CN112625959B

CN112625959B - 用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂

Info

Publication number: CN112625959B
Application number: CN202011582989.3A
Authority: CN
Inventors: 李季; 丁国春; 孟雅
Original assignee: Zhongnong Xinke Suzhou Organic Cycle Research Institute Co ltd
Current assignee: Zhongnong Xinke Suzhou Organic Cycle Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112625959A

Abstract

本发明公开一种用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，该嗜高温复合菌剂包括15～20vol％的嗜热链球菌、20～25vol％的枯草芽孢杆菌、20vol％的地衣芽孢杆菌、20vol％的嗜热脱氮芽孢杆菌、20vol％的波茨坦短芽孢杆菌，且地衣芽孢杆菌和波茨坦短芽孢杆菌均进行了保藏。本发明中的嗜高温复合菌剂，所有的高温菌均在24h内快速生长，利用其生长快，在好氧发酵中的高温阶段可以保持较强的生长活性，实现有机废弃物的快速发酵。

Description

用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂。

背景技术

我国餐厨垃圾产量巨大，按照餐厨垃圾占城市生活垃圾比例为30％～40％，经估算，每年餐厨垃圾清运量超过6 000万t。在部分特大城市中，厨余垃圾所占比例高达60％，最高可达80％以上。传统的餐厨垃圾资源化技术是制备各种饲料，但该技术由于存在各种安全隐患而逐渐被各国政府限制或禁止，采取新的餐厨垃圾资源化方式逐步受到关注。而好氧堆肥技术既可以实现厨余垃圾的无害化和减量化，又可以生产出安全、稳定、营养丰富的土壤改良剂。通过高温好氧消化技术实现餐厨垃圾肥料化是近期的研究热点之一。该技术在高温条件(45～55℃)下，通过加快微生物的新陈代谢，提高餐厨垃圾中有机物质的降解速度，可快速、高效地将餐厨垃圾降解成有机肥，同时该技术还可以通过较高温度杀死大多数病原菌和寄生虫，实现垃圾的稳定化和资源化。

在有机固体废弃物好氧堆肥处理过程中，高效微生物菌剂的合理投加有助于增强微生物生态***的功能，加速有机物质的分解，促进堆肥物料的腐熟，提高堆肥效率。高温菌较常温菌具有更高的微生物代谢活性和有机物降解速率，在固体废弃物处理领域具有广阔的应用前景和科学价值。嗜热微生物能够分泌具有优良热稳定性的蛋白酶和淀粉酶等胞外酶，在餐厨垃圾大分子降解中表现出很好的细胞溶解酶活性。

目前，应用于堆肥的微生物菌剂主要有单一菌剂和复合菌剂，其中单一菌剂主要为耐热能力较强的芽孢杆菌(Bacillus)和放线菌(Actinomycetes)等。但是由于单一菌种环境适应性较低，限制了其在堆肥中的应用效果。基于菌株间的互利共生效应生成的复合菌剂，适应高温堆肥环境的能力强，应用效果显著好于接种单一菌剂的堆肥处理。复合微生物菌剂的添加不仅能够缩短堆肥时间，还可以使物料成为适宜微生物生长的微生态环境。目前，运用于有机废弃物处理嗜高温好氧发酵的菌剂较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，可以加速降解有机质，促进堆体发酵腐熟，缩短堆制时间；增加提升堆体温度，杀灭粪便中所含虫卵病菌；降解堆体物料中残留的抗生素等物质。

本发明的目的通过如下的技术方案来实现：

一种用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，该嗜高温复合菌剂包括：

嗜热链球菌 15～20vol％

枯草芽孢杆菌 20～25vol％

地衣芽孢杆菌 20vol％

嗜热脱氮芽孢杆菌 20vol％

波茨坦短芽孢杆菌 20vol％；

其中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)VH1-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCC No.21231；

所述波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)VH1-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCC No.21232。

进一步地，所述嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌的体积比为15vol％、25vol％、20vol％、20vol％、20vol％。

进一步地，所述嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌的体积比为20vol％、20vol％、20vol％、20vol％、20vol％。

本发明的有益效果如下：

1.本发明中的复合菌剂，所有的高温菌均在24h内快速生长，利用其生长快，在好氧发酵中的高温阶段可以保持较强的生长活性，实现有机废弃物的快速发酵。

2.本发明可适用于具有加热、曝气和搅拌功能的餐厨废弃物处理设备中，可在50-60℃下生长并且发挥作用，使餐厨废弃物好氧发酵在3天内完成，并且达到完全腐熟的状态(发芽指数＞80％)。

