CN112630344B - 代谢标志物在脑梗死中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了代谢标志物在脑梗死中的用途，本发明通过收集脑梗死患者以及健康对照的血液样本，进行代谢组学分析，发现在两个群组中呈现显著性差异的代谢物，从而利用该代谢物预测早期脑梗死，进而实现患者的早治疗。

Description

代谢标志物在脑梗死中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及代谢标志物在脑梗死中的用途。
背景技术
脑梗死(Cerebral infarction,CI)即为缺血性脑卒中，约占脑卒中80％，主要由血管、遗传及生活方式等多种危险因素共同作用的疾病(Das S,Kaul S,Jyothy A,etal.Association of APOE(E2,E3 and E4)gene variants and lipid levels inischemic stroke,its subtypes and hemorrhagic stroke in a South Indianpopulation[J].Neurosci Lett,2016,628:136-141.)。研究表明我国脑卒中的发病率、致死率在全世界范围排名第一，占全世界脑卒中1/3(Wang W,Jiang B,Sun H,etal.Prevalence,Incidence,and Mortality of Stroke in China:Results from aNationwide Population-Based Survey of 480 687Adults[J].Circulation,2017,135(8):759-771.)。尽管脑梗死患者规律服用抗血小板聚集、抗凝及稳定斑块药物和控制血压、血糖、血脂等一系列脑卒中二级预防，但是脑梗死复发率仍然很高，其1年内复发率达32％(邬午龙，宋则周，张艳明，等.超声造影评估颈动脉斑块新生血管分级预测脑梗死再发的Logistic回归模型分析[J].中华医学超声杂志(电子版)，2018,15(01):43-47.)，而脑梗死复发较初发脑梗死死亡率更高，预后更差，且遗留了更加严重的神经功能障碍(李凤，陈明，喻明，等.MMP-2基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死初发及复发相关性研究[J].中风与神经疾病杂志，2015,32(02):104-107.)。对于如此高发病率、复发率、死亡率及致残率的疾病，目前大多数研究认为在脑梗死早期做出诊断，将会使脑梗死患者及时得到有效救治，降低脑梗死的死亡率及病残率。
代谢组学(metabonomics)是研究生物体系受刺激或扰动后其代谢产物-内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。生命机体在病证状态和各类药物作用下，亦同样会引起全身水平的内源性代谢物及代谢网络变化。运用代谢组学技术考察和分析这些代谢物的变化，对于探究病证本质，阐明药物作用机理有极大的助益。
在本发明中，我们收集了脑梗死患者和年龄性别相匹配的健康对照的血液，采用非靶向联合靶向代谢组方法对血清代谢组进行定性定量分析。通过对OPLS-DA监督聚类分析，差异倍数分析和T检验分析，筛选出潜在的代谢物标志物，进一步数据分析发现代谢标志物对两个群组具有很好的区分，具有良好的临床应用前景。
发明内容
代谢组学是基因组学、蛋白质组学和转录组学下游的新兴研究领域。人体中有40,000多种代谢物，其浓度可提供个体当前健康状况的快照。代谢组是由代谢产生的低分子量化合物(诸如代谢底物和产物、脂质、小肽、维生素和其它蛋白质辅助因子)的定量集合。代谢组处于转录组和蛋白质组的下游，因此从正常状态发生的任何变化都会被放大，并且在数值上更易于处理。代谢组学可以是检查和描述细胞生长、维持和功能的精确、一致和定量的工具。
为了评估代谢物与脑梗死之间的相关性，通过收集健康对照与脑梗死的样品，综合分析样品的代谢组学，筛选在两个群组中含量呈现显著性差异的代谢物，并进一步分析差异代谢物的诊断效能，从而发现适于脑梗死诊断和治疗的代谢标志物。
具体地，本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了代谢标志物在制备早期诊断脑梗死的产品中的应用，所述代谢标志物包括Cer(d18:0/14:0)。
进一步，所述产品包括检测样品中代谢标志物水平的试剂。
进一步，所述试剂通过以下的一种或多种方法检测代谢标志物水平：色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法。
进一步，所述色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法。
所述光谱法包括核磁共振光谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法。
所述化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法。
所述质谱法包括串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF和ESI-离子阱TOF，以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。
所述串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列。
优选地，所述质谱法选自液相色谱质谱法，液相色谱质谱法结合了液相色谱法(LC)或高效液相色谱法(HPLC)的物理分离能力与质谱法(MS)的质量分析能力。HPLC提供超过LC的优点，其具有分析物的较短分析时间和较好分辨率。因此而增加了MS的选择性、精度和准确性。
优选地，如果使用质谱法，则通过参考内部代谢物标准物(standard)确定代谢物的量。任何分子离子种类(molecular ion species)的丰度通常携带关于浓度的信息，但离子丰度被许多特征混淆，包括仪器响应因子、分子的电离效率、分子离子种类的稳定性和其他可引起所关注分析物的离子抑制分子的存在。因此，已开发可以用于产生适当的校正曲线以将离子丰度转换为代谢物的量的定量测量的内部标准物。内部标准物的非限制性实例包括：标记有待定量代谢物的稳定同位素标记版本的代谢物标准物，其具有类似的提取回收率、电离响应和类似的色谱保留时间；待定量的代谢物的化合物类似物，其类似于待定量化合物、但母体质量略有不同；或待定量的代谢物的氯化版本，其通常具有类似的色谱保留时间。
在样品制备的开始时，通常在样本制备或固相萃取之前，通常以已知浓度将内部标准物添加到每个样品中，包括标准物。本领域技术人员应当理解，内部标准物的量需要高于定量的极限但足够低以避免抑制分析物的电离。基于存在于样品中的内部标准物的已知浓度，可以通过将代谢物和内部标准物之间的响应比(response ratio)内插到标准曲线来定量所关注代谢物的测量值。
优选地，内部代谢物标准物是稳定同位素标记的标准物。如已知的，同位素的背景下的稳定是指，该同位素是非放射性的，即它们不自发衰减。用稳定同位素标记的代谢物标准物是待定量的代谢物的稳定同位素标记的版本，并且是本领域中公知的。通常，所采用的同位素是碳、氮或氢的稳定同位素，如12C和13C、14N和15N以及2H(氘)。
