CN112649518B

CN112649518B - 一种高效液相色谱-荧光检测法测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法

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Publication number: CN112649518B
Application number: CN202011009500.3A
Authority: CN
Inventors: 马义虔; 李红洲; 杨燕红; 张建; 梁桂娟; 陈兴林; 龙四红; 谈晓君; 彭小东; 陈大鹏; 陈学航; 彭祖茂; 徐显松; 安睿; 冯婷婷; 熊家卉
Original assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Current assignee: Guizhou Product Quality Inspection And Testing Institute
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN112649518A

Abstract

本发明属于葡萄酒中聚天冬氨酸钾分析技术领域，公开了一种高效液相色谱‑荧光检测法测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法，包括以下步骤：1.葡萄酒水解：依次加入偏重亚硫酸钠溶液、葡萄酒和盐酸溶液，盖紧瓶盖，在电热板上加热后转移至容量瓶中，加入氢氧化钠溶液，用超纯水定容至刻度。2.内标溶液的加入：分别移取标准工作液、未水解的葡萄酒和步骤1中水解后的葡萄酒于容量瓶中，加入内标溶液，用超纯水定容至刻度。3.衍生化反应：移取步骤2中3种溶液，加入衍生化溶液，混匀，过滤。4.高效液相色谱‑荧光检测器分析检测。本发明可避免高浓度的衍生化试剂对目标物的干扰，为葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的检测提供了一个稳定、准确的方法。

Description

一种高效液相色谱-荧光检测法测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法

技术领域

本发明属于葡萄酒中聚天冬氨酸钾(KPA)分析技术领域，具体地说，涉及一种高效液相色谱-荧光法测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾(KPA)含量的方法。

背景技术

葡萄酒含有营养价值很高的多种氨基酸、花青素、矿物质和维生素等物质，这些物质都是人体需要补充和吸收的营养成分。但是，其中的酒石酸、单宁、色素、蛋白质等大分子物质是引起葡萄酒不澄清、不稳定的原因。而酒石酸盐的稳定性是影响葡萄酒稳定性的最主要因素，葡萄酒中酒石酸含量为2～6g/L(Waterhouse AL,Sacks GL,JefferyDW.Understanding wine chemistry[J].John Wiley&Sons,2016.)，K⁺含量为125～2040mg/L、Ca²⁺含量为50～300mg/L(Felie P,Yaneris M-G,Andrea V,et al.The use ofcation exchange resins in wines:Effects on pH,tartrate stability,and metalcentent[J].viticulture and Enology,2018,45(1):82-92.)，若装瓶前没有得到较好的处理，装瓶后酒石酸钾和酒石酸钙等晶体沉淀将析岀在葡萄酒中。装瓶贮存一定时间后的葡萄酒岀现一些沉淀，虽属正常现象，但会引起视觉缺陷，影响消费者对酒的感官评价(Teas V,Correia A C,Jord O,et al.Wine tartrate stabilization by differentlevels of cation exchange resin treatments:impact on chemical cemposition,phenolic profile and oryanoleptic properties of red wines[J].Food ResexrchInternational,2015,69:364-372)。添加稳定剂，可使葡萄酒不易析出酒石酸盐，可最大限度地减少对葡萄酒的处理，保持葡萄酒的品质(Morge C.Cellulose gum,an effectivesolution for tartrate instability in wine[J].Australian and New Zealand GrapeGrower and Winemaker,2016,632:58-61.)。

聚天冬氨酸钾(potassium polyaspartate,KPA)是L-天冬氨酸通过热聚合而成的聚酰胺。2016年欧盟(欧盟委员会条例2017/1399)批准其为葡萄酒的添加剂，同时得到欧洲食品***(EFSA)的积极认可。可用于红和白葡萄酒，依据待处理葡萄酒的不稳定程度，一般用量范围为100～200mg/L，建议最高安全用量为300mg/L(Official journal of theeuropean union[J].Commisssion Regulation(EU),2017,1399:8-11.)。聚天冬氨酸钾是带负电荷的聚合物，可抑制晶体成核和生长，改变正在形成晶体的形态，以降低葡萄酒不稳定性的酿造功能至关重要。(EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sourcesadded to Food.Safety of potassium polyaspartate(A-5D K/SD)for useas astabiliser in wine[J].EFSA joural,2016,14(3):4435.和Colombo,F.,Di Lorenzo,C.,Casalegno,C.,et al.Further experimental data supporting the safety ofpotassium polyaspartate used as a food additive in wine stabilization[C].41^stWorld Congress of Vine and Wine.Bio Web of Conferences.France:EDP Sciences,2019:1-5.)因此开发一种能够有效、稳定。准确测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾的技术方法有利于葡萄酒的稳定和视觉品质，促进葡萄酒行业健康发展具有十分重要的现实意义。

