｉＫＥ及びＢｉＴＥ技術は有望であるが、現在臨床開発段階にある多くが、全身投与中の関連毒性を伴う課題、薬剤安定性の課題（短い半減期）、及び大部分の固形がんにおいて有効である程度に十分高い局所濃度に至らせるという課題を有する。
適用：２つの標的化部分：Ｔ（又はＮＫ）細胞標的を認識する一方、及び腫瘍細胞（がん細胞又はＣＡＦ）を標的にする他方、を有するＰＥＶ構築物。
これらプラットフォームの作動様式：これらのＰＥＶは、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間又はＮＫ細胞と腫瘍細胞との間の対合を促進することで、これらの免疫細胞型による腫瘍細胞の直接的殺傷を促進することになる。
利点：ＢｉＴＥ及びＢｉＫＥのＰＥＶ形式での提示は、二重特異性抗体構築物よりも安定である。
特別な特徴：一般に、ペイロードなしのＰＥＶ構築物自身は、Ｔ又はＮＫ細胞をがん細胞に接近させる、安定な二重特異性細胞エンゲージャーである。これらのＰＥＶは、インビボ又はエクスビボで生成され得る。
送達様式：患者における送達媒体としてＯＶを使用し、感染がん細胞においてＢｉＴＥ及びＢｉＫＥを分泌させる。そのようにして、ＰＥＶは、必要とされる正確な部位に送達され、ひいてはピコモル濃度、即ち現行の二重特異性抗体手法よりも低い用量の治療で有効である可能性が高い。ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)（ＶａｃＶ又はＶＶで略される）、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１などのウイルスに基づくプラットフォームが使用可能であった。
ウイルス及び感染細胞を調製するとともに、単離されたＰＥＶを作製するためのプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）についても検討する。
標的化部分：上記のとおりの一本鎖可変断片又はナノボディ。これらは、
－腫瘍細胞：表面腫瘍抗原標的（例えば、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＦＡＰなど）と、
－Ｔ細胞：Ｔ細胞に結合する分子（例えば、ＣＤ３標的、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ標的化部分を介する）、又は
－ＮＫ細胞：ＮＫ細胞受容体標的に結合する分子（例えば、抗ＣＤ１６又は抗ＮＫＧ２Ｄ）
のいずれかに結合する。
ペイロード：なし
膜貫通ドメイン：表１中に列記した全ての例が使用可能であった。ここで含めた例として、テトラスパニンタンパク質が挙げられるが、単一通過ＴＭタンパク質に「多量体化技術」を使用してもよい（詳細については特別な特徴を参照）。
Figure 2023506381000012
結果：
図６：がん細胞の表面におけるＣＥＡ及びＴ細胞の表面上のＣＤ３を標的にするＥＸＯ－ｂｉｔｅ ＰＥＶ構築物は、がん細胞死の増強をもたらす。ＥｘｏＢｉＴＥ構築物（即ち、がん細胞及びＴ細胞各々の表面上のＣＥＡＣＡＭ５及びＣＤ３を認識する抗体を提示する抗ＣＥＡ＋抗ＣＤ３－ＣＤ６３構築物であり、ＥＶにおけるＥｘｏ－ｂｉｔｅ構築物及びその形態を示す模式図を左パネルに示す）をＨＴ－２９細胞にトランスフェクトしたか又はトランスフェクトしなかった。次に、細胞をマウス脾細胞（１：３の比）と４８時間共インキュベートしたか又は共インキュベートしなかった。Ｅｘｏ－ｂｉｔｅ構築物をトランスフェクトし、次に脾細胞と共培養したＨＴ－２９細胞が細胞死の増強（約５０％）をもたらすことに注目されたい。大きく囲ったパネルを参照されたい。
図６の左パネルは、Ｔ細胞及びがん細胞を標的にするテトラスパニンに基づくキメラ構築物を伴うＰＥＶの一例の模式図を示す。図６の右パネルは、Ｔ細胞をがん細胞に導く二重特異性ＰＥＶを細胞にトランスフェクトするとき、細胞死が増強されることを示す。
実施例３
単一標的化－免疫アジュバントのペイロード
背景／状況：自然免疫プロセスの薬理学的刺激は、ウイルス複製の阻害、抗腫瘍免疫のブースト、及びワクチン免疫原性の増強などの複数の治療成績を達成するための興味深い方法を表す。本明細書に記載のプラットフォームは、感染症及びがんワクチンにより各々誘起される細胞性及び腫瘍性免疫応答を増強し、延長するための有効な手段を表すことがある。
適用：免疫アジュバント（例えば、免疫系を刺激する免疫原性分子を生成するＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ活性化剤）ペイロードは、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に、特定のＤＣ表面分子の標的化により特異的に送達され得る。
これらのプラットフォームの作動様式：抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばＤＣは、多くは未熟な又は免疫学的に寛容化する表現型（提示された抗原を受容する、又は免疫応答性を抑制するように作用するにはまだ機能的に準備ができていない）を示す。免疫アジュバント（即ち、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤、例えば細菌のジヌクレオチドシクラーゼ、例えば、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰシクラーゼであるＣｄａＡ及びＭｔｂＤｉｓａ、及びｃ－ｄｉ－ＧＭＰシクラーゼであるＶＣＡ０８４８、又はマウス／ヒトｃＧＡＳ）のＤＣへのＰＥＶを介した送達は、ＳＴＩＮＧ及び／又はＥＲＡｄＰの活性化をもたらし、ＤＣの抗原提示能を増強し、且つＴ細胞同時刺激分子の発現を増強し、それによりＡＰＣ活性をブーストすることがある。場合によっては、これらのプラットフォームは、ワクチン手法と併用することができる。
利点：安定性、オフターゲット毒性の低下、個別化された送達。
標的化部分：標的は、特定のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノボディ（即ち、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＣＤ１１ｃ、抗レクチン受容体）を含む標的化部分を通じた、限定はされないが、ＣＤ４０、ＴＮＦ－αファミリー受容体、ＤＥＣ－２０５、Ｃ型レクチン受容体及びインテグリン受容体ＣＤ１１ｃを含む抗原提示細胞表面分子である。ペプチド及びリガンドは、活性標的剤としての抗体に対する好適な代替物（例えば、ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０標的化ペプチド）を表す。
ペイロード：細菌のジヌクレオチドシクラーゼ（即ちＣｄａＡなど）（注：これらのペイロードは酵素であることから、これらの例は機能活性酵素もＰＥＶにより送達可能であることを示す）。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。これまで、我々の全ての例はＶＳＶ－Ｇ及びＣＤ６３で構築される。
送達／作製様式：ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１などのウイルスに基づくプラットフォームが使用可能であった。組換えウイルス及びトランスフェクト細胞を調製するためのプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）、並びに作製され、単離されたＰＥＶについても検討する。
Figure 2023506381000013
結果：
図７～１０は、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドから、及びＶＶからの細胞及びＥＶにおける構築物の発現を示すウエスタンブロットを提示する。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎）細胞が単にトランスフェクションの容易性から一例として選択され、いくつもの細胞型を代表するものであることに注目されたい。これらの図面が、下記のとおり、がんワクチンとして作用する構築物も表すことに注目されたい。
図７：細胞のトランスフェクション時、様々なキメラＰＥＶ構築物が適切に発現される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクトしないままか、又は抗ＤＥＣ２０５標的化部分及び異なるペイロード［ＣＤ６３の第２ループ内に挿入された］を有する指定のＣＤ６３プラスミド（全ての構築物はそれらのＣ末端においてＦｌａｇタグ化される）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞ライセートを収集し、指定抗体（抗Ｆｌａｇ、又は負荷対照としての抗βアクチン）に対して免疫ブロットし、プローブした。赤卵形は、所望されるバンドを示す。
図８：細胞のトランスフェクション時、様々なキメラＰＥＶ構築物を適切に発現させる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクトしないままか、又は抗ＤＥＣ２０５標的化部分及び異なるペイロード［ＣＤ６３の第１ループ内に挿入された］を有する指定のＣＤ６３プラスミド（全ての構築物はそれらのＣ末端においてＦｌａｇタグ化される）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞ライセートを収集し、指定抗体（抗Ｆｌａｇ、又は負荷対照としての抗βアクチン）に対して免疫ブロットした。赤卵形は、所望されるバンドを示す。
図９：細胞のトランスフェクション時、様々なキメラＰＥＶ構築物を適切に発現させる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクトしないままか、又は抗ＤＥＣ２０５標的化部分のＶＳＶ－Ｇ ＴＭドメイン、及び異なるペイロードを有する指定のｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（全ての構築物はそれらのＣ末端においてＦｌａｇタグ化される）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞ライセートを収集し、指定抗体（抗Ｆｌａｇ、又は負荷対照としての抗βアクチン）に対して免疫ブロットし、プローブした。赤卵形は、所望されるバンドを示す。
図１０：細胞のトランスフェクション時、様々なキメラＰＥＶ構築物を適切に発現させる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクトしないままか、又は抗ＤＥＣ２０５若しくは抗ＣＬＥＣ９Ａ標的化部分（ＶＳＶ－Ｇ）及び異なるペイロード（ＣｄａＡ又はmCherry）を有する指定のｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（外部ドメイン陰性及びＦｌａｇタグ化）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞ライセートを収集し、指定抗体（抗Ｆｌａｇ、又は負荷対照としての抗βアクチン）に対して免疫ブロットし、プローブした。赤卵形は、所望されるバンドを示す。
図１１～１３は、Ｄｅｃ２０５を標的にするキメラ構築物を有する単離されたＰＥＶが、ＶＳＶＧ膜貫通ドメイン及びＣｄａＡペイロード（ＳＴＩＮＧ及び／又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）とともに、樹状細胞内のＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰを用量依存的様式でうまく活性化する（図１１）が、非標的マウス線維芽細胞（図１２、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ及びＢ－ＤＮＡ陽性対照を有するＬ９２９細胞）内のＳＴＩＮＧを活性化しないことを示す、３つのパネルのウエスタン免疫ブロットを示す。このジヌクレオチドシクラーゼのＤＣへの送達は、ＴＢＫ１のリン酸化によって示されるとおり、ＳＴＩＮＧシグナル伝達系の活性化をもたらす（図１３）。これらの図面は、ＳＴＩＮＧリン酸化がＤＣ内で生じること（活性化）を示す。
抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＣｄａＡキメラ構築物を有する単離されたＰＥＶが、用量依存的様式でＳＴＩＮＧの活性化をもたらす。ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激物質）経路は、ＤＣを含む抗原提示細胞の活性化に寄与する。ＳＴＩＮＧの活性化は、そのリン酸化によって媒介される。ＤＣでは、ＳＴＩＮＧの活性化は、ＩＦＮ－βの発現及びＩＬ－１２の産生、並びに活性化マーカーＣＤ４０及びＣＤ８６の表面発現にとって重要である。ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の役割は、病原体の検出及びがん免疫において重要である。ＳＴＩＮＧの活性化、及びＥＲＡｄＰの活性化は、免疫細胞の腫瘍微小環境への動員において不可欠な構成要素であると思われ、それは腫瘍の免疫除去にとって最高である。ＳＴＩＮＧの活性化は、ワクチン接種中、同様にアジュバント機能をもたらす。
ここで示されるデータは、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＣｄａＡ構築物で装飾されたＥＶのみが、指定のＰＥＶ構築物及び対照をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミドがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離された指定量のＥＶによる２４時間処理後、一次マウス樹状細胞におけるＳＴＩＮＧ－ＴＢＫ１－ＩＲＦ３シグナル伝達系を活性化し得る（図１１）が、マウス線維芽細胞においては活性化し得えず（図１２）、それが細胞表面においてＤＥＣ２０５を発現しないが古典的なＳＴＩＮＧアゴニストｃ－ｄｉ－ＡＭＰ及びＢ－ＤＮＡに応答可能であることを示す。本明細書でのＳＴＩＮＧの活性化が、セリン３６５でリン酸化されたＳＴＩＮＧを認識する抗体を用いて実証されることに注目されたい。負荷対照は、全ＳＴＩＮＧ及びβアクチンを含む。図１３：指定されたとおり、ＶＳＶＧプラスミドがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離されたＥＶによる２４時間処理後の、一次マウスＤＣにおけるＳＴＩＮＧ－ＴＢＫ１－ＩＲＦ３シグナル伝達系の活性化。リン酸化によるＳＴＩＮＧ及びＴＢＫ１の活性化は、リン酸化部位特異的抗体を用いてウエスタンブロットにより実証する。さらに、ＳＴＩＮＧ及びＴＢＫ１の全レベルは、負荷対照として示す。ＳＴＩＮＧは、細胞質核酸、特に病原体及びウイルスに由来するｄｓＤＮＡ並びに内因性二次メッセンジャー、例えば環状ｄｉ－ＧＭＰ及び－ＡＭＰ）の検出に必要とされる決定的なシグナル伝達分子として同定されている。これらの事象は、ＴＢＫ１を含む細胞性キナーゼによるＩＲＦ３及びＮＦ－κＢ経路の活性化（リン酸化）を通じた自然免疫応答遺伝子の生成をもたらす。ＴＢＫ１の活性は、そのＳｅｒ１７２の自己リン酸化により調節される。パネルＣにおいて、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＣｄａＡ構築物を運搬するＰＥＶのみが、マウス樹状細胞において、ＳＴＩＮＧの活性化（リン酸化）をもたらすだけでなく、下流分子（ＴＢＫ１）のリン酸化（＝活性化）をもたらすことに注目されたい。
実施例４
単一標的化－がんワクチンペイロード
背景／状況：腫瘍関連抗原及び／又は免疫リプログラミング部分（例えば、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）は、ＡＰＣ、例えば樹状細胞上の表面分子にＰＥＶを介して特異的に送達され得る。この構築物であれば、ＰＥＶをＤＣ（樹状細胞）に標的にするための標的化部分を発現することになり、また１つ又は複数のペイロードを同時に運搬することができる。
