CN112646844A - 一种赖氨酸循环发酵方法和应用 - Google Patents

一种赖氨酸循环发酵方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种赖氨酸循环发酵方法和应用，属于发酵技术领域。本发明提供的赖氨酸循环发酵方法，采用膜偶联细胞循环低盐发酵的方式进行L‑赖氨酸的发酵生产，在发酵前期，培养基中添加低浓度的硫酸铵，缩短谷氨酸棒杆菌生长周期；进入发酵中期，开始流加硫酸铵，同时进行细胞循环，排出发酵清夜，浓缩后的菌体进入发酵罐继续发酵，通过细胞循环发酵，减少了赖氨酸硫酸盐高产物浓度和有害代谢物对菌体的伤害，提高了菌体活力和生产速率；本发明的赖氨酸循环发酵方法还延长了发酵周期，降低了底物消耗，提升了设备利用率，降低了人力成本，同时也减少了下游分离提纯的压力，为下游纯化提供了性质稳定的原材料。

Description

一种赖氨酸循环发酵方法和应用
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种赖氨酸循环发酵方法和应用。
背景技术
L-赖氨酸是人和动物无法合成的八种必需氨基酸之一。它对调节体内代谢平衡，提高体内对谷类蛋白质的吸收，改善膳食营养，促进生长发育均有重要作用。L-赖氨酸主要用于医药、食品和饲料工业。赖氨酸作为最重要的生物技术产品之一，全球市场约220万吨/年，且每年的需求日益增长。由于具有反应条件温和，目标产物特异性好，产率高，且污染少，微生物发酵法已成为工业化生产L-赖氨酸最有前途的过程之一。谷氨酸棒杆菌作为安全菌种(generally regarded as safe(GRAS)strain)，是主要的L-赖氨酸生产菌种。当前，利用微生物发酵法生产L-赖氨酸通常采用分批补料发酵方式，然而这种工艺仍存在一些不足之处，例如：谷氨酸棒状杆菌生长阶段长，高效产酸时间较短，发酵中后期菌活力降低等，使发酵产物的总产量降低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种赖氨酸循环发酵方法和应用。本发明提供的赖氨酸循环发酵方法提高了菌体生长速率，缩短了谷氨酸棒杆菌在生长阶段的时间，延长了菌体高效率产酸的时间，提高了发酵中后期菌体活力和利用率，提高了发酵产物的总产量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种赖氨酸循环发酵方法，包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵；
当发酵液中NH4 +的质量浓度小于3g/L时，以3～5g/(L·h)的流速补加(NH4)2SO4；
当发酵液中葡萄糖的质量浓浓度小于2.0g/L时，流加葡萄糖溶液维持发酵液中葡萄糖的质量浓度为1～2g/L；
当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，进行陶瓷膜循环过滤，得到含有L-赖氨酸的发酵液清液和含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液，收集含有L-赖氨酸的发酵液清液，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送回发酵液中继续发酵，陶瓷膜循环过滤使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L；
当发酵液中L-赖氨酸的产率低于3.0g/(L·h)，停止发酵。
优选的，所述谷氨酸棒杆菌种子液的菌体浓度OD600为25～30；所述谷氨酸棒杆菌种子液的接种量为10％～20％。
优选的，所述种子液制备用培养基包括如下质量浓度的组分：蔗糖5～30g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO40.5～20g/L，乙酸铵0.2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，L-丙氨酸0.1～2g/L，L-谷氨酸0.1～5g/L，FeSO4·7H2O 0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.01g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L，所述种子液的培养基的pH为7.0～7.2。
优选的，所述种子液的培养条件为：培养温度30～36℃，溶氧20％～30％，压力0.02～0.05Mpa，维持种子液的pH维持在7.0～7.2。