在本发明中，语“样品”是指生物样品，如例如细胞、组织(来自任何器官)或流体(包括血清、血浆、全血)，其已分离自或获自个体或从包括受试者的细胞的细胞培养物的细胞培养组分。可以根据本发明的方法将从包括细胞的患者和/或受试者获得的任何组织或液体样品用于一种或多种代谢物的量的评估。根据本发明的方法评估代谢物的量的优选样品是血液、血清和/或血浆。
本发明提供了一种诊断脑梗死的产品，所述产品包括检测样品中代谢标志物Cer(d18:0/14:0)水平的试剂。
进一步，所述试剂通过以下的一种或多种方法检测代谢物水平：色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法。
进一步，所述产品还包括处理样品的试剂。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片。
作为一种可选择的实施方式，试剂盒的组分可以被包装在一个或多个容器如一个或多个小瓶中。除了代谢物标准物，试剂盒优选进一步包括用于存储的防腐剂或缓冲剂。此外，试剂盒可以包含使用说明书。
作为一种可选择的实施方式，芯片具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种代谢物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样品中Cer(d18:0/14:0)的含量或浓度；如上所述，在患有脑梗死的受试者的样品中发现该代谢物的水平增加。芯片可被配置成使得仅当该代谢物的含量或浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示健康受试者的代谢物浓度与指示患有或易患脑梗死的代谢物的含量或浓度。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样品包含显著增加水平的该代谢物，表明受试者患有或易患脑梗死。
本发明提供了Cer(d18:0/14:0)在构建预测脑梗死计算模型中的应用，所述计算模型以Cer(d18:0/14:0)的水平作为输入变量。
本发明提供了Cer(d18:0/14:0)在制备治疗脑梗死的药物中的应用。
进一步，所述药物包括Cer(d18:0/14:0)的抑制剂，所述抑制剂降低Cer(d18:0/14:0)的水平。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了与脑梗死相关的代谢物标志物，所述代谢物标志物为Cer(d18:0/14:0)，该标志物作为检测变量区分脑梗死与健康对照组具有较高的准确性(AUC>0.9)，基于上述发现，通过检测代谢标志物的水平，可以判断受试者是否患有脑梗死以及患脑梗死的风险，进而实现脑梗死早期的诊断，从而在脑梗早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。
附图说明
图1是各组色谱总离子流图，其中，图A是反向色谱正离子各组总离子流图，图B是反向色谱负离子各组总离子流图，图C是亲水色谱正模式各组总离子流图；图A、B、C中的上部分为脑梗死的总离子流图，下部分为健康对照的总离子流图。
图2是OPLS-DA统计分析图，其中图A是反向色谱正离子统计分析图；图B是反向色谱负离子统计分析图；图C是亲水色谱正离子统计分析图。
图3是Cer(d18:0/14:0)在不同群组中的水平图。
图4是以Cer(d18:0/14:0)作为检测变量的诊断效能图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例 脑梗死相关代谢物的筛选及效能判断
1、样本收集
收集21例脑梗死患者及18例健康对照的血液样本。
脑梗死组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书
2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南(2014版)》急性脑梗死诊断标准。
3)年龄18-65周岁。
4)BMI 18.5-23.9kg/m2。
5)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
6)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)合并其他疾病：神经***疾病(既往脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化***疾病，3个月内患有急性消化***疾病；循环***疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸***疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿***疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液***疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化***疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常的患者。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)本次发病前应用抗血小板及他汀类药物。
7)进行静脉溶栓和血管内介入治疗的患者。
8)妊娠期或哺乳期妇女。
9)本研究期间，患者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
健康对照组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书。
2)年龄18-65周岁。
3)BMI 18.5-23.9kg/m2。
4)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
5)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)存在其他疾病：神经***疾病(脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化***疾病，3个月内患有急性消化***疾病；循环***疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸***疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿***疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液***疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化***疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药、抗血小板药物及他汀类药物。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)妊娠或哺乳期妇女。
7)本研究期间，受试者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
2、非靶向代谢组学检测
2.1血清样本制备
2.1.1反相色谱分析血清样本处理方法