適用：これらのプラットフォームは、頑強な腫瘍抗原特異的免疫を誘発するための有効な手段を表すことになる。
これらのプラットフォームの作動様式：ＤＣは、多くは未熟な又は寛容化する表現型を呈する。（ペイロード又はカーゴとしての）ＰＥＶを介する腫瘍抗原送達は、アジュバント（抗ＣＤ４０ｍＡｂアゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、又はＴｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストなどのＤＣ成熟刺激）の同時投与、又は上記のとおりのＳＴＩＮＧ若しくはＥＲＡｄＰ経路活性化剤（例えば細菌のジヌクレオチドシクラーゼ、例えば、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰシクラーゼであるＣｄａＡ及びＭｔｂＤｉｓａ、及びｃ－ｄｉ－ＧＭＰシクラーゼであるＶＣＡ０８４８）を有するＰＥＶの標的化共送達と併せて、腫瘍関連抗原の提示能の増強及びＴ細胞同時刺激分子の発現増強をもたらす。
単独の又はアジュバントと組み合わせた又は免疫リプログラミング部分（例えばＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）と組み合わせた腫瘍関連抗原は、ＰＥＶを介して樹状細胞上の表面分子に特異的に送達され得る。
標的化部分：標的：ＣＤ４０、ＴＮＦ－αファミリー受容体、ＤＥＣ２０５、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＥＣ９）及びインテグリン受容体ＣＤ１１ｃを含む抗原提示細胞表面分子は、特定のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノボディ（即ち、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＣＤ１１ｃ）、リガンド又は標的化ペプチド（例えば、ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０標的化ペプチド）を含む標的化部分により標的にされる。
ペイロード：特定の腫瘍関連抗原（マウス腫瘍モデルにおける概念実証用：ＤＣＴ及びＯＶＡが検討中である）。臨床試験にとって重要なヒト腫瘍関連抗原が使用可能である（例えば、ＨＰＶ－Ｅ６及びＥ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１など）。がん特異的ネオ抗原も使用可能である。
特定の疾患細胞抗原、例えば腫瘍関連／特異抗原（例えば、ＯＶＡ、ＤＣＴ、ｍＥＲＫｍ９など）の同時発現が検討される。さらに、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ活性化剤などのアジュバント分子であれば、疾患特異的抗原又は腫瘍関連／特異抗原と同時に送達することができる。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。これまで、我々の全ての例はＶＳＶ－Ｇで構築される。
送達／作製様式：ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１などのウイルスに基づくプラットフォームが使用可能であった。細胞をトランスフェクトするためのプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）、並びに作製され、単離されたＰＥＶについても検討する。
Figure 2023506381000014
結果：
図７～９は、トランスフェクション後のｐｃＤＮＡ３．１ベクタープラスミドからの細胞及びＥＶにおける構築物の発現を示すウエスタンブロットを提示する。
図１４：図１４のパネルＡは、樹状細胞を標的にするＰＥＶ（標的化部分－抗Ｄｅｃ２０５）とＶＳＶＧに基づく膜貫通ドメイン及びmCherry（対照）又はＯＶＡ（がん標的）の発現を示すウエスタンブロットである。図１４のパネルＢは、この構築物をコードするプラスミドのトランスフェクション時の、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＯＶＡの細胞発現を示す免疫蛍光画像である。これらの図面は、ＤＥＣ２０５を標的化し、オバルブミン（ＯＶＡ）抗原を運搬するキメラＰＥＶ構築物が細胞のトランスフェクション時に適切に発現されることを示す。
図１４のパネルＡ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＯＶＡ又は抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－mCherry対照構築物をコードする指定のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。両構築物がＮ末端においてＨＩＳタグ化されることに注目されたい。トランスフェクションから２４時間後、細胞ライセートを収集し、ＨＩＳタグ及び負荷対照ＧＡＰＤＨに対する特異的抗体による免疫ブロットのために調製した。
図１４のパネルＢ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＯＶＡ構築物をコードする指定のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。両構築物がＮ末端においてＨＩＳタグ化されることに注目されたい。トランスフェクションから２４時間後、細胞を固定し、抗ＨＩＳ抗体（緑色）による免疫蛍光染色のために調製した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。
実施例５
単一標的化－感染症ワクチンペイロード
背景／状況：病原体特異抗原及び／又は免疫リプログラミング部分（例えばＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）は、樹状細胞上の表面分子にＰＥＶを介して特異的に送達され得る。この構築物であれば、ＰＥＶをＤＣに調整するための標的化部分を発現することになり、また複数のペイロードを同時に運搬することができる。
適用：これらのプラットフォームは、頑強な病原体特異抗原駆動性免疫を誘発するための有効な手段を表すことになる。
これらのプラットフォームの作動様式：上と同様、ＤＣは、多くは未熟な表現型を呈する。ＰＥＶを介する病原体特異抗原送達は、アジュバント（抗ＣＤ４０ｍＡｂアゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、又はＴｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストなどのＤＣ成熟刺激）の同時投与、又はＳＴＩＮＧ若しくはＥＲＡｄＰ経路活性化剤（例えば、細菌のジヌクレオチドシクラーゼ、例えば、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰシクラーゼであるＣｄａＡ及びＭｔｂＤｉｓａ、及びｃ－ｄｉ－ＧＭＰシクラーゼであるＶＣＡ０８４８）を有するＰＥＶの標的化共送達と併せて、病原体特異抗原の提示能の増強及びＴ細胞同時刺激分子の発現増強をもたらす。
標的化部分：標的は、ＣＤ４０、ＴＮＦ－ｏファミリー受容体、ＤＥＣ－２０５、Ｃ型レクチン受容体及びインテグリン受容体ＣＤ１１ｃを含む抗原提示細胞表面分子を含み、特定のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノボディ（即ち、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＣＤ１１ｃ）、リガンド又は標的化ペプチド（例えば、ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０標的化ペプチド）などの標的化部分により標的にされる。
ペイロード：病原体特異抗原（例えば、デングＰＭ及びＥ抗原、マラリアＣＳ３０、ロタウイルスＶＰ６など）。ワクチン接種活性をブーストするため、特定の感染症関連抗原とＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ活性化剤などのアジュバント分子との同時発現について探究することができた。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。これまで、発明者の全ての例はＶＳＶ－Ｇで構築される。
送達／作製様式：ウイルスに基づくプラットフォーム（例えば、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶなど）。プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶ。
Figure 2023506381000015
結果：
図１５は、ロタウイルス抗原である、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＶＰ６の、この構築物をコードするプラスミドのトランスフェクション時の細胞発現を示す免疫蛍光画像である。細胞のトランスフェクション時、ＤＥＣ２０５を標的にし、ロタウイルス抗原（ＶＰ６）を保有するキメラＰＥＶ構築物が適切に発現される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＶＰ６構築物をコードする指定のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。２４時間後、細胞を固定し、抗ＨＩＳ抗体（緑色）による免疫蛍光染色のために調製した。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。両方の抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧ－ＶＰ６構築物がＮ末端においてＨＩＳタグ化されることに注目されたい。
実施例６
単一標的化－免疫リプログラミングペイロード
背景／状況：免疫リプログラミング分子（例えば、サイトカイン、ｍｉＲＮＡ）は、ペイロード又はカーゴとして特定の免疫細胞集団上の表面分子標的にＰＥＶを介して特異的に送達され得る。この構築物であれば、ＰＥＶを特定の免疫細胞集団に調整するための標的化部分を発現することになり、また複数のペイロードを同時に運搬することができる。
適用：これらのプラットフォームは、免疫細胞を再プログラム又は教育する（例えば、活性化する、その表現型を変化させるなど）ことで、特定の機能を果たし、ひいては炎症性疾患及びがんと戦うための有効な手段を表す。さらに、これらのＰＥＶであれば、がん細胞の免疫細胞に対する可視性（免疫原性）を増強する（例えば免疫原性細胞死を促進する）ため、使用することができる。
実施例６（ａ）：Ｍ１／Ｍ２の不均衡
これらのプラットフォームの作動様式：免疫抑制性Ｍ２マクロファージは、腫瘍細胞を貪食する準備ができた免疫ブーストＭ１マクロファージに変化することになる。さらに、マクロファージの特定のサブセットは、喘息、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、変形性関節症、子宮内膜症、１型及び２型糖尿病、及び肥満などの炎症性疾患を引き起こすのに重要である。マクロファージのリプログラミングは、ＰＥＶにより行うことができる。
標的化部分：一本鎖可変断片又はＣＤ２０６（マンノース受容体）に対する結合ペプチドは、Ｍ２マクロファージ（腫瘍促進性マクロファージとしても公知）を特異的に標的にするため、使用可能である。
ペイロード：カーゴを伴うペイロードなし、又はマクロファージ分極化を修飾するカーゴを特異的に捕捉し、ＲＮＡｉを通じて炎症性遺伝子発現を低減するためのＲＮＡ結合モチーフであるペイロードのいずれかは、複数の遺伝子として、同時に下方制御され得る。カーゴ標的は、炎症性メディエーター、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５）、及び炎症を促進することに関与する形質導入標的、例えばＮＦ－κＢシグナル伝達カスケードのメンバーを含んでもよい。ＩκＢα、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ４（Ｍａｐ４ｋ４）に特異的なｓｉＲＮＡを標的にするｍｉＲＮＡカセットは、マクロファージ中のＴｎｆ－α ｍＲＮＡを低減することにより、全身性炎症を低下させた。
実施例６（ｂ）：Ｔｒｅｑのリプログラミング：
これらのプラットフォームの作動様式：制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、エフェクターＴ細胞の機能を制限することが知られている。がんとの関連で、Ｔｒｅｇは、抗腫瘍免疫の強力な阻害剤であり、腫瘍微小環境におけるこれらの細胞の存在は、腫瘍増殖をもたらす。ＰＥＶによるＴｒｅｇにおける調節分子の直接標的化は、これらの細胞のＩＦＮｇ分泌エフェクター細胞（抗がん細胞）への変換をもたらすことになる。
標的化部分：免疫抑制性Ｔ細胞の表面上のＣＴＬ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）に特異的な一本鎖可変断片。
ペイロード：カーゴを伴うペイロードなし、又はＣＡＲＭＡ１及び／又はＭＡＬＴ１を下方制御することにより免疫抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を抗がんＴ細胞に変換するカーゴを特異的に捕捉するためのＲＮＡ結合モチーフであるペイロードのいずれか。例えば、ＣＡＲＭＡ１及び／又はＭＡＬＴ１に対するｓｈＲＮＡを有するｍｉＲＮＡカセット。Ｔ細胞活性化。これらのｍｉＲＮＡカセットは、ペイロードのＲＮＡ結合モチーフ認識部位に対応するＲＮＡ配列の存在下又は不在下のＥＶ誘導性ｍｉＲＮＡカセットであってもよい。或いは、これらのｍｉＲＮＡカセットは、ペイロードのＲＮＡ結合モチーフ認識部位に対応するＲＮＡ配列を含む、規則的な非ＥＶ誘導性カセットであってもよい。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
送達／作製様式：ウイルスに基づくプラットフォーム（例えば、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶなど）。プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶ。
実施例６（ｃ）：Ｔ細胞活性化
これらのプラットフォームの作動様式：Ｔ細胞機能の低下が、慢性ウイルス、細菌及び寄生虫感染並びにがんにおいて記載がなされている。免疫系における抗疾患Ｔ細胞の活性を刺激するため、ＣＤ３標的化ＰＥＶが使用可能である。
標的化部分：Ｔ細胞活性化：Ｔ細胞上のＣＤ３を標的にする一本鎖可変断片又は単一ドメイン抗体。
ペイロード：ＣＤ３標的化構築物は、ペイロードなしである。Ｔ細胞におけるＣＤ３との会合は、それらを活性化し、それらを動員し、がん細胞を殺傷するために十分な場合がある。抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ホスファチジルイノシトール経路、ＰＫＣの活性化、及び細胞内カルシウム（Ｃａｉ２＋）の増加を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じたＴリンパ球の活性化をもたらすシグナルを開始させる。
実施例７
単一標的化及び多重標的化－ＥＶ－ＣＡＲ様、細胞傷害性ペイロードによる
背景／状況：これらは（ＣＡＲ－Ｔ療法に類似するが、それからＴ細胞を除く）標的化細胞傷害性Ｔ細胞のように機能するＥＶを提供する。これは、我々のＰＥＶにより、高度に免疫抑制性の、免疫学的に「冷たい」腫瘍及びＭＨＣ－Ｉ欠損がんの殺傷を可能にする。
適用：以下の例に記載のとおり、特定の腫瘍細胞型を標的にする薬剤として使用される、細胞傷害性機能を有するＰＥＶ。他の細胞型を検討可能であった。