优选的，所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖10～80g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO41～20g/L，MgSO4·7H2O 0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，FeSO4·7H2O0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.01g/L，CaCO30.1～10g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L，所述发酵培养基的pH为7.0～7.2。
优选的，所述发酵的培养条件为：培养温度30～36℃，溶氧20％～30％，压力0.02～0.05Mpa，维持发酵液的pH在7.0～7.2。
优选的，所述陶瓷膜的孔径为50～100nm，所述陶瓷膜循环过滤的膜压力为≤0.5MPa。
优选的，补料的添加速度与滤出的滤出液速度相同。
本发明提供了上述技术方案中所述的赖氨酸循环发酵方法在L-赖氨酸生产中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种赖氨酸循环发酵方法，包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵；当发酵液中的NH4 +浓度小于3g/L时，补加(NH4)2SO4；当发酵液中葡萄糖的浓度小于2.0g/L时，流加葡萄糖溶液维持残糖浓度为1～2g/L；当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，使用陶瓷膜进行循环过滤，使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L；当发酵液中L-赖氨酸的产率低于3.0g/(L·h)，停止发酵。本发明的赖氨酸循环发酵方法，采用膜偶联细胞循环低盐发酵的方式进行L-赖氨酸的发酵生产，在发酵前期，培养基中添加低浓度的硫酸铵，缩短谷氨酸棒杆菌生长周期；进入发酵中期，铵根离子降低不足以维持产酸需求时，开始流加硫酸铵，同时进行细胞循环，排出发酵清液，浓缩后的菌体进入发酵罐继续发酵，通过细胞循环发酵，减少了赖氨酸硫酸盐高产物浓度和有害代谢物对菌体的伤害，提高了菌体活力和生产速率；本发明的赖氨酸循环发酵方法还延长了发酵周期，降低了底物消耗，提升了设备利用率，降低了人力成本，同时也减少了下游分离提纯的压力，为下游纯化提供了性质稳定的原材料。
附图说明
图1为发酵罐偶联陶瓷膜循环发酵装置。
具体实施方式
本发明提供了一种赖氨酸循环发酵方法，包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵；
当发酵液中NH4 +的质量浓度小于3g/L时，以3～5g/(L·h)的流速补加(NH4)2SO4；
当发酵液中葡萄糖的质量浓度小于2.0g/L时，流加葡萄糖溶液维持发酵液中葡萄糖的质量浓度为1～2g/L；
当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，进行陶瓷膜循环过滤，得到含有L-赖氨酸的发酵液清液和含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液，收集含有L-赖氨酸的发酵液清液，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送回发酵液中继续发酵，陶瓷膜循环过滤使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L；
当发酵液中L-赖氨酸的产率低于3.0g/(L·h)，停止发酵。
本发明将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵。本发明对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规谷氨酸棒杆菌种类即可，如谷氨酸棒杆菌B253(专利公开号CN110129247A)。
本发明谷氨酸棒杆菌种子液优选进行活化和种子液培养后获得。在本发明中，所述谷氨酸棒杆菌的活化优选将谷氨酸棒杆菌接入活化斜面培养基进行活化培养。在本发明中，所述活化斜面培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖0.1～10g/L，蛋白胨5～15g/L，牛肉膏5～15g/L，酵母粉1～10g/L，NaCl 0.1～2g/L和琼脂15～25g/L；进一步优选包括：葡萄糖1～5g/L，蛋白胨6～10g/L，牛肉膏6～12g/L，酵母粉5～8g/L，NaCl0.5～1g/L和琼脂18～20g/L。在本发明中，所述活化斜面培养基的pH优选为7.0～7.2，进一步优选为7.1。本发明对培养基各组分的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明优选对活化斜面培养基进行灭菌，所述灭菌的条件优选为115～125℃条件下灭菌20～60min，进一步优选为在121℃条件下灭菌20min。在本发明中，所述活化培养的温度优选为30～36℃，进一步优选为32℃。在本发明中，所述活化培养的时间优选为20～24h，进一步优选为22h。