发明内容

(1)拟解决的问题

建立一种快速、稳定、准确的测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法。

简言之，本发明基于高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)实现对葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法，填补了葡萄酒领域中聚天冬氨酸钾含量测定技术的空白。本发明将促进葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量技术进步，也为今后制定检测标准提供技术方法。

(2)本发明的具体方案

本发明结合液相色谱分离理论和荧光检测技术实现了葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的稳定、准确测定。

具体而言，本发明测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法，包括以下步骤：

1)葡萄酒水解

依次移取0.2mL 10g/L偏重亚硫酸钠溶液、2mL葡萄酒样品和2mL 6M盐酸溶液于4mL棕色小瓶中，盖紧瓶盖，在108℃电热板上加热72h后，将溶液全部转移至10mL A级容量瓶中，加入2.5mL 5M氢氧化钠溶液后，用超纯水定容至刻度。

2)内标溶液的加入

分别移取1.25mL天冬氨酸标准工作液、未经水解的葡萄酒和6.25mL步骤1中水解后的葡萄酒溶液于25mL A级容量瓶中，加入0.25mL内标(氨基己酸)溶液后用超纯水定容至刻度。

3)衍生化反应

分别移取20mL步骤2中3种溶液，加入10mL衍生化溶液，混匀60s，用0.2μm醋酸纤维滤膜过滤，待测。

4)HPLC-FLD分析检测

上述步骤中，所述的仪器准备为调整各项参数至工作状态：色谱柱为极性液相色谱柱；柱温：40℃；FLD波长(λ)：λex＝340nm；λem＝450nm

所述色谱条件为C18极性柱(如：Syncronis aQ 4.6×250mm,5μm)；进样量：10μL；柱流速1.1mL/min；流动相A：超纯水；流动相B：0.05M无水醋酸钠-四氢呋喃(96:4,v:v)；流动相C：甲醇；流动相D：乙腈；梯度洗脱程序：0～3min，100％B；3～15min，50％B-25％C-25％D；15～17min，84％B-8％C-8％D；17～18min，100％B。

(3)有益效果

本发明根据葡萄酒的理化特性及液相色谱-荧光检测器技术特点实现了葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量高精度分析与测定，简单、快速、准确及样品用量少等优点。该发明面向国内外从事葡萄酒分析的高等院校和研究院所，各食品检测机构，将促进葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量测定技术进步。

附图说明

图1天冬氨酸衍生化原理图

图2天冬氨酸标准曲线图

图3红葡萄酒中天冬氨酸的HPLC-FLD色谱图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例一：

1、仪器与试剂

高效液相色谱***(包括一个四元泵，自动取样器，带恒温器的柱室和FLD)，电热板，4mL棕色小瓶，0.1～1.0mL移液器，0.2μm醋酸纤维滤膜，电子天平，容量瓶，Milli-Q超纯水***制备。

天冬氨酸(DL-天冬氨酸C₄H₇NO₄，纯度≥99％，CAS：617-45-8)，偏重亚硫酸钠(Na₂S₂O₅，CAS：7681-57-4)，盐酸溶液(HCl，CAS：7647-01-0)；氢氧化钠(NaOH，CAS：1310-73-2)，氨基己酸(C₆H₁₃NO₂，纯度≥99％，CAS：60-32-2)，十水四硼酸钠(固体，纯度＞99％，CAS：1303-96-4)，邻苯二甲醛(OPA)(C₈H₆O₂，纯度≥99％，CAS：643-79-8)，巯基乙醇(C₂H₆OS，纯度≥99％，CAS：60-24-2)

2、HPLC-FLD条件

色谱柱为C18极性柱(如：Syncronis aQ 4.6×250mm,5μm)；柱温：40℃；FLD波长(λ)：λex＝340nm；λem＝450nm；进样量：10μL；柱流速1.1mL/min；流动相A：超纯水；流动相B：0.05M无水醋酸钠-四氢呋喃(96:4,v:v)；流动相C：甲醇；流动相D：乙腈；梯度洗脱程序：0～3min，100％B；3～15min，50％B-25％C-25％D；15～17min，84％B-8％C-8％D；17～18min，100％B。