これらのプラットフォームの作動様式：図１６は、ウイルスに基づくプラットフォームによる細胞傷害性ペイロードを運搬する単一標的化ＥＶの提起された作用機構を表す。ここでワクシニアウイルス(vaccinia virus)を単一標的化部分で表す一方で、これは、プラスミド発現（即ちｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶを通じて、他のウイルス（レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)など）などの他の送達／作製様式に拡張することができる。要するに、改変されたワクシニアウイルス(vaccinia virus)であれば、がん細胞に感染することになる。感染細胞において、ウイルスゲノムは、転写及び翻訳により、さらなるウイルス子孫を創出し、それらは放出されて隣接する腫瘍細胞に感染し、腫瘍退縮又はウイルス媒介性細胞死をもたらすことになる。並行して、ウイルスゲノムにコードされている導入遺伝子であれば、さらに感染細胞により翻訳されることになる。この導入遺伝子は、細胞傷害性ペイロード（緑色）を運搬することになる膜貫通リンカードメイン（灰色）に融合された標的化部分（紫色）からなる。膜貫通ドメイン、即ちＶＳＶＧは、構築物をＰＥＶに優先的に往復させることで、標的化ドメインはＰＥＶの細胞外表面上に存在する一方で、ペイロードは細胞内に隔離される。次に、これらのＰＥＶは、感染細胞により分泌される。次に、ＰＥＶは、細胞外標的化部分を通じて、隣接するがん細胞上の標的抗原に結合し、これらのＰＥＶの取り込み、及びそれらの細胞傷害性ペイロードのレシピエント細胞への放出をもたらし、抗原陽性標的細胞の死滅をもたらす。
利点：非自家、安定、特異的標的化、ウイルス性送達が可能又は長期保存可能に作製可能。
標的化部分：一本鎖可変断片又は単一ドメイン抗体（即ち、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＥＧＦＲ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９）であるか又は標的化ペプチド［即ち、ＭＭＰ２標的化クロロトキシン（ＣＴＸ）、プロテオグリカン標的化ＶＡＲ２Δ（ＶＡＲ２ΔはＶＡＲ２ＣＳＡとも称され、胎盤において排他的に発現され且つ高い割合でがん細胞上でも見出される、異なるタイプのコンドロイチン硫酸（ＣＳ）に結合する）、高親和性にＥＧＦＲを標的にするＧＥ１１ペプチド］を介するもの。
ペイロード：マウスグランザイムＢ（ｍＧＺＭＢ）、ヒトグランザイムＢ（ｈＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ）（Ｒ２０１Ｋ突然変異が内因性ヒトグランザイムＢ阻害剤に対する耐性を付与するためであることに注目されたい）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ＴＲＡＩＬ（主に腫瘍細胞における細胞死を引き起こすサイトカイン）、及び切断されたシュードモナス外毒素３８（ＰＥ３８）などの細胞傷害性ペイロード。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
送達／作製様式：ウイルスに基づくプラットフォーム（例えば、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶなど）。プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶ。
Figure 2023506381000016
Figure 2023506381000017
Figure 2023506381000018
Figure 2023506381000019
結果：
図１７は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）又は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）を標的にする一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）標的化部分を、ＶＳＶＧ膜貫通ドメイン及びｍＧＺＭＢペイロードとともに有するキメラ融合構築物の模式図を示す。紫色、重鎖及び軽鎖からなる一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は単一ドメイン抗体、又はナノボディ又は他の標的化様式による構築物の標的化ドメイン；灰色、単一通過膜貫通リンカードメイン（ＶＳＶ－Ｇ）；緑色、グランザイムＢペイロード。標的化部分が、ｓｃＦｖ以外のペプチド、単一ドメイン抗体又はナノボディ、例えば、ＭＭＰ２標的化クロロトキシン、若しくはプロテオグリカン標的化ＶＡＲ２Δからも構成され得ることに注目されたい。Ｈｉｓ及びＦｌａｇは、キメラ構築物の発現を可視化及び追跡するためのタグの機能を果たす。
図１８は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション時のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドから、ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞のウイルス感染から、さらにはウイルス感染７８６－Ｏヒト腎臓細胞腺がん細胞から単離された小さいＥＶにおける、図１７に示される構築物の発現が成功したものを示す免疫ブロットを示す。これらの実験で使用した陰性対照は、キメラ構築物配列の場所において発現されたｅＧＦＰである。これは、トランスフェクト細胞及び感染細胞各々におけるプラスミドによる及びウイルスによるＰＥＶの発現の成功、並びにそれらがトランスフェクト細胞及び感染細胞に由来するＥＶにおける包埋の成功を示す。全てのブロットが抗グランザイムＢ抗体でプローブされた。ブロットは、次における抗ＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢ及び抗ＣＡ９－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢの発現を示す。
左ブロット－構築物をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミドがトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞
中間ブロット－これらの構築物をコードするワクシニアウイルス(vaccinia virus)（ＶＡＣＶ）に感染したＵ２ＯＳヒト骨肉腫細胞
右ブロット－ウイルスに感染した７８６－Ｏヒト腎細胞腺がん細胞から単離された小さい細胞外小胞（ｓＥＶ）
予想どおり、グランザイムＢタンパク質を全く発現しないＶＡＣＶ－ｅＧＦＰで感染させた細胞においてシグナルは得られない。
これらのブロットは、プラスミドによって発現されたキメラグランザイムＢ融合構築物であるだけでなく、膜貫通ＶＳＶＧリンカーを通じたｓＥＶにおける選別及びパッケージ化の成功も示す。
図１９Ａ、図１９Ｂ、及び図１９Ｃは、図１７及び図１８のＰＥＶを発現するワクシニアウイルス(vaccinia virus)によってウイルス感染されたＣＥＡ又はＣＡ９を提示するがん細胞が、レシピエント細胞上のＣＥＡ又はＣＡ９を各々標的にするＰＥＶによって運搬される細胞傷害性ペイロードによって媒介される細胞死を増強していることを示す。
図１９Ａ：表面上に高レベルのＣＥＡ及びＣＡ９を発現することが知られるヒト結腸がん細胞株（ＨＴ－２９）における、細胞傷害性グランザイムＢペイロードを運搬するヒトＣＥＡ又はＣＡ９のいずれかに由来する単一標的化ＰＥＶをコードするワクシニアウイルス(vaccinia virus)の細胞傷害性。要するに、ＨＴ－２９細胞を０．１のＭＯＩで個別のウイルスに感染させた。感染の４８時間後、細胞生存度をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）生存度アッセイにより評価した（ｎ＝４の生物学的複製）。ｅＧＦＰ対照ウイルスが細胞死を確かに誘導した一方で、この細胞株では、ＣＥＡ標的化及びＣＡ９標的化ウイルスによる感染後、細胞死の程度がさらに大幅に大きかった。これは、ＨＴ－２９がＣＥＡ及びＣＡ９抗原双方を細胞表面レベルで発現するという事実を仮定すれば、想定どおりであった。
図１９Ｂ：ｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢトランスフェクトＨＣＴ１１６細胞は、トランスフェクション時、上清中にＰＥＶを生成するが、ＥＶの取り込みに必要とされるＣＥＡＣＡＭ５を発現しないことから死滅しない。それに対し、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するトランスフェクトＨＴ－２９細胞は、トランスフェクション時、上清中にＥＶを生成するが、細胞の過半数（約６０％）がＧＺＭＢを含有するＥＶを取り込むことから死滅する。
図１９Ｃ：指定の細胞株のプラスミドトランスフェクション時に生成されるｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢ及びＣＡ９－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢを有するＰＥＶを取り込むことから死滅する、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＣＡ９を過剰発現する細胞の細胞生存度の定量化。細胞は、ｍＧＺＭＢ又は標的化対象の抗体を欠いているＰＥＶ対照への曝露時、死滅しない。
図２０は、２つのがん細胞株が、ＶＡＲ２Δを提示し、ｍＧＺＭＢを運搬するＰＥＶへの曝露時、細胞死の増強を示すことを示す。細胞にＶＡＲ２－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢキメラ構築物を発現するプラスミドをトランスフェクトした。プラスミドトランスフェクション時に生成される、ＶＡＲ２－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢを有するＰＥＶを取り込むことから死滅するＨＴ－２９（ヒト結腸直腸がん細胞株）及びＢｘＰＣ３細胞（ヒト膵がん細胞株）の細胞生存度の定量化。
図２１は、上清移植のための方法を示す模式図である（データ及び結果については図６を参照）。要するに、０日目、７８６－Ｏ細胞を翌日に集密度に達するように播種する。次に、（１）ＶＡＣＶ－ｅＧＦＰ、（２）ＶＡＣＶ αＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢ、又は（３）ＶＡＣＶ αＣＡ９－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢに細胞をＭＯＩ＝０．１で感染させる。これらの細胞は、ＥＶのためのプロデューサー細胞株と考えられる。次に、感染の２時間後、細胞上の培地をＤＭＥＭ＋１０％エキソソーム枯渇ＦＢＳと交換する。次に、プレートを３７℃＋５％ＣＯ２で４８時間（その時点でウイルスの複製及びキメラグランザイムＢ構築物の生成及びＥＶにおけるそれらの後のパッケージ化及び分泌を可能にする）インキュベートする。４８時間後、上清を収集し、４℃、２０００×ｇで２０分間遠心沈殿し、細胞片及び死細胞を除去する。次に、上清を０．２μｍのフィルターを通過させ、サイズ排除によりワクシニアウイルス(vaccinia virus)を除去することで、濾過された上清がウイルスを含まず、ＥＶのみを含有する。次に、上清をレシピエント細胞株に移す。
図２２は、２つのＰＥＶ構築物（ＶＳＶＧ膜貫通ドメインとともに抗ＣＥＡ－ｍＧＺＭＢを発現するワクシニアウイルス(vaccinia virus)、及びＶＳＶＧ膜貫通ドメインとともに抗ＣＡ９－ｍＧＺＭＢを発現するワクシニアウイルス(vaccinia virus)）における上記のとおりの上清移植実験の結果を示す。対照は、非感染細胞及びｅＧＦＰを発現するワクシニアウイルス(vaccinia virus)である。それは図２１に記載の方法に従う。全てのＰＥＶ構築物がｅＧＦＰを発現する。対照は３つである（非感染、ｅＧＦＰのみ及び抗ＣＡ９構築物）。観察可能な細胞死を伴うＭＣ３８－ＣＥＡ細胞（ヒトＣＥＡを発現するように遺伝子改変されたマウス結腸直腸がん細胞株）のみは、ｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢ ＰＥＶ（３番目のパネル）を含有する上清を受けたものであり、それはモックを受けた対照ＭＣ３８細胞（非感染及びｅＧＦＰのみ）である左２つのパネル、及びＣＡ９標的化ＰＥＶ（左から４番目のパネルで、ＭＣ３８－ＣＥＡがヒトＣＡ９を発現しないことに注目されたい）と比較される。緑色のチャネルは、濾過ステップ中に通過する感染性ウイルス粒子がなく（ｅＧＦＰは全てのベクターから発現）、且つ観察可能な結果が上清移植単独の結果であることを実証するために示される。第４のパネルは、標的細胞（ＭＣ３８－ＣＥＡ）が表面上で発現されたＣＡ９を有しないことから、ＣＡ９を標的にするＰＥＶが効果を有しないことをさらに実証する。
図２３は、抗ＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢプラスミドがトランスフェクトされた７８６－Ｏ細胞からの上清、又は陰性対照としての非トランスフェクト７８６－Ｏ細胞からの上清を用いる別の上清移植実験を示す。上清は、野生型（ＣＥＡ陰性）である、又はＣＥＡを発現したＭＣ３８細胞、及びＣＥＡを発現するＨＴ－２９細胞に移す。７８６－Ｏ細胞は、ＰＥＶプロデューサー細胞株として使用し、ｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢプラスミドをトランスフェクトする。２４時間後、上清（即ちＰＥＶを含有する）を、標的抗原、この場合はｈＣＥＡを発現する細胞株又は発現しない細胞株のいずれかに移す。ＭＣ３８ ＷＴ細胞は、ＣＥＡ陰性であり、非トランスフェクト７８６－Ｏ細胞からのモック上清を受けた後とｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢプラスミドをトランスフェクトした７８６－Ｏ細胞からの上清を受けた後とで有意差を示さなかった。ＭＣ３８－ｈＣＥＡ及びＨＴ－２９細胞の双方は、ＣＥＡ陽性細胞株であり、ｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢをトランスフェクトした７８６－Ｏからの上清を受けたとき、モック上清と比較して有意な細胞死を示し、これは標的細胞に対する（上清中の）ＰＥＶにおける標的化部分の特異性を示唆した。
図２４は、ＣＥＡ陰性又はＣＥＡ陽性のいずれかである細胞上のＣＥＡを標的にするＰＥＶにおけるペイロードとしてmCherryを用いる上清移植実験を示す。ＣＥＡ陰性である２９３Ｔ細胞にｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－mCherryをコードするプラスミドをトランスフェクトし、ｈＣＥＡ－ＶＳＶＧ－mCherry ＰＥＶを生成した（上パネル）。これらの細胞からの上清を収集し、新しい２９３Ｔ（ＣＥＡ陰性、中パネル）細胞及びＨＴ－２９（ＣＥＡ陽性、下パネル）細胞を２４時間処理するために使用した。ＣＥＡ陽性細胞は、有意なmCherryシグナルを示し、ＰＥＶが標的細胞のみ（ＣＥＡ陽性）により組み込まれることを示唆した。
図２５は、ＰＥＶがドナー細胞から生成される場合のＥＶ－ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）プラットフォームの概要を提示する模式図を示す。（例えばレトロウイルス形質導入を通じて）ＥＶ－ＣＡＲ構築物を安定に発現するように作製されているプロデューサー細胞株は、所望される構築物を運搬するＥＶを生成することになる。この例において、構築物は、ＣＤ６３膜貫通ドメインスキャフォールド（テトラスパニン）と、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０）に特異的な少なくとも１つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）標的化部分、及び細胞傷害性ペイロード（例えばグランザイムＢ）とから構成される。プロデューサー細胞株により生成されたＰＥＶは、単離することで、患者に投与することができる。ＰＥＶ（ＥＶ－ＣＡＲ）が腫瘍細胞に達するとき、ＴＡＡの認識により、ＰＥＶを貪食する受容体介在性エンドサイトーシスが生じる。取り込み後、ＰＥＶはキメラ構築物／ＥＶ内容物、ひいては細胞傷害性ペイロードを放出し、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導をもたらす。図面の説明は、がん細胞を標的化する場合の具体例を提示する。
