CN109943604A - 一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于谷氨酸生产技术领域,公开了一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法,其包括如下步骤:步骤1)制备谷氨酸棒杆菌种子液,步骤2)分批发酵,步骤3)提取谷氨酸。本发明方法提高了谷氨酸发酵转化率和提取率。
Description
技术领域
本发明属于谷氨酸生产技术领域,涉及一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法。
背景技术
谷氨酸,是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基,化学名称为α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的,为无色晶体,有鲜味,微溶于水,而溶于盐酸溶液,等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中,动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位,参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。谷氨酸钠俗称味精,是重要的鲜味剂,对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂,既可单独使用,又能与其它氨基酸等并用。用于食品内,有增香作用。在食品中浓度为0.2%-0.5%,每人每天允许摄入量(ADl)为0-120微克/千克(以谷氨酸计)。在食品加工中一般用量为0.2—1.5克/公斤。
谷氨酸棒杆菌是谷氨酸发酵的菌株,属于兼性好氧菌,培养基成分及培养条件不同,产物也不同,谷氨酸发酵条件优化主要为培养基组分和发酵过程参数控制优化两方面。在发酵过程中,菌种自身的发酵特性有时会发生变化,导致批次间发酵性能出现巨大差异。一旦菌种发酵特性发生改变,菌体对环境变化的适应能力和产酸能力就会下降,表现为补料之后出现“只耗糖、不产酸”的现象,最终谷氨酸浓度很低,造成发酵性能不稳定。谷氨酸发酵的前期主要菌株增殖迅速,中后期菌株增殖速度放缓,但是谷氨酸合成加快,是合成分泌谷氨酸的关键时期,即,从积累型到产酸型菌株转换。
申请人之前的专利技术“一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法” 其包括如下步骤:在发酵过程中添加肌醇和二甲基甲酰胺,并且采用超声波处理,其通过添加适量的二甲基甲酰胺,使得菌体的细胞膜通透性增强,有利于底物分子更容易进入细胞与生物酶接触,进而提高转化率;适量的肌醇可以强化CO2 固定反应, 促进谷氨酸的积累,提高发酵转化率。在该研究的基础上,阜丰集团继续对发酵转化率和提取率进行了研究,旨在进一步优于谷氨酸生产技术。
发明内容
为了克服现有技术菌株的产酸效率进行进一步地提升,本发明提出了一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的:
一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法,其包括如下步骤:
步骤1)制备谷氨酸棒杆菌种子液,步骤2)分批发酵,步骤3)提取谷氨酸。
进一步地,所述分批发酵为膜偶联透析分批发酵。
进一步地,所述步骤2)分批发酵,包括:
将谷氨酸棒杆菌种子液以6-10%接种量接种接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养,发酵温度33℃,通气量为0.4vvm,搅拌转速500r/min,将发酵罐与陶瓷膜偶联,发酵至12h时,添加1-2g/L的肌醇和0.5-1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐,把浓缩菌体打回发酵罐,同时向发酵罐中补加发酵罐培养基,继续发酵12h,再添加1-2g/L的肌醇和0.5-1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,完成发酵,得到发酵液,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐。
进一步地,所述发酵罐培养基的组分为(质量百分比):葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸亚铁0.02%、一水硫酸锰0.01%、黄腐酸0.002%。
进一步地,所述陶瓷膜的截留分子量为10000-20000Da。
进一步地,所述步骤3)提取谷氨酸,包括:料液储罐中的液体经过超滤膜超滤,收集滤过液,然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液;往一级等电罐中流加上述浓缩液,同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5,温度控制在22℃,经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,二级等电点罐pH控制3.3,温度10℃;经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,三级等电点罐pH控制3.2,温度5℃;离心获得结晶的谷氨酸,烘干即得。
优选地,所述超滤膜截留分子量为300Da。
优选地,所述步骤1)制备谷氨酸棒杆菌种子液,包括如下:
将谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中,在33℃,100rpm摇床培养12h,得到的谷氨酸棒杆菌种子液。
优选地,所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比):葡萄糖6%、玉米浆3%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.02%、一水硫酸锰0.01%,115℃灭菌15min。
本发明还要求保护上述方法生产的谷氨酸产品。
与现有技术相比,本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面:
本发明采用膜偶联透析分批发酵使用,减少发酵过程中副产物乙酸、乳酸等物质的产生,提高了发酵效率,并且氨基酸发酵液透明度高,杂质少,分离提取更为简易,后期更容易获得纯度高的产品。
黄腐酸中含有大量酚羟基、羰基等基团,电解程度较高,能够促进谷氨酸合成过程中利用O2作为氢受体,进而减少丙酮酸作为氢受体,发酵培养基中添加适量的黄腐酸,能够降低副产物乳酸和乙酸的生成量,进而提高谷氨酸的产量;
肌醇可以强化CO2 固定反应, 削弱乙醛酸循环, 保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸,通过还原氨基化反应,大量积累谷氨酸,提高发酵转化率;
碳酸镁添加时间为发酵中期,细胞由积累型进入分泌产酸型,碳酸镁能够与副产物乳酸、乙酸反应,分解产生二氧化碳,既能提供二氧化碳,使CO2含量处于既维持菌体正常呼吸作用,又确保更多的CO2固定生成草酰乙酸与乙酰-CoA合成柠檬酸,提供合成谷氨酸所必需的C4二羧酸,提高发酵转化率;碳酸镁与乙酸、乳酸等副产物反应,减少了对菌株的毒害,提高了发酵效率;镁离子是菌株合成谷氨酸过程中多种酶的激活剂,能够刺激菌株生长和产酸;
本发明在发酵中期添加肌醇和碳酸镁,提高了发酵效率。
本发明提取工艺中,采用超滤膜超滤浓缩和浓缩等电技术,操作简单,通过分离纯化工艺使得谷氨酸纯度为90%以上,收率为95%以上。
附图说明
图1:本发明发酵流程的示意图;
图2:膜偶联透析发酵对菌体生物量的影响;
图3:各因素对糖酸转化率的影响;
图4:各因素对谷氨酸产量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合本申请具体实施例,对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法,其包括如下步骤:
将谷氨酸棒杆菌ATCC13761接种到种子培养基中,在33℃,100rpm摇床培养12h,得到的谷氨酸棒杆菌种子液;所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比):葡萄糖6%、玉米浆3%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.02%、一水硫酸锰0.01%,115℃灭菌15min;
将谷氨酸棒杆菌种子液以10%接种量接种接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养,发酵温度33℃,通气量为0.4vvm,搅拌转速500r/min,将发酵罐与陶瓷膜偶联,发酵至12h时,添加2g/L的肌醇和1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐,把浓缩菌体打回发酵罐,同时向发酵罐中补加发酵罐培养基,使与未经离心泵处理之前的发酵液体积相同,继续发酵12h,再添加2g/L的肌醇和1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,完成发酵,得到发酵液,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐;整个发酵过程中,通过流加泡敌消泡,同时流加氨水控制发酵液的pH值至6.0,流加葡萄糖溶液控制残糖量不低于1%;陶瓷膜的截留分子量为20000Da;
所述发酵罐培养基的组分为(质量百分比):葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸亚铁0.02%、一水硫酸锰0.01%、黄腐酸0.002%;
料液储罐中的液体经过超滤膜超滤(超滤膜截留分子量为300Da),收集滤过液,然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液;往一级等电罐中流加上述浓缩液,同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5,温度控制在22℃,经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,二级等电点罐pH控制3.3,温度10℃;经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,三级等电点罐pH控制3.2,温度5℃;离心获得结晶的谷氨酸,烘干即得。
实施例2
一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法,其包括如下步骤:
将谷氨酸棒杆菌ATCC13761接种到种子培养基中,在33℃,100rpm摇床培养12h,得到的谷氨酸棒杆菌种子液;所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比):葡萄糖6%、玉米浆3%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.02%、一水硫酸锰0.01%,115℃灭菌15min;
将谷氨酸棒杆菌种子液以8%接种量接种接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养,发酵温度33℃,通气量为0.4vvm,搅拌转速500r/min,将发酵罐与陶瓷膜偶联,发酵至12h时,添加1g/L的肌醇和0.5g/L的碳酸镁,继续发酵12h,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐,把浓缩菌体打回发酵罐,同时向发酵罐中补加发酵罐培养基,使与未经离心泵处理之前的发酵液体积相同,继续发酵12h,再添加1g/L的肌醇和0.5g/L的碳酸镁,继续发酵12h,完成发酵,得到发酵液,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐;整个发酵过程中,通过流加泡敌消泡,同时流加氨水控制发酵液的pH值至5.5,流加葡萄糖溶液控制残糖量不低于1%;陶瓷膜的截留分子量为10000Da;
所述发酵罐培养基的组分为(质量百分比):葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸亚铁0.02%、一水硫酸锰0.01%、黄腐酸0.002%;
