CN112649405B - 基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置，本方法利用液晶空间光调制器对荧光辐射差分超分辨显微成像中的激发光进行调制，将空间光调制器两部分分别加载为0‑2π涡旋相位调制和闪耀光栅，使得共路的激发光在样品面同时形成有一定距离的一个实心光斑和一个空心光斑，进行并行扫描，从而保证成像速度相较普通荧光辐射差分超分辨显微成像提高一倍的同时两激发光因共路而不易受到噪声、漂移等干扰的影响。

Description

基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置
技术领域
本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置。
背景技术
在生物学、生命科学等领域中，光学显微镜是观察细胞、细胞器、病毒等的重要手段。然而，由于衍射及成像***孔径的存在，光学显微镜的分辨率存在限制，这一限制称为阿贝衍射极限，值为0.61λ/NA，其中λ是光波波长，NA是物镜的数值孔径。
为突破衍射极限，科研人员提出了多种超分辨显微技术，其中荧光辐射差分超分辨显微技术(Fluorescence emission difference microscopy,FED)具有较低的光漂白特性和较快的成像速度。FED显微***包括两路不同模式的激发光，其一是共聚焦光，在焦面表现为实心光斑；另一路是负共聚焦光，表现为面包圈型的空心光斑，内部尺寸小于衍射极限。FED显微图像是由这两幅图像差分得到的。
考虑到FED需要两幅图像，为了进一步提高成像速度，并行荧光辐射差分超分辨显微技术(Parallel fluorescence emission difference microscopy,pFED)使用光束偏转装置在物面上将实心光斑和空心光斑错开一定距离，从而用二者同时对样品进行扫描和探测。然而，pFED中的两激发光路容易分别受到漂移、噪声等外界干扰，从而限制了其成像质量。
发明内容
本发明提供了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法和装置，本发明与pFED方法相比，激发光共路而非经过不同的器件，可以更好的消除漂移、噪声等外界干扰的影响。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明一方面提供了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，该方法包括以下步骤：
(1)将激光器发出的激光光束准直后利用起偏器转为线偏光，这一线偏光包含S分量和P分量；
(2)调节液晶空间光调制器的出射平面与显微物镜入瞳共轭；使用液晶空间光调制器的一半部分，利用0-2π涡旋相位调制，调制步骤1)线偏光中平行于调制偏振方向的偏振分量，而对垂直于调整偏振方向的偏振分量不做调制；
(3)液晶空间光调制器的出射光经四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回同一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的另半部分；
(4)将液晶空间光调制器的另半部分加载为闪耀光栅，从而使线偏光未被调制的分量被调制而倾斜，根据光栅方程，通过调整光栅常数计算倾角，使得最终实心光斑和空心光斑在物面上错开；
(5)将空间光调制器的另半部分出射的两路光转为圆偏光；
(6)两路圆偏光在样品面上呈现错开的实心光斑和空心光斑，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，激发的两路荧光信号分别经过各自的探测光路，由两个探测器接收，从而获得共聚焦光强度分布和负共聚焦光强度分布；
(7)将负共聚焦光强度分布移位后与共聚焦光强度分布对应，根据荧光辐射差分公式，得到超分辨图像。
进一步地，所述步骤(1)中，光束通过起偏器后通过一个二分之一波片调整偏振方向；偏振方向应当通过负共聚焦光强度与共聚焦光强度之比来确定，即通过调整偏振方向使此二者强度匹配。
进一步地，所述步骤(2)中，线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
进一步地，所述步骤(2)中，液晶空间光调制器对线偏光一个分量的调制不限于将其调制为涡旋光以形成横向空心光斑，也可通过0/π环形相位调制在物面形成纵向空心光斑，这类纵向空心光斑在横向同样具有较弱的空心光斑效果，从而可以实现三维荧光辐射差分超分辨显微成像，其横向分辨率相对弱于横向空心光斑超分辨显微成像的横向分辨率，但纵向分辨率可极大提高，从而能够获得更多样品的细节信息。
进一步地，所述步骤(6)中，光斑错位并行扫描是通过液晶空间光调制器加载闪耀光栅的方式获得的，能够降低光路校准难度，且可以对光斑进行泽尼克像差矫正，获得最优光斑。
