CN112626235A - 山羊绒毛性状相关的InDel标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于山羊育种领域，具体涉及山羊绒毛性状相关的InDel标记及其应用。本发明的山羊绒毛性状相关的InDel标记，所述InDel标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的InDel分子标记，不受山羊品种、年龄等限制，可用于山羊产绒性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进绒山羊品种的育种进程。操作简便，极大缩短绒山羊的育种周期。
Description
技术领域
本发明属于山羊育种领域，具体涉及山羊绒毛性状相关的InDel标记及其应用。
背景技术
山羊(Capra Hircus)在一万年前的近东新月沃土地区被人类驯化。山羊是适应性强、地理分布最广的家畜，其生命力顽强，在极端复杂的自然环境下适应性很强，可在寒冷、炎热、干旱、高海拔、潮湿等气候条件下繁衍生存。由于每个地区自然条件差异很大，经过长期的自然选择和人工驯化，山羊逐渐演化成各个地区的具有不同遗传特点、外貌特征、生产性能的品种。
绒山羊是一类以生产山羊绒为主的山羊品种。我国西起新疆荒漠和青藏高原，东至辽东半岛都有绒山羊的分布，各个地区绒山羊品种在遗传特征和生产性能上都有差异，例如在体型大小、羊绒细度、羊绒长度、羊绒弯曲度和羊绒产量等方面都有所不同。
传统的山羊育种存在周期长、成本高以及方法繁琐等问题。近年来，分子标记辅助育种得到快速发展，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。但仍然缺乏山羊绒毛形状相关的分子标记。
InDel(insertion/deletion，***/缺失)在基因组上数量多、分布广。InDel标记是近年来发展的一种新型共显性分子标记，以PCR技术为基础，检测方便、经济有效，且准确性高、稳定性好。因此，InDel标记已经广泛应用于动植物的基因型鉴定、遗传多样性分析、基因定位以及功能标记开发等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山羊绒毛性状相关的InDel标记。
本发明的再一目的在于提供上述InDel标记的引物。
本发明的再一目的在于提供上述InDel标记的应用。
本发明的再一目的在于鉴定高产绒山羊和低产绒或无绒山羊的方法。
根据本发明具体实施方式的山羊绒毛性状相关的InDel标记，所述InDel标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
gttaaaggct tatactactg acaaatagca gcccatctca tgatatccct taccttcaat
caaaagtaat cacattcaac acaatattta tctccttatt tttaaaaagt atttaattta
aaaatttaaa cattaatctt tgacttccca ttatagatat taataattta tcaagaacat
atacatatac cttatgccag actgttctag gagttttgca actcgtttta tttgacatga
ggtcactggt gaccaaacaa aaactgtttc agtggaggca ggggctaaat cacaacacaa
gacagaggag agaatgagaa gagaggaatt agacagtaaa cagaagcaac tctcttgagg
aattgcattc taaaaggaag aaaagaaatg ggataaaaga gatgtgttta aggatgtttt
gttttgaagt ttgggagaca ctatactgtg ctagtaagtg cataagactg ttcagttcag
tcgctcagtt gtgtccgact ctttgcgacc ccatgaatta cagcacgcca ggcctgtacc
agtaaagaaa acaaaaaaca aaaaatgatg caggagagag aa
本发明定位到一段缺失片段，绒山羊在LHX2周围发生片段的缺失率比非绒山羊高很多，特别是在乌珠穆沁绒山羊品种中完全缺失。LHX2(LIM homeobox2)基因，亦称作LH-2或L2，是LIM同源结构域转录因子家族中的重要成员之一。研究表明，LHX2大量表达于毛囊的前体细胞中，与毛囊发育的周期变化有着密切关系，影响着毛发的生长发育。毛囊发育周期包括生长期、退行期和休止期，LHX2在生长期处于高表达状态，是山羊绒毛产生和再生的重要调节因子。因此，本发明判断LHX2基因以及该基因周围的基因组变异会影响绒毛的生长。
根据本发明具体实施方式的山羊绒毛性状相关的InDel标记的特异性引物，引物序列如下：
正向引物：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’。
本发明提供上述山羊绒毛性状相关的InDel标记的应用，尤其是在鉴定产绒山羊和非产绒山羊方面和绒山羊品种选育方面。