活化培养后，本发明优选将活化后的谷氨酸棒杆菌进行种子培养，得到谷氨酸棒杆菌种子液。在本发明中，所述种子液制备用培养基优选包括如下质量浓度的组分：蔗糖5～30g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO40.5～20g/L，乙酸铵0.2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，L-丙氨酸0.1～2g/L，L-谷氨酸0.1～5g/L，FeSO4·7H2O0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.01g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L；进一步优选包括：蔗糖20g/L，玉米浆20g/L，(NH4)2SO43g/L，乙酸铵2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4·3H2O 2g/L，L-丙氨酸1g/L，L-谷氨酸2g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，MnSO4·H2O 0.005g/L，生物素0.1mg/L，菸酰胺1mg/L，硫胺素mg/L。该培养基(NH4)2SO4含量较低，降低了发酵初始盐浓度，减轻对菌体的抑制，提高初始菌体生长速率。在本发明中，所述种子液的培养基的pH优选为7.0～7.2，进一步优选为7.1。本发明对培养基各组分的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明优选对种子液培养基进行灭菌，所述灭菌的条件优选为115～125℃条件下灭菌20～60min，进一步优选为在121℃条件下灭菌20min。在本发明中，所述种子液培养的温度优选为30～36℃，进一步优选为32℃；所述溶氧(DO)优选为20％～30％，进一步优选为20％；所述压力优选为0.02～0.05Mpa，进一步优选为0.03Mpa。在本发明中，所述种子液的pH优选维持在7.0～7.2，进一步优选在7.1。本发明优选在种子培养过程中流加碱性溶液来维持种子液的pH，所述碱性溶液的种类优选包括氨水或液氨。种子液培养后得到谷氨酸棒杆菌种子液，所述谷氨酸棒杆菌种子液的菌体浓度OD600优选为25～30，进一步优选为25。在本发明中，所述种子液培养过程中优选加入消泡剂，以消除培养过程中的泡沫。
种子液培养后，本发明将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵。在本发明中，所述发酵培养基优选包括如下质量浓度的组分：葡萄糖10～80g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO41～20g/L，MgSO4·7H2O 0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，FeSO4·7H2O0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.01g/L，CaCO30.1～10g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L。；进一步优选包括：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4·3H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O0.005g/L，CaCO32g/L，生物素0.1mg/L，菸酰胺1mg/L，硫胺素1mg/L。在本发明中，所述发酵培养基的pH值优选为7.0～7.2，进一步优选为7.1。本发明对培养基各组分的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。本发明优选对发酵培养基进行灭菌，所述灭菌的条件优选为115～125℃条件下灭菌20～60min，进一步优选为在121℃条件下灭菌20min。在本发明中，所述CaCO3优选单独灭菌。在本发明中，所述谷氨酸棒杆菌种子液的接种量优选为10％～30％，进一步优选为20％。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30～36℃，进一步优选为32℃；所述发酵培养的溶氧的浓度优选为20％～30％，进一步优选为20％；所述发酵培养的压力优选为0.02～0.05Mpa，进一步优选为0.03Mpa。在本发明中，所述发酵液的pH优选维持在7.0～7.2，进一步优选在7.1。本发明优选在发酵培养过程中流加碱性溶液来维持发酵液的pH，所述碱性溶液的种类优选包括氨水或液氨。在本发明中，所述发酵培养过程中优选加入消泡剂，以消除培养过程中的泡沫。本发明培养基中保持较低浓度硫酸根、铵根等，降低了培养环境渗透压，减少了对菌体生长的抑制作用，提高了发酵前期菌体的生长速率，使谷氨酸棒杆菌提前进入赖氨酸产酸期。