进一步地，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，通过两个针孔滤除离焦杂散光后，分别利用两个探测器获得实心光斑和空心光斑激发的荧光信号。
进一步地，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，可以安装四个并排相邻的多模光纤，使用两端的光纤端面接收荧光信号，并用光电倍增管或雪崩光电二极管探测；而中间两光纤不接探测器，用于更方便的确定两荧光信号的间隔。
进一步地，所述步骤(7)中，荧光辐射差分公式如下：
I(x,y)＝I1(x,y)-γI2(x+Δx,y+Δy)
其中I1(x,y)为共聚焦光强度分布，I2(x+Δx,y+Δy)为移位后的负共聚焦光强度分布，γ为差值系数。
本发明另一方面提供了一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像装置，该装置包括：
用于产生激发光的激光器及准直器；
用于产生线偏光的起偏器；
用于调整偏振方向的二分之一波片；
用于使用各半部分分别将线偏光的两个分量调制为涡旋光和倾斜光的液晶空间光调制器；
用于使线偏光的一个分量偏振方向旋转90度的四分之一波片及透镜和反射镜；
用于将两激发光转为圆偏光的四分之一波片和二分之一波片；
用于反射激发光而透射荧光的分光镜；
用于扫描样品的扫描振镜及显微镜架模块；
用于消除杂散光的滤光片；
用于消除离焦杂散光的针孔或多模光纤；
用于分别探测实心光斑和空心光斑的两探测器。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：由于两激发光共路，其经过相同的器件，同时受到各器件漂移及引入的噪声的影响，这些漂移和噪声在实心光斑与空心光斑进行差分时相消，从而在实现较快成像速度的同时改善了超分辨图像的信噪比。
附图说明
图1为本发明实施例的基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法流程图；
图2为本发明实施例的基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像装置示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
如图1所示，本发明提供的基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
(1)将激光器发出的激光光束准直后利用起偏器转为线偏光，这一线偏光包含S分量和P分量；
(2)调节液晶空间光调制器的出射平面与显微物镜入瞳共轭。液晶空间光调制器具有只调制一个方向的线偏光的性质。当外加电场超过阈值时，液晶分子出现电控双折射效应，使得液晶对一个对应方向的光产生双折射。利用这一性质，使用液晶空间光调制器的一半部分，利用0-2π涡旋相位调制，调制步骤1线偏光中平行于调制偏振方向的偏振分量，而对垂直于调整偏振方向的偏振分量不做调制。
(3)液晶空间光调制器的出射光经四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回同一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的另半部分；利用反射镜转折光路使得入射光两次经过四分之一波片返回至液晶空间光调制器的另半部分，此时入射光相当于经过一个二分之一波片，偏振方向与原先垂直，而原来未被调制的偏振分量旋转到了可被调制的偏振方向，从而可以被液晶空间光调制器调制，而原来被调制的偏振分量此时处于垂直于调制偏振方向，未被液晶空间光调制器调制；
(4)将液晶空间光调制器的另半部分加载为闪耀光栅，从而使线偏光未被调制的分量被调制而倾斜，根据光栅方程(若是一级闪耀光栅)，可以通过调整光栅常数计算倾角，使得最终实心光斑和空心光斑在物面上错开，本实施例中错开2-3AU；
(5)将空间光调制器的另半部分出射的两路光转为圆偏光；例如，可以利用四分之一波片和二分之一波片使两路光转为圆偏光；
(6)两路圆偏光在样品面上呈现错开的实心光斑和空心光斑，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，激发的两路荧光信号分别经过各自的探测光路，由两个探测器接收，从而获得共聚焦光强度分布和负共聚焦光强度分布；
(7)将负共聚焦光强度分布移位后与共聚焦光强度分布对应，根据荧光辐射差分公式，得到超分辨图像。
进一步地，所述步骤(1)中，光束通过起偏器后可以通过一个二分之一波片调整偏振方向。偏振方向应当通过负共聚焦光强度与共聚焦光强度之比来确定，即通过调整偏振方向使此二者强度匹配。
进一步地，所述步骤(2)中，线偏光入射液晶空间光调制器前可以使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