図２６は、テトラスパニンＣＤ６３膜貫通ドメインを有する異なる構築物であって、２つの標的化部分及び単一のペイロードを有する１つの構築物、１つの標的化部分及び単一のペイロードを有する２つの構築物（ここで標的化部分は構築物中の異なる位置に位置する）、２つの標的化部分を有し、ペイロードを有しない１つの構築物、並びに標的化部分を有せず、単一のペイロードを有する対照構築物といった異なる構築物の模式図を示す。
図２７は、プラスミドによって発現された図２６に表される全長構築物のタンパク質発現の成功を実証するため、グランザイムＢについてプローブしたウエスタンブロットを示す。
図２８は、調製されており、実験的検証の最中である種々の二重特異性テトラスパニンに基づくキメラ構築物の模式図を示す。これらは、６つの異なるペイロードを含み、１つは構築物の反対側の第２のペイロードにおいてフューリン切断可能部位を有する構築物である。
実施例８
単一標的化及び多重標的化－腫瘍細胞プログラミングペイロード
背景／状況：リプログラミング部分は、遊離カーゴ（治療用ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）として、又は特定腫瘍上の表面分子標的（例えば、免疫細胞集団、ＣＡＦ又はがん細胞）にＰＥＶを介して連結されたＲＮＡ結合タンパク質／ドメインペイロード（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質／ドメインＭＳ２、ＣＡＳ１３、又はその他）への結合によって、特異的に送達され得る。この構築物であれば、ＰＥＶを所望される細胞型に調整するための標的化部分を発現することになり、単一若しくは複数のペイロードを同時に運搬することができ、及び／又はこれらの構築物は、対応する配列を有する特定のカーゴと組み合わせることができる。
適用：これらのプラットフォームは、腫瘍常在細胞を再プログラム又は教育する（例えば、活性化する、その表現型を変化させるなど）ことで、特定の機能を果たし、ひいてはがんと戦うための有効な手段を表す。
これらのプラットフォームの作動様式：例えば、これらのＰＥＶであれば、免疫細胞に対するがん細胞の可視性（免疫原性）を増強する（例えば、免疫原性細胞死を促進する）ため、使用することができ、又は腫瘍微小環境下、インサイチュでＴ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞として再プログラムするため、使用することができる。
特別な特徴：「ＲＮＡ結合ペイロード（例えば、ＭＳ２、ＣＡＳ１３）とＲＮＡ結合ペイロードにより結合された「マッチング」ＲＮＡ結合モチーフ（ＲＮＡリガンドドメイン）を有する治療用ＲＮＡ分子カーゴ（即ち、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）との間の「核酸リガンドシステム」。
標的化部分：上に列記される全ての例。
ペイロード：ＲＮＡ結合タンパク質又はそれらのＲＮＡ結合モチーフ（例えば、Ｃａｓ１３、ＭＳ２コートタンパク質、Ｓｔａｕｆｅｎ－１、ヒトＰｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン１）。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
送達／作製様式：ウイルスに基づくプラットフォーム（例えば、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶなど）。プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）及び遊離ＰＥＶ。
結果：
図２９Ｃは、ＣＴＸ－ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）を有するＰＥＶが、受け取り細胞を特異的に再プログラムし、ルシフェリン（基質）による酵素反応中（Nanoluc（商標）が酵素である）、「発光」可能であることを示す。Nanoluc（商標）が酵素であり、このデータがＰＥＶを介したNanoluc（商標）の標的化送達だけでなく、機能的酵素の送達も示すことに注目されたい。
図１３は、ＣｄａＡ酵素がＰＥＶを介してＤＣに特異的に送達され得、且つ酵素がレシピエント細胞内であれば機能的に活性があることを示す。
実施例９
カーゴの同時発現（様々なＰＥＶ構築物と組み合わせ可能である）
背景／状況：用語「カーゴ」は、同時発現されるが、キメラタンパク質構築物の一部でない分子として本明細書で定義される。そのようなものとして、カーゴは、構築物中にペイロードが存在するか否かにかかわらず、包含／同時発現され得る。カーゴは、ＥＶに優先的に導かれる核酸若しくはタンパク質、及び／又はＰＥＶ構築物中に含まれる特定のＲＮＡを認識するペイロードによって認識される特定配列を含んでもよいＲＮＡであり得る。
適用：分子の標的細胞への標的化が適する可能性がある場合、特にそれらがＰＥＶ構築物中で活性／機能を維持できない場合、いずれの適用も可能である。それ以外の場合、ＥＶカーゴ分子の特異的送達が促進され得る。
特別な特徴：ＲＮＡは、ＲＮＡ結合モチーフペイロードに結合するためのＲＮＡ結合モチーフ認識部位を有するか、又はＥＶを導くモチーフを有するかのいずれかであり得る。タンパク質は、特定配列（それらを標的にすることが当該技術分野で公知である）により、ＥＶに優先的に導かれてもよい。
標的化部分：状況に応じて様々である
ペイロード：ＲＮＡ結合モチーフ、例えばカーゴがＲＮＡ結合モチーフ認識配列を有する場合。
調整された、目的の特定の核酸分子（カーゴ；例えばマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を同時に運搬するＥＶを生成するため、ＰＥＶを１つ以上のＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）を有するペイロードを運搬するように設計することができる。ＲＮＡカーゴは、（ＲＮＡリガンドドメインとも称される）ＲＢＤによって認識される結合モチーフを提示し、それ故、特異的に相互作用し、ＲＢＤを有するＰＥＶにより運搬され得る（「ＲＮＡ核酸リガンドシステム」系）。例えば、ＲＲＭ、ＫＨ、低温刺激ドメイン（ＣＳＤ）、及びＺｎフィンガーＣＣＨＣドメインなどの細胞のＲＮＡ結合タンパク質中に見出される十分に特徴づけられたＲＮＡ結合ドメインであれば使用可能である。同様に、ウイルスコート又はカプシドタンパク質（例えばＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質）又は細菌のＲＮＡ結合Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ１３）中に見出されるＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡを運搬する又は核酸リガンドシステムとして機能するＰＥＶ構築物中のペイロードの一部として設計することができる。同族ＲＮＡ結合リガンドは、ＲＮＡカーゴ分子中に含まれることになる。
膜貫通ドメイン：ＰＥＶは、本文書中に概説された他のカテゴリーに従う任意の膜貫通ドメインを有し得る一方、カーゴは、本明細書に記載のキメラ構築物の一部でない。
Figure 2023506381000020
実施例１０
対照構築物
これらの構築物は、複数のカテゴリーにおいて様々な実験用の対照として使用する。これらの一部は、独立的に概念実証用の構築物であり、例えば、機能的ペイロードの送達（mCherry又はNanoluc（商標））又は単一標的に対するテトラスパニン膜貫通ドメイン内への標的分子の配置が挙げられる。
Figure 2023506381000021
Figure 2023506381000022
Figure 2023506381000023
Figure 2023506381000024
結果：
図２９Ａ、２９Ｂ、及び２９Ｃは概念実証であり、がん細胞の表面上のＭＭＰ－２を標的にするＰＥＶ（ＰＥＶ標的化部分：ＣＴＸ）が機能的ペイロード、この場合は酵素Nanoluc（商標）を送達し得ることを示す。
図２９Ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクトしないか、又はクロロトキシン（ＣＴＸ）標的化部分及びレポーターペイロード（Nanoluc（商標））の存在下若しくは不在下で指定のＰＥＶプラスミド（Ｆｌａｇタグ化）をトランスフェクトした。全ての構築物がＶＳＶＧ膜貫通ドメイン及びＣ末端にＦＬＡＧタグを有する。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライセートを収集し、指定抗体（Ｆｌａｇ、又は負荷対照としてのβアクチン）に対して免疫ブロットした。データは、所望される実験構築物（ＣＴＸ－ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標））及びその各々の陰性対照［ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）（標的化部分なし）又はＣＴＸ－ＶＳＶＧ（ペイロードなし）］の発現を示す。
図２９Ｂ：（Ａ）に示したとおり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、ＥＶ枯渇培地で培養した。２４時間後及び４８時間後、上清を収集し、ルミノメーター及び標準ルシフェラーゼ検出アッセイを用いて発光レベルを測定した。略称：ＵＴ：非トランスフェクト；ＶＣ：ＣＴＸ－ＶＳＶＧ構築物；ＶＮ：ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）構築物；ＣＶＮ：ＣＴＸ－ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）構築物。Nanoluc（商標）シグナルが、ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）及びＣＴＸ－ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）構築物がトランスフェクトされた細胞に由来する（ＥＶを含有する）上清中に限って検出されることに注目されたい。
図２９Ｃ：トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収集された上清を使用し、様々なヒト神経膠芽腫細胞株を治療した。条件培地移動の８時間後、Nanoluc（商標）基質（ルシフェラーゼアッセイ）及びルミノメーターを使用し、細胞ライセートにおける発光を測定した。ＣＴＸ－ＶＳＶＧ－Nanoluc（商標）を提示するＥＶの取り込みは、特にＵ８７ＭＧ細胞内で増強されたことに注目されたい。この細胞株は、ＭＭＰ－２（ＣＴＸが結合する対象のタンパク質）を高レベルで発現する。
実施例１０
ウイルス感染がＥＶ分泌を増強する
ウイルス感染（例えばワクシニアウイルス(Vaccinia virus)感染）が小さいＥＶの分泌を増強することは実証されている。
図３０は、ナノ粒子追跡分析システム（ZetaView（登録商標）ソフトウェア）を使用し、非感染（モック）又はワクシニアウイルス(vaccinia virus)（ＶａｃＶ）で感染させた７８６－Ｏがん細胞株から生成された小さいＥＶ全体を分析したことを示すグラフを示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
図３１は、モック感染（Ｍ）、又は１のＭＯＩでのＣｏｐＷＴ感染（ＶＡＣＶ）（Ｖ）に続く、感染の４８時間後の、Ｖｅｒｏ、７８６－Ｏ、及びＨＴ－２９細胞からのＥＶ及び全細胞ライセート（ＷＣＬ）のウエスタンブロット解析を示す。膜を、ＥＶマーカー（Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、及びフロチリン１）、細胞／非ＥＶマーカー（ＧＭ１３０、カルレティキュリン、Ｔｏｍ２０）、及びＶａｃＶのＡ２７Ｌタンパク質についてプローブした。
実施例１１
ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドとしての代替的なウイルス糖タンパク質
結果：
図３２は、細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分中の４つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示し、ＶＳＶ、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(lymphocytic choriomeningitis virus)）、Ｌａｓｓａ（ラッサ熱ウイルス(Lassa fever virus)）、及びフニンウイルス(Junin virus)（アルゼンチン・マムアレナウイルス(Argentinian mammarenavirus)としても公知）に由来するウイルス糖タンパク質（Ｇ）が、ペイロード（Ｆｌａｇタグ）をＥＶ内部に往復させるための膜貫通ドメインとして使用可能であることを示す。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＶＳＶ－Ｇ、ＬＣＭＶ－Ｇ、ラッサウイルス－Ｇ、フニンウイルス－Ｇ、又は対照（モック）としての空のベクターを発現するｐＣＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて、細胞ライセートを収集し、製造のプロトコルに従い、EXO-quick-TC試薬(System Biosciences)を用いて、ＥＶをトランスフェクト細胞の上清から収集した。次に、細胞ライセート及び精製したＥＶを、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットした。注目すべきは、全ての糖タンパク質構築物がそれらのＣ末端においてＦｌａｇタグを提示し、検出を容易にする。
図３３は、細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分中の構築物の発現を示すウエスタンブロットを示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するウイルス糖タンパク質が、ペイロードをＥＶ内部に往復させるための膜貫通ドメインとして使用可能であることを示す。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅタンパク質又は対照（モック）としての空のベクターを発現するｐＣＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて、細胞ライセートを収集し、製造のプロトコルに従い、EXO-quick-TC試薬(System Biosciences)を用いて、ＥＶをトランスフェクト細胞の上清から収集した。次に、細胞ライセート及び精製したＥＶを、抗Ｓｐｉｋｅ抗体を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットした。