3、溶液配制

1)10g/L偏重亚硫酸钠溶液：称取5g偏重亚硫酸钠于500mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

2)6M盐酸溶液：称取109.5g盐酸于500mL A级容量瓶中，超纯水定容至刻度。

3)5M氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠固体于500mL A容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

4)天冬氨酸标准工作液配制

储备液1配制：用超纯水配制5000mg/L天冬氨酸；储备液2配制：用超纯水配制200mg/L天冬氨酸。

标准工作液配制：分别吸取0.25mL、1.25mL和6.25mL储备液2，用超纯水定容至25mL，得到浓度分别为2、10、50mg/L的使用液STD1、STD2、STD3；分别吸取0.5mL、1.25mL和2.5mL储备液1，用超纯水定容至25mL，得到浓度分别为100、250、500mg/L的使用液STD4、STD5、STD6。

5)氨基己酸储备液：用超纯水配制1000mg/L氨基己酸内标溶液。

6)0.1M十水四硼酸钠缓冲溶液(pH值为10.5)：称取19.1g十水四硼酸钠于A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

7)衍生化溶液：向10mL A级容量瓶中加入100mg OPA，200μL巯基乙醇和1mL甲醇，用0.1M十水四硼酸钠缓冲溶液定容至刻度(使用前准备)。

8)0.05M无水醋酸钠缓冲溶液：称取2.05g无水醋酸钠于A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

4、样品前处理和HPLC-FLD分析检测

1)葡萄酒样品水解

依次移取0.2mL 10g/L偏重亚硫酸钠溶液、2mL葡萄酒样品和2mL 6M盐酸溶液于4mL棕色小瓶中，盖紧瓶盖，在108℃电热板上加热72h后，将溶液全部转移至10mL A级容量瓶中，加入2.5mL 5M氢氧化钠溶液，用超纯水定容至刻度。

2)内标溶液的加入

3)衍生化反应

移取20mL步骤2中3种溶液，加入10mL衍生化溶液(加入100mg OPA，200μL巯基乙醇和1mL甲醇，用0.1M十水四硼酸钠缓冲溶液定容至10mL)，混匀60s，用0.2μm醋酸纤维滤膜过滤，待测。

4)HPLC-FLD分析检测

5、含量计算

聚天冬氨酸钾(KPA)的添加量是通过水解样品和未水解样品之间天冬氨酸含量的差值得到，计算公式(1)：

X(mg/L)＝(C_{水解_葡萄酒}-C_{未水解_葡萄酒})×f_KPA (1)

其中：X为聚天冬氨酸钾(KPA)的添加量(mg/L)；C_{水解_葡萄酒}为葡萄酒水解后天冬氨酸的含量(mg/L)；C_{未水解_葡萄酒}为葡萄酒未水解中天冬氨酸的含量(mg/L)；f_KPA为聚天冬氨酸钾转化为天冬氨酸的因子，由聚天冬氨酸钾单体的分子质量与天冬氨酸的分子质量之比计算，计算公式(2)：

6、检出限和定量限

将2、10、50、100、250、500mg/L的天冬氨酸标准工作液衍生后进HPLC-FLD分析检测，以天冬氨酸浓度-峰面积绘制标准曲线，得到回归方程y＝5.954x-6.5241，相关系数R²＝0.9998。

鉴于葡萄酒中天然含有天冬氨酸，故决定对其进行测定，根据葡萄酒样品的信噪比确定检出限LOD和定量限LOQ(LOQ＝3LOD)，结果见表1。

表1 HPLC-FLD测定葡萄酒中天冬氨酸的检出限和定量限结果

7、基质效应对回收率影响结果

1)含水溶液

通过对天冬氨酸水解前、水解后溶液的比较来验证酸水解和衍生化工艺的回收率。配制已知浓度的天冬氨酸溶液(25、100和200mg/L)，每个浓度测定3次取平均值；得到如表2所示结果：

表2含水基质对回收率的影响结果

2)葡萄酒

采用标准添加方法到白葡萄酒和红葡萄酒中(分别添加50mg/L和200mg/L聚天门冬氨酸钾(KPA))，以验证基质干扰对KPA测定的影响。每个水平进行5次重复性试验。得到如表3所示结果：