进一步地，所述步骤(2)中，液晶空间光调制器对线偏光一个分量的调制不限于将其调制为涡旋光以形成横向空心光斑，也可通过0/π环形相位调制在物面形成纵向空心光斑，这类纵向空心光斑在横向同样具有较弱的空心光斑效果，从而可以实现三维荧光辐射差分超分辨显微成像，其横向分辨率相对弱于横向空心光斑超分辨显微成像的横向分辨率，但纵向分辨率可极大提高，从而能够获得更多样品的细节信息。
进一步地，所述步骤(6)中，光斑错位并行扫描是通过液晶空间光调制器加载闪耀光栅的方式获得的，能够降低光路校准难度，且可以对光斑进行泽尼克像差矫正，获得最优光斑。
进一步地，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，通过两个针孔滤除离焦杂散光后，分别利用两个探测器获得实心光斑和空心光斑激发的荧光信号。此外，在针孔前可以放置一滤光片以消除杂散光。样品面与针孔平面共轭，从而使倾斜光和空心光扫描样品并进入针孔内。
进一步地，所述步骤(6)中，针孔可以用多模光纤的端面代替，可以安装四个并排相邻的多模光纤，使用两端的光纤端面接收荧光信号，并用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)探测；而中间两光纤不接探测器，用于更方便的确定两荧光信号的间隔。
进一步地，所述步骤(7)中，荧光辐射差分公式如下：
I(x,y)＝I1(x,y)-γI2(x+Δx,y+Δy)
其中I1(x,y)为共聚焦光强度分布，I2(x+Δx,y+Δy)为移位后的负共聚焦光强度分布，γ为差值系数。
为实现上述方法，本发明提供的成像装置包括：
用于产生激发光的激光器及准直器；
用于产生线偏光的起偏器；
用于调整偏振方向的二分之一波片；
用于使用各半部分分别将线偏光的两个分量调制为涡旋光和倾斜光的液晶空间光调制器；
用于使线偏光的一个分量偏振方向旋转90度的四分之一波片及透镜和反射镜；
用于将两激发光转为圆偏光的四分之一波片和二分之一波片；
用于反射激发光而透射荧光的分光镜；
用于扫描样品的扫描振镜及显微镜架模块；
用于消除杂散光的滤光片；
用于消除离焦杂散光的针孔或多模光纤；
用于分别探测实心光斑和空心光斑的两探测器，本实施例中两探测器相距2-3AU。
以下给出本发明的一个具体实现示例，但不限于此。本示例的基于共路实时荧光辐射差分的超分辨显微成像装置结构如图2所示，包括激光发生和准直装置1、起偏器2、第一反射镜3、第一1/2玻片4、D形镜5、液晶空间光调制器6、第一1/4玻片7、第一透镜8、第二反射镜9、第三反射镜10、第二1/2玻片11、第二1/4玻片12、4f***13、分光镜14、扫描振镜及显微镜架模块15、滤光片16、第二透镜17、第一多模光纤18、第二多模光纤19、第一雪崩二极管20和第二雪崩二极管21。
装置工作时，激光发生和准直装置1产生的激光经过起偏器2后成为线偏光，再由D形镜5反射后以较小的入射角到达液晶空间光调制器6的下半部分。利用液晶空间光调制器仅可调制一个方向偏振光的性质，线偏光的P分量在此处被调制为涡旋光，而S分量未被调制。液晶空间光调制器6的出射光经第一1/4玻片7后到达第二反射镜9，通过第二反射镜9反射回第一1/4玻片7，之后到达液晶空间光调制器6的上半部分；利用第二反射镜9使得入射光两次经过第一1/4玻片7返回至液晶空间光调制器6的上半部分，此时入射光相当于经过一个1/2玻片，从而使得原S分量得以在液晶空间光调制器6的上半部分被调制而倾斜，将光分为两路；两路光分别入射至第二1/2玻片11和第二1/4玻片12成为圆偏光，通过用于中继共轭的4f***13、分光镜14，扫描振镜及显微镜架模块15并行扫描样品后，反向到达分光镜14，此时激发光被反射而荧光信号通过分光镜14后经滤光片16及第二透镜17后导入两多模光纤中，此处多模光纤的端面起到了普通共聚焦显微镜中针孔的作用，两光纤端面的间距和光斑间距相对应。最终荧光信号被两个雪崩二极管探测，再经后续算法处理实现超分辨成像。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何的简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将激光器发出的激光光束准直后利用起偏器转为线偏光，这一线偏光包含S分量和P分量；
(2)调节液晶空间光调制器的出射平面与显微物镜入瞳共轭；使用液晶空间光调制器的一半部分，利用0-2π涡旋相位调制，调制步骤(1)线偏光中平行于调制偏振方向的偏振分量，而对垂直于调整偏振方向的偏振分量不做调制；
(3)液晶空间光调制器的出射光经四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回同一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的另半部分；