図３４は、細胞のトランスフェクション時、単離されたＥＶ画分中の４つの異なる構築物の発現を示すウエスタンブロットを示し、タミアミ(Tamiami)、グアナリト(Guanarito)ウイルス、パラナ(Parana)ウイルス、マチュポ(Machupo)ウイルス、及びサビア(Sabia)ウイルスに由来するウイルス糖タンパク質が、ペイロード（Ｆｌａｇタグ）をＥＶ内部に往復させるための膜貫通ドメインとして使用可能であることを示す。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、タミアミウイルス－Ｇ、グアナリトウイルス－Ｇ、パラナウイルス－Ｇ、マチュポウイルス－Ｇ、サビアウイルスＧ又は対照（モック）としての空のベクターを発現するｐＣＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて、細胞ライセートを収集し、製造のプロトコルに従い、EXO-quick-TC試薬(System Biosciences)を用いて、ＥＶをトランスフェクト細胞の上清から収集した。次に、細胞ライセート及び精製したＥＶを、抗ＨＡ抗体を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットした。注目すべきは、全ての糖タンパク質構築物がそれらのＣ末端においてＨＡタグを提示し、検出を容易にする。
実施例１２
カーゴの同時発現
実施例９において前述したとおりである。
背景／状況：カーゴは、構築物中にペイロードがあるか否かにかかわらず、包含／同時発現され得る。
適用：分子の標的細胞への標的化が適するかもしれない場合、特にそれらがＰＥＶ構築物中で活性／機能を維持できない場合、いずれの適用も可能である。それ以外の場合、ＥＶカーゴ分子の標的細胞への特異的送達が促進され得る。
特別な特徴：カーゴＲＮＡ分子は、ＲＮＡ結合モチーフペイロードに結合するためのＲＮＡ結合モチーフ認識部位を有するか、又はＥＶを導くモチーフを有するかのいずれかであり得る。タンパク質は、特定配列（それらを標的にすることが当該技術分野で公知である）により、ＥＶに優先的に導かれてもよい。
標的化部分：適用に応じて様々である。
ペイロード：ＲＮＡ結合モチーフ、例えばカーゴがＲＮＡ結合モチーフ認識配列を有する場合。
調整された、目的の特定の核酸分子（カーゴ、例えばマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を同時に運搬するＥＶを生成するため、ＰＥＶを１つ以上のＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）を有するペイロードを運搬するように設計することができる。ＲＮＡカーゴは、（ＲＮＡリガンドドメインとも称される）ＲＢＤによって認識される結合モチーフを提示し、それ故、特異的に相互作用し、ＲＢＤを有するＰＥＶにより運搬され得る（「ＲＮＡ核酸リガンドシステム」系）。例えば、ＲＲＭドメイン、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、低温刺激ドメイン（ＣＳＤ）、及びＺｎフィンガーＣＣＨＣドメインなどの細胞のＲＮＡ結合タンパク質中に見出される十分に特徴づけられたＲＮＡ結合ドメインであれば使用可能である。同様に、ウイルスコート又はカプシドタンパク質（例えばＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質）又は細菌のＲＮＡ結合Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ１３）中に見出されるＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡを運搬する又は核酸リガンドシステムとして機能するＰＥＶ構築物中のペイロードの一部として設計することができる。同族ＲＮＡ結合リガンドは、ＲＮＡカーゴ分子中に含まれることになる。
膜貫通ドメイン：ＰＥＶは、本文書中に概説された他のカテゴリーに従う任意の膜貫通ドメインを有し得る一方、カーゴは、本明細書に記載のキメラ構築物の一部でない。
結果：
表１２は、図３５において特定の標的ＲＮＡ配列に特異的に結合することが実験的に示されたアミノ酸モチーフ（ＲＮＡ結合モチーフ）を提示する。ＲＮＡ配列は、それらの各々のＲＮＡ結合モチーフにより選択的に認識され、バイオインフォマティクス分析により判定されたとおり、ヒトゲノム中に存在しない。これらのＲＮＡ結合モチーフは、本発明に記載のとおり、また下の図面で示されるとおり、ペイロードとして使用可能である。
Figure 2023506381000025
Figure 2023506381000026
Figure 2023506381000027
Figure 2023506381000028
Figure 2023506381000029
Figure 2023506381000030
Figure 2023506381000031
Figure 2023506381000032
Figure 2023506381000033
図３５Ａ．異なるＰＥＶ構築物が負荷されたＥＶで教育されたレシピエント細胞におけるNanoluc（商標）活性の定量的読み取り値。次に、Nanoluc（商標）活性を定量化することで、ＲＮＡ結合モチーフに融合されたＬＤＬＲＴ（ＬＤＬＲ標的）－ＶＳＶＧ膜貫通ドメイン（ＶＳＶＧＴＭ）を有するプラスミドが、Nanoluc（商標）(Nluc)に融合された青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードするｍＲＮＡをパッケージし、それを細胞表面上のＬＤＬＲについて陽性のレシピエント細胞に送達し得ることを実証した。要するに、これらの実験においてトランスウェル（商標）システムを使用し、そこで（図面中、ドナー細胞として表される）トランスウェル（商標）インサートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ｄＣａｓ１３ａ＋ｇＲＮＡモチーフ－ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ｄＣａｓ１３ａ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＣＢＤ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ｄＣａｓ１３ｄ＋ｇＲＮＡモチーフ－ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ｄＣａｓ１３ｄ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＣＢＤ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－Ｐｕｍ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＰＢＤ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－Ｓｔｕｆ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＳＢＤ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ＳＤ－ＶＥＥＶ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＰＳ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－Ｌ７２ＡＥ＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＣ／Ｄ Ｂｏｘ又はＬＤＬＲ－ＶＳＶＧＴＭ－ＭＳ２＋ＢＦＰ＿ＮＬｕｃ－３ＸＨＡＭを発現するプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、トランスウェル（商標）を、（トランスウェル（商標）システムの底部に蒔いた）レシピエント細胞とともに２４時間インキュベートし、次にトランスウェル（商標）システムの底部区画における細胞（レシピエント細胞）を収集し、レシピエント細胞におけるNanoluc（商標）活性を製造業者の提案されたプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って測定した。
図３５Ｂ．図３５Ａに示された同じ実験の代表的な蛍光顕微鏡画像。図３５Ａに示したようなトランスフェクション後、トランスウェル（商標）を、（トランスウェル（商標）システムの底部に蒔いた）レシピエント細胞とともに２４時間インキュベートし、次にトランスウェル（商標）システムの底部及び上部区画における細胞を、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡を使用して画像化し、トランスフェクト細胞（ドナー）内だけでなくレシピエント細胞内でも（実際の青色蛍光の代わりに淡灰色シグナルとして図面中に示される）ＢＦＰの発現を検出した。注目すべきは、図３５Ｂは、レシピエント細胞の明視野画像を示し、細胞はモック対照条件下であったが、発現としてＢＦＰ発現がなかったことを実証する。
実施例１３
細胞傷害性ペイロードによる単一標的化
実施例７において前述したとおりである。
適用：細胞傷害性分子［例えばグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）］の標的細胞への標的化が適するかもしれない場合、いずれの適用も可能であり、本実施例では、標的化細胞は、がん関連線維芽細胞又は活性化線維芽細胞、がん細胞及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を発現する膵がん患者腫瘍サンプルである。
結果
図３６．抗ＦＡＰ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢを負荷したＥＶで処理した線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）が陽性の膵臓線維芽細胞（ＰａｎＦｉｂ）、膵がん細胞（ＢｘＰＣ３）、及び膵がん患者由来のサンプル（Ｐ０２５、Ｐ０３２）の細胞生存度をこの図面に示す。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、抗ＦＡＰ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢを発現するプラスミドをトランスフェクトしたか、又はモック陰性対照としてトランスフェクトしないままであった。２４時間後、トランスフェクト細胞からの上清を収集し、細胞片を１０００×ｇで１０分間の遠心分離により予め排除した。次に、上清をＦＡＰを発現することが知られた様々な細胞型に移し、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを使用し、製造業者の使用説明書に従い、細胞生存度を測定した。抗ＦＡＰ－ＶＳＶＧ－ｍＧＺＭＢをトランスフェクトしたドナー細胞に由来する上清に曝露した細胞の生存度を、陰性対照上清に曝露した細胞と比較した生存度の変化（％）として計算した。
実施例１４
単一標的化－免疫アジュバントペイロード
実施例３において前述したとおりである。
図３７は、抗ＤＥＣ２０５標的化部分及びＣｄａＡペイロード［ＣＤ６３の第１ループ内に挿入された］を負荷したＥＶ（それらの発現は図８に示す）が、単離された一次樹状細胞におけるＳＴＩＮＧ経路の活性化時に効率的であることを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、（図面中、ＣＤ６３ ＥＶとして表示した）ｐｃＤＮＡ３．１ベクター内のＰＥＶ構築物ａＤＥＣ２０５－ＣＤ６３Ｄ－ＣｄａＡ－Ｆｌａｇをトランスフェクトしたか、又はトランスフェクトしないままであり、次いで４８時間後、ＥＶを連続超遠心分離により精製し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び脛骨からの骨髄前駆細胞を、マウスＧＭ－ＣＳＦ（PeproTech#315-03、最終濃度が４０ｎｇ／ｍｌ）とともにＲＰＭＩ中で６日間培養した。７日目、分化したＤＣを蒔き、非トランスフェクトエキソソーム又は指定のＣＤ６３ ＥＶのいずれかで２４時間処理した。その後、処理したＤＣにおけるＳＴＩＮＧリン酸化（Ｓ３６５）を、ＳＴＩＮＧリン酸化状態特異的抗体(Cell Signaling Technology#72971)を用いるウエスタンブロットにより評価した。全ＳＴＩＮＧタンパク質レベルをＳＴＩＮＧ抗体(Cell Signaling Technology#13647)により評価した。βアクチンを負荷対照として使用した。
実施例１５
単一標的化－免疫リプログラミングペイロード
実施例３、４、及び実施例６ａにおいて前述したとおりである。
適用：「免疫リプログラミング」分子の標的免疫細胞への標的化が適するかもしれない場合、いずれの適用も可能である。本実施例では、標的化細胞は、一次マクロファージである。この特定例では、マクロファージは、ＰＥＶ構築物が負荷されたＥＶであって、これらのＥＶが（抗Ｍａｒｃｏ標的化部分を介して）マクロファージを特異的に標的にし、ＳＴＩＮＧ経路活性化剤の細菌酵素ＣｄａＡを同時に送達する、ＰＥＶ構築物が負荷されたＥＶで処理される。注目すべきは、マクロファージ、特に、高レベルのＭＡＲＣＯをそれらの表面上で発現することを特徴とする腫瘍関連マクロファージ、即ちＴＡＭは、ＳＴＩＮＧ活性化時、炎症促進性表現型に再プログラム（又は分極化）されることが文献において公知である。
結果
図３８．この図面では、以下に説明のとおり、３つの異なるＰＥＶ構築物が負荷されたＥＶで処理された活性化された一次マクロファージにおけるＳＴＩＮＧの活性化を示すウエスタンブロットを示す。要するに、抗ＭＡＲＣＯ－ＶＳＶＧＴＭ－ＣｄａＡ又は抗ＭＡＲＣＯ－ＳＡＲＳ２ＴＭ－ＣｄａＡ又は抗ＭＡＲＣＯ－ＣｄａＡＴＭ－ＣｄａＡベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。４８時間後、上清を収集し、ＥＶを連続超遠心分離により単離した。ペレット化したＥＶをＰＢＳに再懸濁し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び脛骨からの骨髄前駆細胞を、マウスＭ－ＣＳＦ（PeproTech#315-02-２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を有するＤＭＥＭ中で６日間培養した。７日目、分化したマクロファージを蒔き、処理しないままか、又は５ＥＵ単位／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で２４時間前処理し、ＭＡＲＣＯのこれら細胞の表面上での発現を誘導した。その後、前処理したマクロファージは、モック処理のまま又は様々なＥＶ製剤での２４時間処理のいずれかにした。その後、処理したマクロファージにおけるＳＴＩＮＧリン酸化（Ｓ３６５）を、ＳＴＩＮＧリン酸化状態特異抗体(Cell Signaling Technology#72971)を用いるウエスタンブロットにより評価した。対照として、全ＳＴＩＮＧタンパク質レベルをＳＴＩＮＧ抗体(Cell Signaling Technology#13647)により評価した。βアクチンを負荷対照として使用した。
図３９．様々な抗Ｍａｒｃｏに連結されたＣｄａＡ ＰＥＶ構築物（即ち、抗ＭＡＲＣＯ－ＶＳＶＧＴＭ－ＣｄａＡ又は抗ＭＡＲＣＯ－ＳＡＲＳ２ＴＭ－ＣｄａＡ又は抗ＭＡＲＣＯ－ＣｄａＡＴＭ－ＣｄａＡベクター）のインターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達経路の刺激における効力を実証する実験を示す。細菌シクラーゼＣｄａＡの様々なＭＡＲＣＯ－ＣｄａＡ融合タンパク質における機能的効力を、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ－ＳＴＩＮＧシグナル伝達応答を生成することについて評価した。この目的のため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、モックであるか、又は指定のとおりの様々なＭＡＲＣＯプラスミドを２４時間トランスフェクトした。その後、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰを含有するライセートを調製し、ＴＨＰ１－Ｂｌｕｅ－ＩＳＧ ＩＲＦ（ＩＦＮ制御因子）レポーター細胞(InvivoGen)に適用し、ＳＴＩＮＧ－ＩＲＦシグナル伝達系を２４時間刺激し、製造のプロトコルに従い、Quanti-Blueアッセイを可能にした。
実施例１６
多重標的化２部分構築物（ＥＶ－ＢｉＴＥ）