料液储罐中的液体经过超滤膜超滤(超滤膜截留分子量为300Da),收集滤过液,然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液;往一级等电罐中流加上述浓缩液,同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5,温度控制在22℃,经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,二级等电点罐pH控制3.3,温度10℃;经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,三级等电点罐pH控制3.2,温度5℃;离心获得结晶的谷氨酸,烘干即得。
实施例3
分析方法
菌体含量测定:OD600nm。
谷氨酸测定:采用SBA-40C多功能谷氨酸-葡萄糖分析仪测定。
残糖测定:用斐林法测定。
pH值测定:采用pH电极测定。
对照组采用常规发酵方式,培养基和参数均与实验组(实施例1)一致,发酵时间为36h。
膜偶联透析发酵对菌体生物量的影响
在谷氨酸发酵生产过程中,菌体量和产酸也存在紧密的关系,相对较高的菌体量能够分泌更多的谷氨酸。由图2可知,在进行透析发酵(24h开始透析)之前的24h内,常规发酵和透析发酵的OD600nm值不断增加,到发酵18h达到最大值(53左右)。对于对照发酵而言,18h后OD600nm开始缓慢下降,24h后则快速下降,其原因主要是营养物的缺乏和有毒害代谢产物的抑制作用。与此相对应的透析发酵则完全相反,随着透析的进行,毒害物质的移除和营养物的添加,使得菌体开始增长,菌体的OD600nm值又开始不断增加至36h达到最大(63.7),之后开始缓慢下降至发酵结束。由此可见,透析发酵对代谢毒害物质等的分离和营养物质的添加,能够有效的提高菌体的生长活力,增加菌体量。通过计算谷氨酸的产量,透析发酵为154.3g/L,而常规发酵为133.6g/L,提高了15.5个百分点。
实施例4
各因素对转化率和谷氨酸产量的影响:
设置对照组,其中:
对照,1:发酵过程中不添加肌醇和碳酸镁,其余同实施例1;
对照2:发酵过程中不添加碳酸镁,其余同实施例1;
对照3:发酵培养基不添加黄腐酸,其余同实施例1;
实验组为实施例1。各组转化率和谷氨酸浓度见图3-4,与对照1-3相比,实验组的糖酸转化率和谷氨酸产量均达到最高。发酵培养基中添加适量的黄腐酸,能够降低副产物乳酸和乙酸的生成量,进而提高谷氨酸的产量;而肌醇可以强化CO2 固定反应, 与碳酸镁相互协同,可以提高糖酸转化率,减少副产物对菌株的毒害,提高谷氨酸产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高谷氨酸发酵转化率和提取率的方法,其包括如下步骤:
步骤1)制备谷氨酸棒杆菌种子液,步骤2)分批发酵,步骤3)提取谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述分批发酵为膜偶联透析分批发酵。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤2)分批发酵,包括:
将谷氨酸棒杆菌种子液以6-10%接种量接种接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养,发酵温度33℃,通气量为0.4vvm,搅拌转速500r/min,将发酵罐与陶瓷膜偶联,发酵至12h时,添加1-2g/L的肌醇和0.5-1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐,把浓缩菌体打回发酵罐,同时向发酵罐中补加发酵培养基,继续发酵12h,再添加1-2g/L的肌醇和0.5-1g/L的碳酸镁,继续发酵12h,完成发酵,得到发酵液,将发酵罐中的发酵液经由离心泵泵出,然后经陶瓷膜分离,得到滤液和浓缩菌体,将滤液排入到料液储罐。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基的组分为(质量百分比):葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸亚铁0.02%、一水硫酸锰0.01%、黄腐酸0.002%。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述陶瓷膜的截留分子量为10000-20000Da。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤3)提取谷氨酸,包括:料液储罐中的液体经过超滤膜超滤,收集滤过液,然后浓缩成原体积三分之一的浓缩液;往一级等电罐中流加上述浓缩液,同时加入浓硫酸调节使等电罐中溶液的pH为3.5,温度控制在22℃,经过一级等电点罐的液体再依次经过二级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,二级等电点罐pH控制3.3,温度10℃;经过二级等电点罐的液体再依次经过三级等电点罐,同时加入浓硫酸调pH值,其中,三级等电点罐pH控制3.2,温度5℃;离心获得结晶的谷氨酸,烘干即得。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述超滤膜截留分子量为300Da。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤1)制备谷氨酸棒杆菌种子液,包括如下:
将谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中,在33℃,100rpm摇床培养12h,得到的谷氨酸棒杆菌种子液。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比):葡萄糖6%、玉米浆3%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.02%、一水硫酸锰0.01%,115℃灭菌15min。
10.按照权利要求1-9所述的方法生产的谷氨酸产品。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190628 |
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