(4)将液晶空间光调制器的另半部分加载为闪耀光栅，从而使线偏光未被调制的分量被调制而倾斜，根据光栅方程，通过调整光栅常数计算倾角，使得最终实心光斑和空心光斑在物面上错开；
(5)将空间光调制器的另半部分出射的两路光转为圆偏光；
(6)两路圆偏光在样品面上呈现错开的实心光斑和空心光斑，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，激发的两路荧光信号分别经过各自的探测光路，由两个探测器接收，从而获得共聚焦光强度分布和负共聚焦光强度分布；
(7)将负共聚焦光强度分布移位后与共聚焦光强度分布对应，根据荧光辐射差分公式，得到超分辨图像。
2.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(1)中，光束通过起偏器后通过一个二分之一波片调整偏振方向；偏振方向应当通过负共聚焦光强度与共聚焦光强度之比来确定，即通过调整偏振方向使此二者强度匹配。
3.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(2)中，线偏光入射液晶空间光调制器前使用一个D形镜转折光路，以减小入射角，改善液晶空间光调制器的性能。
4.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(2)中，液晶空间光调制器对线偏光一个分量的调制不限于将其调制为涡旋光以形成横向空心光斑，也可通过0/π环形相位调制在物面形成纵向空心光斑，这类纵向空心光斑在横向同样具有较弱的空心光斑效果，从而可以实现三维荧光辐射差分超分辨显微成像，其横向分辨率相对弱于横向空心光斑超分辨显微成像的横向分辨率，但纵向分辨率可极大提高，从而能够获得更多样品的细节信息。
5.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，通过两个针孔滤除离焦杂散光后，分别利用两个探测器获得实心光斑和空心光斑激发的荧光信号。
6.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，光斑错位并行扫描是通过液晶空间光调制器加载闪耀光栅的方式获得的，能够降低光路校准难度，且可以对光斑进行泽尼克像差矫正，获得最优光斑。
7.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(6)中，实心光斑和空心光斑同时对样品进行扫描，可以安装四个并排相邻的多模光纤，使用两端的光纤端面接收荧光信号，并用光电倍增管或雪崩光电二极管探测；而中间两光纤不接探测器，用于更方便的确定两荧光信号的间隔。
8.根据权利要求1所述的一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤(7)中，荧光辐射差分公式如下：
I(x,y)＝I1(x,y)-γI2(x+Δx,y+Δy)
其中I1(x,y)为共聚焦光强度分布，I2(x+Δx,y+Δy)为移位后的负共聚焦光强度分布，γ为差值系数。
9.一种基于共路并行荧光辐射差分的超分辨显微成像装置，其特征在于，该装置包括：
用于产生激发光的激光器及准直器；
用于产生线偏光的起偏器；
用于调整偏振方向的第一二分之一波片；
用于使用各半部分分别将线偏光的两个分量调制为涡旋光和倾斜光的液晶空间光调制器；
用于使线偏光的一个分量偏振方向旋转90度的第一四分之一波片及透镜和反射镜；
用于将两激发光转为圆偏光的第二四分之一波片和第二二分之一波片；
用于反射激发光而透射荧光的分光镜；
用于扫描样品的扫描振镜及显微镜架模块；
用于消除杂散光的滤光片；
用于消除离焦杂散光的针孔或多模光纤；
用于分别探测实心光斑和空心光斑的两探测器；
装置工作时，激光器及准直器产生的激光经过起偏器后成为线偏光，再由D形镜反射后到达液晶空间光调制器的下半部分；利用液晶空间光调制器仅可调制一个方向偏振光的性质，线偏光的P分量在此处被调制为涡旋光，而S分量未被调制；液晶空间光调制器的出射光经第一四分之一波片后到达反射镜，通过反射镜反射回第一四分之一波片，之后到达液晶空间光调制器的上半部分；利用反射镜使得入射光两次经过第一四分之一波片返回至液晶空间光调制器的上半部分，此时入射光相当于经过一个二分之一波片，从而使得原S分量得以在液晶空间光调制器的上半部分被调制而倾斜，将光分为两路；两路光分别入射至第二二分之一波片和第二四分之一波片成为圆偏光，通过用于中继共轭的4f***、分光镜、扫描振镜及显微镜架模块并行扫描样品后，反向到达分光镜，此时激发光被反射而荧光信号通过分光镜后经滤光片及透镜后导入两多模光纤中，此处多模光纤的端面起到了普通共聚焦显微镜中针孔的作用，两光纤端面的间距和光斑间距相对应；最终荧光信号被两探测器探测，再经后续算法处理实现超分辨成像。
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