実施例２において前述したとおりである。
背景：主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識し、殺傷するために必要である。しかし、大部分の腫瘍が、（ＭＨＣ）の発現を下方制御することで、免疫攻撃を回避する。腫瘍の回避機構を回避するための当該技術分野で既存の一方法は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞をすぐ近傍に導くように改変された二重特異性抗体によるものである。これらの二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又はＢｉＴＥとも称される。
ＢｉＴＥは、Ｔ細胞の、腫瘍細胞をＭＨＣ非依存的様式で認識し、殺傷する能力を媒介することができる。ＢｉＴＥは、Ｔ細胞抗原ＣＤ３及び特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な連結された可変鎖抗体断片からなる。同様に、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー又はＢｉＫＥは、ＮＫ細胞上の活性化受容体及び表面腫瘍抗原への同時結合を媒介することで、腫瘍細胞のＮＫ細胞依存性殺傷を促進し得る。既存のＢｉＫＥ及びＢｉＴＥ技術は有望であるが、現在臨床開発段階の多くが、全身投与中の関連毒性を伴う課題、薬剤安定性の課題（短い半減期）、及び大部分の固形がんにおいて有効である程度に十分高い局所濃度に至らせるという課題を有する。
適用：２つの標的化部分：Ｔ細胞標的を認識する一方、及び腫瘍細胞（がん細胞又はＣＡＦ）を標的にする他方、を有するＰＥＶ構築物。
これらのプラットフォームの作動様式：これらのＰＥＶは、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の対合を促進することで、これらの免疫細胞型による腫瘍細胞の直接的殺傷を促進する。
利点：ＢｉＴＥ及びＢｉＫＥのＰＥＶ形式での提示は、二重特異性抗体構築物よりも安定である。
特別な特徴：一般に、ペイロードなしのＰＥＶ構築物自身は、Ｔ又はＮＫ細胞をがん細胞に接近させる、安定な二重特異性細胞エンゲージャーである。これらのＰＥＶは、インビボ又はエクスビボで生成され得る。
送達様式：患者における送達媒体として腫瘍選択性のウイルスを使用し、感染がん細胞においてＢｉＴＥ及びＢｉＫＥを分泌させる。そのようにして、ＰＥＶは、必要とされる正確な部位に送達され、ひいてはピコモル濃度、即ち現行の二重特異性抗体手法よりも低い用量の治療で有効である可能性が高い。ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１などのウイルスに基づくプラットフォームが使用可能であった。
ウイルス及び感染細胞を調製するとともに、単離されたＰＥＶを作製するためのプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）についても検討する。
標的化部分：上記のとおりの一本鎖可変断片又はナノボディ。これらは、表面腫瘍抗原標的（例えば、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＦＡＰなど）を通じて腫瘍細胞と、Ｔ細胞に結合する分子（例えば、ＣＤ３標的、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ標的化部分を介する）を通じてＴ細胞とに結合する。
ペイロード：なし
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。ここで含めた例として、テトラスパニンタンパク質が挙げられるが、単一通過ＴＭタンパク質に「多量体化技術」を使用してもよい（詳細については特別な特徴を参照）。
結果
図４０は、ナイーブＥＶ又はαＣＤ３－ＶＳＶＧ、αＣＤ３－αＦＡＰ－ＣＤ６３、若しくはαＣＤ３－αＣＥＡ－ＣＤ６３で装飾されたＥＶの存在下で、マウス脾細胞と共培養したＭＣ３８（ＷＴ及びＣＥＡ発現）細胞（脾細胞：ＭＣ３８の比が１０：１）における細胞生存度を示す。ＥＶ上のＥｘｏ－ＢｉＴＥ構築物は、ナイーブＥＶと比較して脾細胞により細胞死を増強する。要するに、αＣＤ３－ＶＳＶＧ、αＣＤ３－αＦＡＰ－ＣＤ６３、又はαＣＤ３－αＣＥＡ－ＣＤ６３をコードするベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。４８時間後、上清を収集し、ＥＶを連続超遠心分離により単離した。ペレット化したＥＶをＰＢＳに再懸濁し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。脾細胞を均質化したマウス脾臓から収集し、新しく使用した。
実施例１７
単一標的化－がんワクチンペイロード
実施例３及び４において前述したとおりである。
背景／状況：腫瘍関連抗原及び／又は免疫リプログラミング部分（例えば、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）は、ＡＰＣ、例えば樹状細胞上の表面分子にＰＥＶを介して特異的に送達され得る。この構築物であれば、ＰＥＶをＤＣ（樹状細胞）に標的にするための標的化部分を発現することになり、また１つ又は複数のペイロードを同時に運搬することができる。
適用：これらのプラットフォームは、頑強な腫瘍抗原特異的免疫を誘発するための有効な手段を表すことになる。
これらのプラットフォームの作動様式：ＤＣは、多くは未熟な又は寛容化する表現型を呈する。（ペイロード又はカーゴとしての）ＰＥＶを介する腫瘍抗原送達は、アジュバント（抗ＣＤ４０ｍＡｂアゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）、シトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、又はＴｏｌｌ様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）アゴニストなどのＤＣ成熟刺激）の同時投与、又は上記のとおりのＳＴＩＮＧ若しくはＥＲＡｄＰ経路活性化剤（例えば細菌のジヌクレオチドシクラーゼ、例えば、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰシクラーゼであるＣｄａＡ及びＭｔｂＤｉｓａ、及びｃ－ｄｉ－ＧＭＰシクラーゼであるＶＣＡ０８４８）を有するＰＥＶの標的化共送達と併せて、腫瘍関連抗原の提示能の増強及びＴ細胞同時刺激分子の発現増強をもたらす。
単独の又はアジュバントと組み合わせた若しくは免疫リプログラミング部分（例えばＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤）と組み合わせた腫瘍関連抗原は、ＰＥＶを介して樹状細胞上の表面分子に特異的に送達され得る。
標的化部分：標的：ＣＤ４０、ＴＮＦ－αファミリー受容体、ＤＥＣ２０５、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＥＣ９）及びインテグリン受容体ＣＤ１１ｃを含む抗原提示細胞表面分子は、特定のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノボディ（即ち、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＣＤ１１ｃ）、リガンド又は標的化ペプチド（例えば、ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０標的化ペプチド）を含む標的化部分により標的にされる。
ペイロード：特定の腫瘍関連抗原（マウス腫瘍モデルにおける概念実証用：ＤＣＴ及びＯＶＡが検討中である）。臨床試験にとって重要なヒト腫瘍関連抗原が使用可能である（例えば、ＨＰＶ－Ｅ６及びＥ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１など）。がん特異的ネオ抗原も使用可能である。
特定の疾患細胞抗原、例えば腫瘍関連／特異抗原（例えば、ＯＶＡ、ＤＣＴ、ｍＥＲＫｍ９など）の同時発現が検討される。さらに、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ活性化剤などのアジュバント分子であれば、疾患特異的抗原又は腫瘍関連／特異抗原と同時に送達することができる。
膜貫通ドメイン：表１中に列記される全ての例が使用可能であった。
送達／作製様式：ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、レンチウイルス(lentivirus)、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)［ＡＡＶ］、ＶＳＶ、ＨＳＶ－１などのウイルスに基づくプラットフォームが使用可能であった。細胞をトランスフェクトするためのプラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３．１）、並びに作製され、単離されたＰＥＶについても検討する。
結果
図４１．ナイーブＥＶ、又はａＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＯＶＡ（図中、「ＯＶＡ」と称される）若しくはａＤＥＣ２０５－ＣＤ６３Ｄ－ＣｄａＡ－Ｆｌａｇ及びａＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＯＶＡの双方（図中、ＯＶＡ＋シクラーゼと称される）で装飾されたＥＶ（これらの構築物は以前に図８、１４、及び３８に示したことも注目されたい）によるワクチン接種実験は、樹状細胞標的化抗原［例えば、オバルブミン（ＯＶＡ）］及び免疫アジュバント（例えばＣｄａＡ酵素）の双方の組み合わせがインビボで免疫応答を誘導することを示した。要するに、ａＤＥＣ２０５－ＣＤ６３Ｄ－ＣｄａＡ－Ｆｌａｇ及び／又は抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＯＶＡをコードするベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。空のベクターのトランスフェクションは、陰性モックＥＶ対照として含めた。４８時間後、上清を収集し、ＥＶを連続超遠心分離により単離し、７５０ｕｌのＰＢＳに再懸し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。次に、マウスＩＶあたり２００ｕｌの各ＥＶ製剤をマウスにワクチン接種した（ナイーウ ｎ＝５、ＯＶＡのみ ｎ＝３及び卵細胞＋シクラーゼ ｎ＝３）。１４日後、脾細胞を収集し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体で染色した。データは、ナイーブマウスに見られたバックグラウンド染色に対する全ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率により四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞として表示する。
実施例１８
単一標的化－免疫アジュバントペイロード
実施例３において前述したとおりである。
ゲオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens)の「応答レシーバーで調節されたジグアニル酸シクラーゼ」［ＧｓＰＣＡ］は、この一般的な土壌細菌中で環状ＡＭＰ－ＧＭＰ（３’，３’－ｃＧＡＭＰ）を生成する。ＲＥＣ（シグナル受信／二量体化）調節ドメインが欠失され、ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）又はＧＧＤＥＦドメインが発現され、特有の構成的活性型をもたらした。この活性型が、抗ＤＥＣ２０５ ｓｃＦＶにより樹状細胞に標的化され、ＶＳＶＧ膜貫通ドメインによりＥＶに負荷されたＰＥＶ構築物中で発現されたとき、インターフェロン応答の機能的活性化が認められた。
図４２．この図面は、報告された細胞株中でインターフェロン応答を刺激することにより免疫アジュバントとして作用し得る、樹状細胞に導かれたＰＥＶ構築物を示す。Quanti-Blue比色分析アッセイを用いる、哺乳動物細胞ＴＨＰ１－Ｂｌｕｅ－ＩＳＧ系における野生型及び様々な変異型ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ及びｃ－ｄｉ－ＡＭＰ細菌のシクラーゼ酵素の機能的特徴づけ。以下に詳述するとおりの様々なコドン最適化導入遺伝子構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に４８時間トランスフェクトした。細胞ライセートを収集し、ＩＦＮ－βプロモーター－ＳＥＡＰレポーター細胞［ＴＨＰ１－Ｂｌｕｅ－ＩＳＧ ＩＲＦ（ＩＦＮ制御因子）レポーター細胞(InvivoGen)］に移し、ＳＴＩＮＧ－ＩＲＦシグナル伝達系を２４時間刺激することで、製造業者のプロトコルに従い、Quanti-Blueアッセイを可能にした。図４２では、ＧｓＰＣＡ：抗ＤＥＣ２０５－ＶＳＶＧＴＭ－ＧｓＰＣＡ－ＦＬＡＧ－ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド。陽性対照は、（１）ＣｄａＡ：ＣＤ６３＿抗ＤＥＣ２０５＿ＣＤ６３＿ＣｄａＡ＿ＦＬＡＧ－ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド及び（２）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ：１０ｐｇ／ｍｌを含む。陰性対照は、モックトランスフェクト細胞を含む。
特徴が本明細書で名付けられるとき、特徴に対応する配列例（又はそれを含む配列）が表１３中に見出され得ることは理解されるであろう。
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機能的変異体がいくつかの実施形態に包含されることは理解されるであろう。機能的変異体は、表１３に示される配列例に対して少なくとも８０％同一である配列を含んでもよく、前記変異体は、それらの由来元の親分子と実質的に同じ機能を保持する。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９０％同一であってもよい。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９５％同一であってもよい。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９６％同一であってもよい。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９７％同一であってもよい。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９８％同一であってもよい。機能的変異体は、各々の親分子に対して少なくとも９９％同一であってもよい。同様に、特定の実施形態は、それらの由来元の全長親分子と実質的に同じ機能を保持する機能断片を包含する。
前述において、説明を目的として、実施形態の徹底的理解を可能にするため、ありとあらゆる詳細が示される。しかし、これらの具体的詳細が必要とされないことは当業者にとって明らかであろう。
上記の実施形態は、例にすぎないことが意図される。当業者により、特定の実施形態に変更、修飾及びバリエーションがもたらされる。特許請求の範囲の範囲は、本明細書中に示される特定の実施形態により限定されるべきでないが、全体的に本明細書に矛盾のない様式で解釈されるべきである。本明細書中で参照される全ての参考文献は、それら全体が参照により援用される。
参照
Stickney,Z.,Losacco,J.,McDevitt,S.,Zhang,Z.,and Lu,B.(2016) Development of exosome surface display technology in living human cells.Biochem Biophys Res Commun.472(1):53-9.