在本发明中，当发酵液中NH4 +的质量浓度小于3g/L时，以3～5g/(L·h)的流速补加(NH4)2SO4，进一步优选为4g/(L·h)。硫酸铵主要为菌体提供生长所需要的氮源，为生产赖氨酸氨基的来源，本发明通过连续补加(NH4)2SO4，既解决了高浓度的铵根离子对菌体的抑制作用，又满足了菌体生长的需要。
在本发明中，当发酵液中葡萄糖的质量浓度小于2.0g/L时，流加葡萄糖溶液维持发酵液中葡萄糖的质量浓度为1～2g/L，进一步优选为1.5g/L。在本发明中，所述葡萄糖溶液的质量体积百分含量为50％～90％，进一步优选为80％。本发明通过流加葡糖糖，在发酵过程中控制残糖浓度，降低了高浓度葡萄糖的抑制作用，同时，由于葡萄糖浓度较低，在发酵的同时进行过滤透析，减少葡萄糖的损失。
在本发明中，当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，进行陶瓷膜循环过滤，得到含有L-赖氨酸的发酵液清液和含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液，收集含有L-赖氨酸的发酵液清液，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送回发酵液中继续发酵，陶瓷膜循环过滤使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L。在本发明中，当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，进一步优选为140g/L时进行陶瓷膜循环过滤。在本发明中，所述陶瓷膜的孔径优选为50～100nm，进一步优选为50nm；所述陶瓷膜循环过滤的膜压力优选为≤0.5MPa，进一步优选为0.4MPa。本发明所述陶瓷膜过滤阻力低，可将发酵液中的蛋白质等杂质透过陶瓷膜排除。本发明陶瓷膜过滤后得到含有L-赖氨酸的发酵液清液和含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液，本发明将得到的含有L-赖氨酸的发酵液清液进行收集，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送回发酵液中继续发酵，使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L，进一步优选在125g/L。本发明优选通过改变进入陶瓷膜过滤速率和流加培养基的速率，控制流加无菌水来维持发酵液中L-赖氨酸的浓度，所述无菌水的流加速度优选为0.2～0.8L/h，进一步优选为0.6L/h。在本发明中，补料的添加速度优选与滤出的滤出液速度相同，以保持发酵液的体积保持不变。本发明采用陶瓷膜过滤透析，维持赖氨酸的浓度为120～130g/L，把赖氨酸及其盐过滤排除，解除了高浓度赖氨酸及盐的反馈抑制，同时提高了物料混合速率和溶氧效果，提高了发酵中后期的菌体活力和糖酸转化率；菌体浓缩液进入发酵罐进行再次发酵，实现菌体循环利用，降低发酵副产物，延长赖氨酸高产率发酵时间，提高底物转化效率，降低生产成本；另外，陶瓷膜过滤透析后，得到的含有L-谷氨酸的发酵液上清液杂质含量低，进入提取工序后，降低了提取难度，提高了提取效率，提升了产品质量。
本发明所述的赖氨酸循环发酵方法优选采用图1的发酵罐偶联陶瓷膜循环发酵装置进行。在本发明中，所述发酵罐偶联陶瓷膜循环发酵装置把陶瓷膜和发酵罐偶联一体，能够进行无菌过滤；且整个***能够独立灭菌，实现流加发酵的同时，还能够进行膜过滤透析；离心泵采用耐高温垫圈密封，利用蒸汽对膜***灭菌后，用无菌空气保压，循化过滤过程，实现降温处理，保证菌体的活力；通过膜过滤透析，把发酵产物和盐分过滤除去，截留的菌体回到发酵罐继续发酵，实现菌体循环利用，降低发酵副产物，延长赖氨酸高产率发酵时间，提高底物转化效率，降低生产成本。
本发明提供了上述技术方案中所述的赖氨酸循环发酵方法或上述技术方案中所述的装置在L-赖氨酸生产中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种赖氨酸循环发酵方法、装置和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种赖氨酸循环发酵方法：
(1)活化斜面种子培养：将谷氨酸棒杆菌B253甘油管接入活化斜面，32℃培养22h；再次接入活化斜面，32℃培养20h；活化斜面培养基：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂25g/L，pH7.1，121℃灭菌20min。