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取40μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的甲醇和1ml甲基叔丁基醚。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.1.2亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取50μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入150μl的乙腈。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.2色谱条件
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对血清样本进行分析。
2.2.1反相色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈/水4:6，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表1；
流速：0.3ml/min；
进样量为1.0μL；
柱温：50℃。
表1 C18反相色谱测定洗脱程序
Figure BDA0002822951580000091
2.2.1亲水色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(水，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表2；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：40℃。
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序
Figure BDA0002822951580000092
2.3质谱条件
质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50-1500。液质***由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。
3、靶向代谢组学检测
3.1血清样本处理方法
1)血浆样本于4℃放置30min解冻。
2)取50μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入150μl的甲醇(含有吲哚乙酸-D2500ppb，吲哚丙酸-D2 50ppb组成)，旋涡震荡30min。
3)12000rpm离心5min，取上清液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
3.2色谱条件
色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高压液相色谱***，色谱分离条件如下：
色谱柱:Waters UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(水，0.5Mm NH4F)和B(甲醇)；
洗脱梯度：见表3；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：45℃。
表3洗脱程序
Figure BDA0002822951580000101
Figure BDA0002822951580000111
3.3质谱条件
质谱分析仪器为Waters公司XEVO TQ-XS型串联四级杆质谱仪。正离子离子源电压为3kv，锥孔电压为20V。去溶剂温度550℃，源温度150℃。去溶剂气流速1000L/Hr，锥孔气流速7L/h。
3.4靶向代谢组数据处理
靶向代谢组数据峰面积计算采用masslynx定量软件，保留时间允许误差15s。浓度计算采用单点同位素内标法获取定量结果。
4、数据处理
4.1数据质控
为了评价样品采集过程中***的稳定性和重复性，使用了质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑：1)保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本***1个质控样本用于监测整个液质***的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。
4.2 PCA分析
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至16和1至12min。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。
4.3 OPLS-DA分析
为了获得在脑梗死组和健康对照组呈现显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。
采用OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。
4.4 ROC分析
根据代谢物的水平，绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析差异代谢物的诊断效能。
5、结果
脑梗死组与健康对照组各组反相色谱正离子和负离子、亲水色谱正的总离子流图如图1所示。
质控结果显示，质控样本相对聚集在一起，***重复性较好，所采集的数据可以进行进一步的研究。
反向色谱正离子、反向色谱负离子、亲水色谱正离子的结果分别如表4和图2所示。
表4 OPLS-DA分析模型参数
Figure BDA0002822951580000121
生物信息学分析结果显示，与健康对照组相比，Cer(d18:0/14:0)在脑梗死组的水平显著增加(图3)。
以Cer(d18:0/14:0)的含量作为检测变量判断诊断效能，结果显示，曲线下面积为0.934，截断值为7088751.490，敏感性为0.905，特异性为0.889(图4)，具有较高的敏感性和特异性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测样品中代谢标志物水平的试剂在制备早期诊断脑梗死的产品中的应用，其特征在于，所述代谢标志物包括Cer(d18:0/14:0)，所述样品选自血液、血浆或血清。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂通过以下的一种或多种方法检测代谢标志物水平：色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法；所述光谱法包括核磁共振光谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法；所述化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样品的试剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。
6.样品中Cer(d18:0/14:0)在构建预测脑梗死计算模型中的应用，所述样品选自血液、血浆或血清。
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