根据本发明具体实施方式的鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，所述方法包括利用山羊绒毛性状相关的InDel标记进行鉴定的步骤，所述InDel标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明的InDel标记位于山羊参考基因组(Capra hircus ARS1)第11号染色体第94272264-94272845bp处，所述InDel标记为缺失/***多态性。绒山羊和非绒山羊的DNA序列，在该区段有显著差异，通过提取山羊的DNA进行PCR扩增，然后通过胶带判断出基因型。
根据本发明具体实施方式的鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，通过引物对所述InDel标记进行PCR扩增，引物序列为
正向引物：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3'。
本发明对来自国内不同地区的山羊品种进行了基因型与产绒相关验证，发现本发明所提供的InDel分子标记在不同品种的山羊群体中基因频率差异显著。缺失基因型在产绒山羊品种中的频率高达66.7％以上，尤其乌珠穆沁绒山羊为100％，而在非产绒山羊中该等位基因缺失频率均在8.3％以下。
因此，当山羊的LHX2基因座基因型为InDel标记缺失纯合时，判断山羊具有高产绒性状；
当山羊的LHX2基因座基因型为带有InDel标记序列(此处的带有InDel标记序列是指***/***、***/缺失基因型)时，判断山羊为低产绒或非产绒性状。
本发明还提供一种山羊LHX2基因***缺失突变的检测方法，包括以下步骤：以待测山羊个体全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增出待测InDel所在的核苷酸片段，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊个体LHX2基因***缺失突变位点的基因型。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供与山羊绒毛性状相关的InDel分子标记，序列位置：第11号染色体第94272264-94272845bp的序列；其不受山羊品种、年龄等限制，可用于山羊产绒性状的早期选育，甚至对于刚出生的山羊也能进行准确地筛选，从而显著促进绒山羊品种的育种进程；
(2)检出中国山羊品种LHX2基因座InDel多态性的方法准确可靠，操作简便。
(3)中国山羊品种LHX2基因座的InDel位点的检出，为山羊产绒性状的标记辅助选择提供了科学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为LHX2两种基因型琼脂糖凝胶电泳图；其中，WSG为巫山白山羊，GHP为贵州黑山羊，HXR为柴达木绒山羊，IMCG为内蒙古绒山羊，JTBG为金堂黑山羊，QSS为青山羊，WMG为乌珠穆沁绒山羊。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明中，绒山羊是指以生产绒毛为主的山羊品种，非绒山羊是指低产绒和不产绒的山羊品种，例如马头山羊产生很少绒，主要是生产肉，为肉山羊品种；青山羊有少些绒毛，主要产羊皮，为皮用山羊。
实施例1确定LHX2处发生变异的位置
本发明对金堂黑山羊、云南乌骨山羊、贵州黑山羊和成都麻羊共58份非产绒山羊以及12份乌珠穆沁绒山羊的DNA样本进行全基因组重测序，进行产绒-非产绒的全基选择信号分析，筛选与羊绒性状相关的候选基因。通过经验分析发现位于山羊第11号染色体LHX2基因座位与产绒-非产绒性状最为密切相关。
本发明发现山羊样本LHX2基因中存在一个大的InDel区域，进一步精确定位到山羊第11号染色体第94272264-94272845bp处的InDel分子标记与产绒性状最为密切相关。该InDel分子标记的多态性为-/***序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2验证InDel分子标记与山羊品种性状的相关性
以山羊基因组DNA为模板，通过山羊LHX2基因座位的序列引物，进行PCR扩增。本发明设计的特异性引物序列如下：
正向引物F：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物R：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3'。
PCR扩增出待测InDel所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示。
本发明对12个山羊品种，共计207个山羊样品的LHX2基因中InDel纯合缺失基因型进行检测，测序得到的基因型频率见表1。
表1 LHX2基因座的InDel纯合缺失位点在山羊品种中的基因型频率
有表1可知，本发明的选择对象涉及12个山羊品种，基本覆盖国内的绒山羊品种。通过基因型检测发现，产绒高的山羊品种中，InDel纯合缺失的频率高，最低为52.94％，最高达到100％；而在非产绒或低产绒品种中，InDel纯合缺失的频率低。
实施例3分析不同山羊品种中的LHX2基因座位的多态性位点
以山羊基因组DNA为模板，通过山羊LHX2基因座位的序列引物，进行PCR扩增。引物序列如下：
正向引物F：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物R：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3'。