(2)种子罐种子培养：5L种子罐培养种子，装液量为3.2L种子液，将步骤(1)培养的二代活化斜面菌体接种至种子培养基培养，培养温度32℃，自动流加氨水使pH维持在7.1，溶氧(DO)维持在25％时，使用消泡剂消除泡沫，罐压为0.04Mpa；种子培养基(g/L)：蔗糖25.0g/L，玉米浆8g/L，(NH4)2SO42.0g/L，乙酸铵6.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4·3H2O1.0g/L，L-丙氨酸0.35g/L，L-谷氨酸0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.00005g/L，菸酰胺0.005g/L，硫胺素0.0002g/L，pH7.1，121℃灭菌20min。
(3)发酵培养：利用30L发酵罐进行发酵培养，发酵初始装液量为15L，将种子培养至菌体浓度OD600nm达到28时，以20％接种量3L接种至发酵培养基培养，培养温度32℃，自动流加氨水使pH维持在7.1，搅拌转速根据溶氧调整，最大为800rpm，通风比根据溶氧调整，最大为1.5，调节通风比和转速控制DO维持在25％时，使用消泡剂消除泡沫，罐压为0.04Mpa。
(4)发酵过程中，每隔2h取样，测定菌体浓度、葡萄糖浓度、L-赖氨酸浓度、NH4 +浓度。菌体浓度通过分光光度计测定600nm光吸收OD600测定；葡萄糖浓度通过SBA-40C生物传感仪测定；发酵过程中，L-赖氨酸浓度通过纸层析(TLC)比色法测定，发酵终点L-赖氨酸浓度通过高效液相色谱(HPLC)测定；NH4 +浓度通过甲醛法测定。
(5)当发酵液中NH4 +浓度小于3g/L时，以4g/(L·h)的流速补加(NH4)2SO4；当发酵液中葡萄糖的浓度小于1.0g/L时，流加质量体积百分数为80％葡萄糖溶液维持残糖浓度为1～2g/L；
(6)发酵至16h，当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120g/L时，开启陶瓷膜(膜孔径100nm)进行循环过滤，收集过滤后的含有L-赖氨酸的发酵液清液，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送至发酵液中继续发酵，进出膜压力分别为0.3MPa和0.45MPa，同时调整补料速度使其与滤出速度保持一致。通过改变进入陶瓷膜过滤速率和流加培养基的速率，控制流加0.6L/h无菌水维持发酵液中赖氨酸的浓度为125g/L；当发酵液L-赖氨酸的产率低于3.0g/(L·h)，停止发酵。
本实施例的赖氨酸循环发酵方法，发酵72h结束，菌体浓度OD为71.0g/L，发酵液中硫酸根浓度为96g/L，平均产酸速率为7.1g/(L·h)，糖酸转化率为76.2％。本实施例的菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对比例1分别提高38.1％、26.8％和14.2％。
实施例2
一种赖氨酸循环发酵方法：
与实施例1相同，不同之处在于：当发酵至21h，发酵液中L-赖氨酸浓度达到152g/L时，开启陶瓷膜进行循环过滤。
本实施例的赖氨酸循环发酵方法，发酵70h结束，菌体浓度OD为69.3g/L，发酵液中硫酸根浓度为94g/L，平均产酸速率为6.9g/(L·h)，糖酸转化率为75.7％。本实施例的菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对比例1分别提高34.8％、23.2％和13.5％。
实施例3
一种赖氨酸循环发酵方法：
与实施例1相同，不同之处在于：当发酵至26h，发酵液中L-赖氨酸浓度达到184g/L时，开启陶瓷膜进行循环过滤。
本实施例的赖氨酸循环发酵方法，发酵70h结束，菌体浓度OD为67.1g/L，发酵液中硫酸根浓度为97g/L，平均产酸速率为6.7g/(L·h)，糖酸转化率为75.2％。本实施例的菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对比例1分别提高30.5％、19.6％和12.7％。
实施例4
一种赖氨酸循环发酵方法：
与实施例1相同，不同之处在于：当发酵至31h，发酵液中L-赖氨酸浓度达到214g/L时，开启陶瓷膜进行循环过滤。
本实施例的赖氨酸循环发酵方法，发酵70h结束，菌体浓度OD为62.0g/L，发酵液中硫酸根浓度为96g/L，平均产酸速率为6.4g/(L·h)，糖酸转化率为74.9％。本实施例的菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对比例1分别提高20.6％、14.3％和12.3％。
实施例5
一种赖氨酸循环发酵方法：
与实施例1相同，不同之处在于：当发酵至36h，发酵液中L-赖氨酸浓度达到241g/L时，开启陶瓷膜进行循环过滤。