表3葡萄酒样品对回收率的影响结果

备注：最佳回收率范围为：80～110％。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims

1.一种高效液相色谱-荧光检测法测定葡萄酒中聚天冬氨酸钾含量的方法，包括以下步骤；

步骤1、葡萄酒样品水解：依次移取偏重亚硫酸钠溶液、葡萄酒样品和盐酸溶液于4 mL棕色小瓶中，盖紧瓶盖，在电热板上加热后，将溶液全部转移至10 mL A级容量瓶中，加入氢氧化钠溶液，用超纯水定容至刻度；

步骤2、内标溶液的加入：分别移取天冬氨酸标准工作液、未经水解的葡萄酒样品和步骤1中水解后的葡萄酒溶液于25 mL A级容量瓶中，加入内标溶液后用超纯水定容至刻度；

步骤3、衍生化反应：分别移取步骤2中3种溶液，加入衍生化溶液，混匀，用0.2 μm醋酸纤维滤膜过滤，待测；

步骤4、高效液相色谱-荧光检测器分析检测；

步骤1中，所述的葡萄酒样品水解的方法，包括：

（1）偏重亚硫酸钠溶液通过以下方法制备得到：称取5 g偏重亚硫酸钠于500 mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到浓度为10 g/L偏重亚硫酸钠溶液；

（2）6 M盐酸溶液通过以下方法制备得到：称取109.5 g 盐酸于500 mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到浓度为6 M盐酸溶液；

（3）5 M氢氧化钠溶液通过以下方法制备得到：称取10 g氢氧化钠固体于500 mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到浓度为5 M氢氧化钠溶液；

（4）偏重亚硫酸钠溶液、葡萄酒样品、盐酸溶液和氢氧化钠溶液的体积分别为：0.2 mL、2 mL、2 mL、2.5 mL；

（5）电热板温度为108℃，加热时间为72 h；

步骤2中，内标溶液的加入，包括：

（1）天冬氨酸标准工作溶液通过以下方法制备得到：天冬氨酸储备液1配制：用超纯水配制5000 mg/L天冬氨酸溶液；天冬氨酸储备液2配制：用超纯水配制200 mg/L天冬氨酸溶液，标准工作液配制：分别吸取0.25 mL、1.25 mL和6.25 mL储备液2，用超纯水定容至25mL，得到浓度分别为2、10、50 mg/L的使用液STD1、STD2、STD3；分别吸取0.5 mL、1.25 mL和2.5 mL储备液1，用超纯水定容至25 mL，得到浓度分别为100、250、500 mg/L的使用液STD4、STD5、STD6；

（2）氨基己酸内标溶液通过以下方法制备得到：称取1 g氨基己酸于1000 mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到浓度为1000 mg/L氨基己酸内标溶液；

（3）天冬氨酸标准工作液、未经水解的葡萄酒样品和6.25 mL步骤1中水解后的葡萄酒溶液、氨基己酸内标溶液的体积分别为1.25 mL、1.25 mL、6.25 mL、0.25 mL；

步骤3中，衍生化反应，包括：

（1）十水四硼酸钠缓冲溶液通过以下方法制备得到：称取19.1 g十水四硼酸钠于500mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到0.1 M pH=10.5的十水四硼酸钠缓冲溶液；

（2）衍生化溶液通过以下方法制备得到：向10 mL A级容量瓶中加入100 mg邻苯二甲醛，200 μL巯基乙醇和1 mL甲醇，用0.1 M pH=10.5十水四硼酸钠缓冲溶液定容至刻度；

（3）移取步骤2中3种溶液的体积分别为20 mL；

（4）衍生化溶液、疏基乙醇、甲醇的体积分别为10 mL、200 μL、1 mL；

（5）混匀时间为60 s；

步骤4中，高效液相色谱-荧光检测器分析检测，包括：

（1）溶液通过以下方法制备得到：称取2.05 g无水醋酸钠固体于500 mL A级容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到浓度为0.05 M无水醋酸钠缓冲溶液；

（2）色谱条件如下：色谱柱为C18 4.6×250 mm, 5 μm；柱温：40℃；FLD波长：λex=340nm；λem=450 nm；进样量：10 μL；柱流速1.1 mL/min；流动相A：超纯水；流动相B：体积比为96:4的0.05 M无水醋酸钠缓冲溶液：四氢呋喃；流动相C：甲醇；流动相D：乙腈；梯度洗脱程序：0～3 min，100%B；3～15 min，50%B-25%C-25%D；15～17 min，84%B-8%C-8%D；17～18min，100%B。