Meyer,C.,Losacco,J.,Stickney,Z.,Li,L,Marriott,G.,and Lu,B.(2017) Pseudotyping exosomes for enhanced protein delivery in mammalian cells.Int J Nanomedicine.12:3153-3170.
米国特許第１０，６１７，７６８号
米国特許第１０，７５８，４８６号
米国特許出願第１６／９００，３８３号

Claims (220)

  1. 細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え腫瘍選択性ウイルス粒子であって、前記組換えポリペプチドは、
    －前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、
    －少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び
    －少なくとも１つの小胞内ポリペプチド
    を含む、組換え腫瘍選択性ウイルス粒子。
  2. 腫瘍溶解性ウイルスに属する、請求項１に記載の組換え腫瘍選択性ウイルス粒子。
  3. 細胞外小胞（ＥＶ）を少なくとも１つの標的細胞に導くための組換えポリペプチドであって、
    －前記ＥＶを前記少なくとも１つの標的細胞によって発現された前記少なくとも１つの標的分子に導くための少なくとも１つの標的化部分、
    －少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチド、及び
    －少なくとも１つの小胞内ポリペプチド
    を含む組換えポリペプチド。
  4. 前記少なくとも１つのＥＶアンカーポリペプチドは、前記少なくとも１つの標的化部分に連結されたＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドを含む、請求項３に記載の組換えポリペプチド。
  5. 前記ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、ＬＡＭＰ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ８１、ＣＤ８２、又はＬＡＭＰ１からの膜貫通ドメインを含む、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
  6. 前記ＥＶ誘導性膜貫通ポリペプチドは、フニンウイルス糖タンパク質、ラッサ熱ウイルス糖タンパク質、ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）糖タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質、タミアミウイルス糖タンパク質、グアナリトウイルス糖タンパク質、パラナウイルス糖タンパク質、マチュポウイルス糖タンパク質、サビアウイルス糖タンパク質又はＣｄａＡからの膜貫通ドメインを含む、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
  7. 前記少なくとも１つの標的細胞は、哺乳動物細胞を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  8. 前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項７に記載の組換えポリペプチド。
  9. 前記少なくとも１つの標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞である、請求項３～８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  10. 前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む、請求項９に記載の組換えポリペプチド。
  11. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である、請求項９に記載の組換えポリペプチド。
  12. 前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１１に記載の組換えポリペプチド。
  13. 前記少なくとも１つの標的分子は、細胞表面マーカー又は細胞表面受容体である、請求項３～１２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  14. 前記少なくとも１つの標的分子は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である、請求項３～１３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  15. 前記少なくとも１つの標的分子は、
    －健常対照細胞によりではなく、疾患細胞により発現される、又は
    －前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
    疾患特異的細胞表面分子を含む、請求項３～１４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  16. 前記疾患特異的細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む、請求項１５に記載の組換えポリペプチド。
  17. 前記少なくとも１つの標的分子は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む、請求項３～１６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  18. 前記少なくとも１つの標的化部分は、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＤＡＲＰｉｎを含む、請求項３～１７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  19. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  20. 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項１８又は１９に記載の組換えポリペプチド。
  21. 前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  22. 前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗ＥＧＦＲＶｉｉｉ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰα外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、又はＰＤ１を含む、請求項１８に記載の組換えポリペプチド。
  23. 前記小胞内ポリペプチドは、前記ＥＶアンカーポリペプチドを介して前記少なくとも１つの標的化部分に連結された少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドを含む、請求項３～２２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  24. 前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを含む、請求項２３に記載の組換えポリペプチド。
  25. 前記ＥＶアンカーポリペプチド及び前記小胞内ポリペプチドは、それらの２つの膜貫通ドメイン間に挿入された前記少なくとも１つの標的化部分を含むＥＶ誘導性組換えテトラスパニンを一緒に含む、請求項３に記載の組換えポリペプチド。
  26. 前記組換えテトラスパニンは、ヒトＣＤ６３又はＣＤ９を含むか又はそれに由来する、請求項２５に記載の組換えポリペプチド。
  27. 前記少なくとも１つの標的細胞は、哺乳動物細胞を含む、請求項２５又は２６に記載の組換えポリペプチド。
  28. 前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項２７に記載の組換えポリペプチド。
  29. 前記少なくとも１つの標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞である、請求項２７又は２８に記載の組換えポリペプチド。
  30. 前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む、請求項２９に記載の組換えポリペプチド。
  31. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である、請求項２９に記載の組換えポリペプチド。
  32. 前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項３１に記載の組換えポリペプチド。
  33. 前記少なくとも１つの標的分子は、細胞表面マーカー又は細胞表面受容体である、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  34. 前記少なくとも１つの標的分子は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  35. 前記少なくとも１つの標的分子は、
    －健常対照細胞によりではなく、疾患細胞により発現される、又は
    －前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
    疾患特異的抗原を含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  36. 前記疾患特異的抗原は、腫瘍関連抗原を含む、請求項３５に記載の組換えポリペプチド。
  37. 前記少なくとも１つの標的分子は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  38. 前記少なくとも１つの標的化部分は、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＤＡＲＰｉｎを含む、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  39. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項３８に記載の組換えポリペプチド。
  40. 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項３８又は３９に記載の組換えポリペプチド。
  41. 前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である、請求項３８に記載の組換えポリペプチド。
  42. 前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗ＥＧＦＲＶｉｉｉ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰａ外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、又はＰＤ１を含む、請求項３８に記載の組換えポリペプチド。
  43. 前記組換えテトラスパニンのＮ末端及び／又はＣ末端に連結された少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドをさらに含む、請求項２５～４２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  44. 前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療ポリペプチドを含む、請求項４３に記載の組換えポリペプチド。
  45. 前記少なくとも１つの標的化部分は、少なくとも２つの標的化部分を含み、ここで前記ＥＶアンカーポリペプチド及び前記小胞内ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて１、２、３、及び４に付番された４つの膜貫通ドメインを含むＥＶ誘導性組換えテトラスパニンを一緒に含み、ここで前記２つの標的化部分の第１は、膜貫通ドメイン１及び２の間に挿入され、且つ前記２つの標的化部分の第２は、膜貫通ドメイン３及び４の間に挿入される、請求項３に記載の組換えポリペプチド。
  46. 前記ＥＶ誘導性組換えテトラスパニンは、ヒトＣＤ６３又はＣＤ９に由来する、請求項４５に記載の組換えポリペプチド。
  47. 前記少なくとも２つの標的化部分は、少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する、請求項４５又は４６に記載の組換えポリペプチド。
  48. 前記少なくとも２つの異なる標的分子は、同じ標的細胞により発現される、請求項４７に記載の組換えポリペプチド。
  49. 前記標的細胞は、哺乳動物細胞を含む、請求項４８に記載の組換えポリペプチド。
  50. 前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含む、請求項４９に記載の組換えポリペプチド。
  51. 前記標的細胞は、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞、又は免疫細胞を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  52. 前記腫瘍間質細胞は、がん関連線維芽細胞を含む、請求項５１に記載の組換えポリペプチド。
  53. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球である、請求項５１に記載の組換えポリペプチド。
  54. 前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項５３に記載の組換えポリペプチド。
  55. 前記少なくとも２つの標的分子の各々は、細胞表面分子である、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  56. 前記少なくとも２つの標的分子の各々は、ＴＮＦ－αファミリー受容体、インテグリン、Ｃ型レクチン受容体、レプチン、癌胎児性抗原、ＣＤ抗原、炭酸脱水酵素、ＦＡＰ、ＭＭＰ２、ＤＥＣ２０５、ＤＣ４０、ＣＬＥＣ９、ＣＤ３、グリコサミノグリカン、多糖、又は脂質である、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  57. 前記少なくとも２つの標的分子の各々は、
    －健常対照細胞によりではなく、疾患細胞により発現される、又は
    －前記疾患細胞により、前記健常対照細胞と比較してより多量に発現される
    疾患特異的細胞表面分子を含む、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  58. 前記疾患特異的細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む、請求項５７に記載の組換えポリペプチド。
  59. 前記少なくとも２つの標的分子の各々は、独立して、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰａ、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体を含む、請求項４８～５８のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  60. 前記少なくとも２つの標的化部分の各々は、独立して、受容体リガンド、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はＤＡＲＰｉｎを含む、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  61. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項６０に記載の組換えポリペプチド。
  62. 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項６０又は６１に記載の組換えポリペプチド。
  63. 前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である、請求項６０に記載の組換えポリペプチド。
  64. 前記少なくとも１つの標的化部分は、抗ＤＥＣ２０５、抗Ｃｌｅｃ９Ａ、抗ＦＡＰ、抗ＣＥＡ、抗ＣＡ９、抗ＣＴＬ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０６、抗ＥＧＦＲＶｉｉｉ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７、ＳＩＲＰα外部ドメイン、ＧＥ１１ペプチド、ＣＴＸ、ＶＡＲ２Δ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０標的化ペプチド、ｉＲＧＤ、又はＰＤ１を含む、請求項６０に記載の組換えポリペプチド。
  65. 前記少なくとも２つの異なる標的分子は、異なる標的細胞により発現される、請求項４７に記載の組換えポリペプチド。
  66. 前記異なる標的細胞は、疾患細胞及び免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも２つの標的化部分は各々、疾患細胞表面分子及び免疫細胞表面分子に導かれる、請求項６５に記載の組換えポリペプチド。
  67. 前記異なる標的細胞は、腫瘍細胞及び免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも２つの標的化部分は各々、腫瘍細胞表面分子及び免疫細胞表面分子に導かれる、請求項６５に記載の組換えポリペプチド。
  68. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞であり、且つ前記免疫細胞表面分子は、Ｔ細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  69. 前記Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項６８に記載の組換えポリペプチド。
  70. 前記免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、且つ前記免疫細胞表面分子は、ＮＫ細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  71. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞であり、且つ前記免疫細胞表面分子は、Ｂ細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  72. 前記免疫細胞は、マクロファージであり、且つ前記免疫細胞表面分子は、マクロファージ細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  73. 前記免疫細胞は、樹状細胞であり、且つ前記免疫細胞表面分子は、樹状細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  74. 前記免疫細胞は、好中球であり、且つ前記免疫細胞表面分子は、好中球細胞表面分子である、請求項６７に記載の組換えポリペプチド。
  75. 前記腫瘍細胞表面分子は、腫瘍関連抗原を含む、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  76. 前記腫瘍細胞表面分子は、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＡ９、ＭＭＰ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰα、コンドロイチン硫酸、αｖインテグリン、又は葉酸受容体の１つを含む、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  77. 前記少なくとも１つの標的化部分は、抗体若しくはその機能断片、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はＤＡＲＰｉｎを含む、請求項６５～７６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  78. 前記抗体は、単一ドメイン抗体である、請求項７７に記載の組換えポリペプチド。
  79. 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項７７又は７８に記載の組換えポリペプチド。
  80. 前記機能断片は、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２である、請求項７７に記載の組換えポリペプチド。
  81. 少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドをさらに含む、請求項４５～８０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  82. 前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを含む、請求項８１に記載の組換えポリペプチド。
  83. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記組換えテトラスパニンの前記Ｎ末端及び／又はＣ末端に連結される、請求項８２に記載の組換えポリペプチド。
  84. 前記少なくとも１つのＥＶペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを放出するための切断部位を介して連結される、請求項２３、４３、及び８１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  85. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドを放出するための切断部位を介して連結される、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  86. 前記切断部位は、自己切断ペプチド、ｐＨ依存性切断部位、又は酵素切断のための部位を含む、請求項８４又は８５に記載の組換えポリペプチド。
  87. 前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  88. 前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、細胞傷害性分子を含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  89. 前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む、請求項８８に記載の組換えポリペプチド。
  90. 前記ペイロードポリペプチドは、免疫調節分子を含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  91. 前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む、請求項９０に記載の組換えポリペプチド。
  92. 前記ＳＴＩＮＧ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む、請求項９１に記載の組換えポリペプチド。