本实施例的赖氨酸循环发酵方法，发酵70h结束，菌体浓度OD为56.9g/L，发酵液中硫酸根浓度为93g/L，平均产酸速率为6.2g/(L·h)，糖酸转化率为74.5％。本实施例的菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对比例1分别提高10.7％、10.7％和11.7％。
对比例1
一种赖氨酸发酵方法：
与实施例1相同，不同之处在于：不进行膜分离和谷氨酸棒杆菌循环发酵。
该赖氨酸发酵方法，发酵38h结束，菌体浓度OD为51.4g/L，发酵液中硫酸根浓度为183g/L，平均产酸速率为5.6g/(L·h)，糖酸转化率为66.7％。
由上述实施例的结果可知，本发明提供的赖氨酸循环发酵方法提高了菌体生长速率，缩短了谷氨酸棒杆菌在生长阶段的时间，延长了菌体高效率产酸的时间，提高了发酵中后期菌体活力和利用率，提高了发酵产物的总产量，其中菌体浓度、平均产酸速率和糖酸转化率比对照分别提高了10.7％～38.1％、10.7％～26.8％和11.7％～14.2％。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌种子液接种到发酵培养基进行发酵；
当发酵液中NH4 +的质量浓度小于3g/L时，以3～5g/(L·h)的流速补加(NH4)2SO4；
当发酵液中葡萄糖的质量浓度小于2.0g/L时，流加葡萄糖溶液维持发酵液中葡萄糖的质量浓度为1～2g/L；
当发酵液中L-赖氨酸浓度达到120～260g/L时，进行陶瓷膜循环过滤，得到含有L-赖氨酸的发酵液清液和含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液，收集含有L-赖氨酸的发酵液清液，将含有谷氨酸棒杆菌的菌体浓缩液送回发酵液中继续发酵，陶瓷膜循环过滤使发酵液中L-赖氨酸的浓度维持在120～130g/L；
当发酵液中L-赖氨酸的产率低于3.0g/(L·h)，停止发酵。
2.根据权利要求1所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌种子液的菌体浓度OD600为25～30；所述谷氨酸棒杆菌种子液的接种量为10％～20％。
3.根据权利要求2所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述种子液制备用培养基包括如下质量浓度的组分：蔗糖5～30g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO40.5～20g/L，乙酸铵0.2～10g/L，MgSO4·7H2O0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，L-丙氨酸0.1～2g/L，L-谷氨酸0.1～5g/L，FeSO4·7H2O 0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.01g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L，所述种子液的培养基的pH为7.0～7.2。
4.根据权利要求2所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述种子液的培养条件为：培养温度30～36℃，溶氧20％～30％，压力0.02～0.05Mpa，维持种子液的pH维持在7.0～7.2。
5.根据权利要求1所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖10～80g/L，玉米浆5～50g/L，(NH4)2SO41～20g/L，MgSO4·7H2O 0.1～3g/L，KH2PO4·3H2O 0.5～5g/L，FeSO4·7H2O 0.001～0.02g/L，MnSO4·H2O0.001～0.01g/L，CaCO30.1～10g/L，生物素0.01～2mg/L，菸酰胺0.01～2mg/L，硫胺素0.01～2mg/L，所述发酵培养基的pH为7.0～7.2。
6.根据权利要求1所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述发酵的培养条件为：培养温度30～36℃，溶氧20％～30％，压力0.02～0.05Mpa，维持发酵液的pH在7.0～7.2。
7.根据权利要求1所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为50～100nm，所述陶瓷膜循环过滤的膜压力为≤0.5MPa。
8.根据权利要求1所述的赖氨酸循环发酵方法，其特征在于，补料的添加速度与滤出的滤出液速度相同。
9.权利要求1～8所述的赖氨酸循环发酵方法在L-赖氨酸生产中的应用。
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