PCR扩增出待测InDel所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示。
提取66只产绒山羊和30只非产绒山羊的基因组DNA样品采用上述特异性引物进行PCR检测，再进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。其中，产绒山羊包括柴达木绒山羊、内蒙古绒山羊、乌珠穆沁绒山羊和青山羊，非产绒山羊包括巫山白山羊、贵州黑山羊和金堂黑山羊。LHX2基因座位的基因型分型结果,如表2所示:
表2 LHX2基因座的InDel位点在山羊品种中的基因型频率
如表2所示，InDel位点在产绒山羊中的等位基因DNA缺失的频率达到66.7％以上，非产绒山羊中该等位基因DNA缺失的频率低于8.3％。
运用R软件的卡方检验进行分析，等位基因***等位基因在产绒山羊中的频率显著高于在非产绒山羊中的频率，表明本发明的InDel位点的等位基因缺失与山羊产绒性状的相关性。
因此，山羊产绒性状判定可以通过本发明发现的LHX2基因座位582bp DNA片段的***/缺失多态性(InDel分子标记)判定实现。利用该分子标记的检测可以确定山羊产绒表型，以加快选育具有产绒性状的山羊，节省了育种时间，使得快速获得具有纯合产绒基因型的优良山羊种质资源成为可能。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 深圳市华大农业应用研究院
<120> 山羊绒毛性状相关的InDel标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> 山羊(Capra hircus)
<400> 1
gttaaaggct tatactactg acaaatagca gcccatctca tgatatccct taccttcaat 60
caaaagtaat cacattcaac acaatattta tctccttatt tttaaaaagt atttaattta 120
aaaatttaaa cattaatctt tgacttccca ttatagatat taataattta tcaagaacat 180
atacatatac cttatgccag actgttctag gagttttgca actcgtttta tttgacatga 240
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agtaaagaaa acaaaaaaca aaaaatgatg caggagagag aa 582
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtacggag caagtaaacg g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggctgtgat caaacttaca acc 23
Claims (10)
1.山羊绒毛性状相关的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记位于山羊参考基因组第11号染色体第94272264-94272845bp处，所述InDel标记为缺失/***多态性。
2.根据权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：
正向引物：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3'。
4.权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记的应用。
5.权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记在绒山羊品种选育方面的应用。
6.权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记在鉴定产绒山羊和非产绒山羊中的应用。
7.鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的山羊绒毛性状相关的InDel标记进行鉴定的步骤。
8.根据权利要求7所述的鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，其特征在于，通过引物对所述InDel标记进行PCR扩增，引物序列为
正向引物：5'-CAGTACGGAGCAAGTAAACGG-3'；
反向引物：5'-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3'。
9.根据权利要求7所述的鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，其特征在于，当山羊的LHX2基因座基因型为InDel标记缺失纯合时，判断山羊具有高产绒性状；
当山羊的LHX2基因座基因型为带有InDel标记序列时，判断山羊为低产绒性状或非产绒性状。
10.鉴定产绒山羊和非产绒山羊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物。
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