  93. 前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む、請求項９２に記載の組換えポリペプチド。
  94. 前記ペイロードポリペプチドは、酵素を含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  95. 前記ペイロードポリペプチドは、核酸結合ドメインを含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  96. 前記核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合モチーフを含む、請求項９５に記載の組換えポリペプチド。
  97. 前記ＲＮＡ結合モチーフは、核酸リガンドシステムを含む、請求項９６に記載の組換えポリペプチド。
  98. 前記ペイロードポリペプチドは、抗原を含む、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  99. 前記抗原は、腫瘍関連抗原である、請求項９８に記載の組換えポリペプチド。
  100. 前記抗原は、病原体に由来する、請求項９８に記載の組換えポリペプチド。
  101. 前記ＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む、請求項９８～１００のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  102. 前記アジュバントは、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む、請求項１０１に記載の組換えポリペプチド。
  103. 前記ＳＴＩＮＧ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む、請求項１０２に記載の組換えポリペプチド。
  104. 前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む、請求項１０３に記載の組換えポリペプチド。
  105. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドに連結される、請求項２４、４４、及び８２のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
  106. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドに切断部位により連結される、請求項１０５に記載の組換えポリペプチド。
  107. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、前記少なくとも１つのさらなるＥＶペイロードポリペプチドから少なくとも２つのＥＶ膜貫通ドメインにより分離される、請求項１０５に記載の組換えポリペプチド。
  108. 請求項１～２２、２５～４２、及び４５～８０のいずれか一項に定義されるとおりの組換えポリペプチドをコードする核酸分子。
  109. 別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする、請求項１０８に記載の核酸。
  110. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む、請求項１０９に記載の核酸。
  111. 前記核酸は、ＲＮＡを含む。請求項１０９に記載の核酸。
  112. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む、請求項１１１に記載の核酸。
  113. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む、請求項１０９に記載の核酸。
  114. 請求項２４、４４、及び８２～１０７のいずれか一項に定義されるとおりの組換えポリペプチドをコードする核酸分子。
  115. 前記核酸は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする、請求項１１４に記載の核酸。
  116. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む、請求項１１５に記載の核酸。
  117. 前記核酸は、ＲＮＡを含む、請求項１１６に記載の核酸。
  118. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む、請求項１１７に記載の核酸。
  119. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む、請求項１１４に記載の核酸。
  120. 請求項１０８又は１０９に定義されるとおりの核酸を含むベクター。
  121. 請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸を含むベクター。
  122. 請求項１０８～１１３のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、又はそれに相補的な核酸を含む組換えウイルスゲノム。
  123. 腫瘍選択的ウイルスに由来する、請求項１２２に記載の組換えウイルスゲノム。
  124. 腫瘍溶解性ウイルスに由来する、請求項１２２又は１２３に記載の組換えウイルスゲノム。
  125. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である、請求項１２４に記載の組換えウイルスゲノム。
  126. 請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、又はそれに相補的な核酸を含む組換えウイルスゲノム。
  127. 腫瘍選択的ウイルスに由来する、請求項１２６に記載の組換えウイルスゲノム。
  128. 腫瘍溶解性ウイルスに由来する、請求項１２６又は１２７に記載の組換えウイルスゲノム。
  129. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)］である、請求項１２７に記載の組換えウイルスゲノム。
  130. 請求項１０８～１１３のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、又はそれに相補的な核酸を含むウイルス粒子。
  131. 腫瘍選択的であるウイルスに属する、請求項１３０に記載のウイルス粒子。
  132. 腫瘍溶解性ウイルスに属する、請求項１３０又は１３１に記載のウイルス粒子。
  133. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)］である、請求項１３２に記載のウイルス粒子。
  134. 請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、又はそれに相補的な核酸を含むウイルス粒子。
  135. 腫瘍選択的であるウイルスに属する、請求項１３４に記載のウイルス粒子。
  136. 腫瘍溶解性ウイルスに属する、請求項１３４又は１３５に記載のウイルス粒子。
  137. 前記腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（ＶＳＶ）、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、単純ヘルペスウイルス１型(Herpes virus simplex 1)（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型(Herpes virus 2)（ＨＳＶ－２）、アデノウイルス(adenovirus)である、請求項１３６に記載のウイルス粒子。
  138. 請求項１０８～１１３のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２０に定義されるとおりのベクター、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、又は請求項１３０～１３３のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子を含む宿主細胞。
  139. 原核細胞である、請求項１３８に記載の宿主細胞。
  140. 真核細胞である、請求項１３８に記載の宿主細胞。
  141. 酵母細胞又は昆虫細胞である、請求項１４０に記載の宿主細胞。
  142. 哺乳動物細胞である、請求項１４０に記載の宿主細胞。
  143. ヒト細胞である、請求項１４２に記載の宿主細胞。
  144. 免疫細胞である、請求項１３８に記載の宿主細胞。
  145. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は好中球である、請求項１４４に記載の宿主細胞。
  146. 制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１４５に記載の宿主細胞。
  147. 別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする、請求項１３８～１４６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  148. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む、請求項１４７に記載の宿主細胞。
  149. 前記核酸は、ＲＮＡを含む、請求項１４８に記載の宿主細胞。
  150. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む、請求項１４９に記載の宿主細胞。
  151. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む、請求項１４７に記載の宿主細胞。
  152. 請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２６～１２９のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、又は請求項１３１～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子を含む宿主細胞。
  153. 原核細胞である、請求項１５２に記載の宿主細胞。
  154. 真核細胞である、請求項１５２に記載の宿主細胞。
  155. 酵母細胞又は昆虫細胞である、請求項１５４に記載の宿主細胞。
  156. 哺乳動物細胞である、請求項１５４に記載の宿主細胞。
  157. ヒト細胞である、請求項１５６に記載の宿主細胞。
  158. 免疫細胞である、請求項１５２に記載の宿主細胞。
  159. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は好中球である、請求項１５８に記載の宿主細胞。
  160. 制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１５９に記載の宿主細胞。
  161. 前記宿主細胞は、別々のＥＶカーゴ分子をさらにコードする、請求項１５２～１６０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  162. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む。請求項１６１に記載の宿主細胞。
  163. 前記核酸は、ＲＮＡを含む。請求項１６２に記載の宿主細胞。
  164. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む。請求項１６３に記載の宿主細胞。
  165. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。請求項１６１に記載の宿主細胞。
  166. 請求項１～２２、２５～４２、及び４５～８０のいずれか一項に定義されるとおりの組換えポリペプチドを含む標的化細胞外小胞（ＥＶ）。
  167. 別々のＥＶカーゴ分子をさらに含む、請求項１６６に記載の標的化ＥＶ。
  168. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む、請求項１６７に記載の標的化ＥＶ。
  169. 前記核酸は、ＲＮＡを含む、請求項１６８に記載の標的化ＥＶ。
  170. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む、請求項１６９に記載の標的化ＥＶ。
  171. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む、請求項１６８に記載の標的化ＥＶ。
  172. 前記ＥＶカーゴ分子は、ＡＰＩを含む、請求項１６７に記載の標的化ＥＶ。
  173. 請求項２３、２４、４３、４４、及び８１～１０７のいずれか一項に定義されるとおりの組換えポリペプチドを含む標的化細胞外小胞（ＥＶ）。
  174. 別々のＥＶカーゴ分子をさらに含む、請求項１７３に記載の標的化ＥＶ。
  175. 前記ＥＶカーゴ分子は、核酸を含む、請求項１７４に記載の標的化ＥＶ。
  176. 前記核酸は、ＲＮＡを含む、請求項１７５に記載の標的化ＥＶ。
  177. 前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む、請求項１７６に記載の標的化ＥＶ。
  178. 前記ＥＶカーゴ分子は、ポリペプチドを含む。請求項１７４に記載の標的化ＥＶ。
  179. 前記ＥＶカーゴ分子は、ＡＰＩを含む、請求項１７４に記載の標的化ＥＶ。
  180. エキソソームである、請求項１６６～１７９のいずれか一項に記載の標的化ＥＶ。
  181. マイクロベシクルである、請求項１６６～１７９のいずれか一項に記載の標的化ＥＶ。
  182. エクトソームである、請求項１６６～１７９のいずれか一項に記載の標的化ＥＶ。
  183. アポトーシス小体である、請求項１６６～１７９のいずれか一項に記載の標的化ＥＶ。
  184. 請求項１０８～１１３のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２０に定義されるとおりのベクター、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３０～１３３のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１６６～１７２のいずれか一項に記載の標的化ＥＶを；薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に含む組成物。
  185. 請求項１１４～１１８のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３４～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１７３～１７７のいずれか一項に記載の標的化ＥＶを；薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に含む組成物。
  186. 標的化部分を標的細胞の標的分子に結合させる方法であって、前記標的細胞を請求項１６６～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法。
  187. 標的化部分を標的細胞の標的分子に結合させるための、請求項１６６～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶの使用。
  188. 標的化部分の標的細胞の標的分子への結合における使用のための、請求項１６６～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶ。
  189. ペイロード分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を請求項１７３～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法。
  190. ペイロード分子を標的細胞に送達するための、請求項１７３～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶの使用。
  191. ペイロード分子の標的細胞への送達における使用のための、請求項１７３～１７９のいずれか一項に定義されるとおりのＥＶ。
  192. カーゴ分子を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を請求項１６７～１７２及び１７４～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶと接触させることを含む方法。
  193. カーゴ分子を標的細胞に送達するための、請求項１６７～１７２及び１７４～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶの使用。
  194. カーゴ分子の標的細胞への送達における使用のための、請求項１６７～１７２及び１７４～１７９のいずれか一項に定義されるとおりの標的化ＥＶ。
  195. 抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、請求項１１４～１１６のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２６～１２９のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３４～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１７３～１７７のいずれか一項に記載の標的化ＥＶを対象に投与することを含み、前記標的細胞は免疫細胞を含み、且つ前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは抗原を含む、方法。
  196. 前記抗原は、疾患細胞特異的抗原を含む、請求項１９５に記載の方法。
  197. 前記抗原は、腫瘍特異抗原を含む、請求項１９５に記載の方法。
  198. 前記抗原は、病原体に由来する、請求項１９５に記載の方法。
  199. 前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは、アジュバントをさらに含む、請求項１９５～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  200. 標的細胞を殺傷する方法であって、請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３３～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１７３～１８５のいずれか一項に記載の標的化ＥＶを対象に投与することを含み、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロードポリペプチドは細胞傷害性分子を含む、方法。
  201. 前記細胞傷害性分子は、ヒトＧＺＭＢ Ｒ２０１Ｋ、マウスＧＺＭＢ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素ＡからのＰＥ３８ドメイン、又はヒトＴＲＡＩＬを含む、請求項２００に記載の方法。
  202. 前記標的細胞は、疾患細胞を含む、請求項２００又は２０１に記載の方法
  203. 前記疾患細胞は、腫瘍細胞である、請求項２０２に記載の方法
  204. 免疫細胞を再プログラムする方法であって、前記免疫細胞を、請求項１１４～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３３～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１７３～１８５のいずれか一項に記載の標的化ＥＶと接触させることを含み、前記少なくとも１つのＥＶ治療用ペイロード分子は免疫調節分子を含む、方法。
  205. 前記免疫調節分子は、ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤を含む、請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記ＳＴＩＮＧ又はＥＲＡｄＰ経路活性化剤は、細菌のジヌクレオチドシクラーゼを含む、請求項２０５に記載の方法。
  207. 前記細菌のジヌクレオチドシクラーゼは、ＣｄａＡを含む、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む、請求項２０４～２０７のいずれか一項に記載の方法。
  209. 標的疾患細胞に対する免疫応答を導く方法であって、請求項１０８～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２０又は１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項１３０～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子、又は請求項１６６～１７９のいずれか一項に記載の標的化ＥＶを対象に投与することを含み、前記組換えポリペプチドは、各々が少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合する少なくとも２つの標的化部分を含み、前記少なくとも２つの異なる標的分子は各々、免疫細胞及び疾患細胞によって発現される、方法。
  210. 前記疾患細胞は、腫瘍細胞を含む、請求項２０９に記載の方法。
  211. 前記少なくとも２つの異なる標的分子の一方は、腫瘍関連抗原を含む、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む、請求項２０９～２１１のいずれか一項に記載の方法。
  213. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記免疫細胞は、制御性Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項２１３に記載の方法。
  215. 前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である、請求項２１２に記載の方法。
  216. 対象における治療標的化ＥＶを調製する方法であって、
    －接触・対象から得られた細胞を、請求項１０８～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸、請求項１２０若しくは１２１に定義されるとおりのベクター、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、又は請求項１３０～１３７のいずれか一項に定義されるとおりのウイルス粒子と接触させることと、
    －前記標的化ＥＶを回収することと、
    を含む方法。
  217. 前記細胞は、腫瘍細胞である、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記細胞は、免疫細胞である、請求項２１６に記載の方法。
  219. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、マクロファージ、又は好中球を含む、請求項２１８に記載の方法。
  220. 標的化ＥＶを作製する方法であって、
    －細胞内の請求項１０８～１１９のいずれか一項に定義されるとおりの核酸を発現するか、又は請求項１３８～１６５のいずれか一項に定義されるとおりの宿主細胞を培養することで、ＥＶを生成することと、
    －ＥＶを回収することと、
    を含む方法。
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