附图说明

图1为两种高温菌的形态图，其中，图1(a)L6-5-36的形态图，图1(b)为FF2-4-2 的形态图；

图2为三组实验得到的餐厨垃圾减量随时间变化的柱状图；

图3为三组实验得到的餐厨垃圾的含水量和耗电量变化的柱状图；

图4为三组实验得到的餐厨垃圾的酸碱度和发芽率变化的柱状图。

具体实施方式

下面根据附图和优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的高温复合菌剂用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，包括嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌，五种菌的体积比为 15～20％：20～25％：20％：20％：20％；

所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)VH1-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCC No.21231；

所述波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)VH1-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCCNo.21232。

另外三种菌从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买获得。本发明实施例所用到的培养基如下：

(1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，H2O 1000mL，琼脂 20g、pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

(2)LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.4。

(3)LB液体培养基：LB肉汤20g,去离子水1000mL。

本发明实施例对菌种的分离、筛选和纯化的过程具体如下：

1.菌种的驯化

将餐厨废弃物与高有机质土按体积比1:1混合后放入50℃/60℃烘箱中培养，即为富集培养。原代培养主要为条垛堆肥高温期样品。将富集培养样品及原代培养样品稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，划线挑单菌落后，-80℃甘油冷冻保存。

(1)地衣芽孢杆菌VH1-1的分离筛选与纯化

将条垛堆肥高温期样品的菌悬液，梯度稀释后在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养，多次分离纯化后得到单菌落，命名为VH1-1，保存。

菌株VH1-1的菌落呈圆剧齿状，乳白色，表面湿润有光泽和大量的黏液，菌落大，直径 4～5mm。最适培养温度为60℃，其为革兰氏阳性杆状细菌，可产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在。是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。生长速度快、营养需求简单。如图1所示。

(2)波茨坦短芽孢杆菌VH1-3的分离筛选与纯化

将富集培养样品的菌悬液，梯度稀释后在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养，多次分离纯化后得到单菌落，命名为VH1-3，保存。

菌株VH1-3菌落为圆形、乳白色、表面光滑、不透明，微微***。最适培养温度为50℃，生理生化特征中明胶液化、硝酸盐还原柠檬酸盐利用、葡萄糖为阳性，氧化酶、淀粉水解、 V-P反应为阴性。如图1所示。

2.菌种分离鉴定

以2种培养方式分离纯化得到的菌株基因组DNA为模板，以1492R和27F为引物，PCR扩增菌株的16S rRNA基因，测序扩增产物，所得序列通过在线EzTaxon来进行分类(16SrRNA 基因序列相似度大于97％的初步确定为同种)，所获得2株细菌的16S rRNA基因序列与模式种的相似度98％～100％。结果如表1所示。

表1嗜热高温菌株的16S rRNA基因相似度分析

菌株编号	相似度	鉴定结果
			L6-5-36	99.10％	Bacillus_licheniformis(CP000002)
FF2-4-2	100.00％	Brevibacillus_borstelensis(AB112721)

3.菌种的扩大培养

将试管斜面保存的嗜热链球菌菌株用接种环挑取一环，在LB液体培养基中进行扩增培养，培养温度为60℃，振荡速度180rpm/min、培养时间18h。

将试管斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株用接种环挑取一环，在LB液体培养基中进行扩增培养，培养温度为50℃，振荡速度180rpm/min、培养时间18h。

将-80℃甘油冷冻保存保存的地衣芽孢杆菌菌株用接种环挑取一环，在LB液体培养基中进行扩增培养，培养温度为60℃，振荡速度180rpm/min、培养时间18h。

将试管斜面保存的嗜热脱氮芽孢杆菌菌株用接种环挑取一环，在LB液体培养基中进行扩增培养，培养温度为60℃，振荡速度180rpm/min、培养时间18h。

将-80℃甘油冷冻保存的波茨坦短芽孢杆菌菌株用接种环挑取一环，在LB液体培养基中进行扩增培养，培养温度为50℃，振荡速度180rpm/min、培养时间18h。

4.检测混合菌液的菌落数

挑取扩大培养的五种菌的菌液10mL，作为一级种子培养液。将一级种子培养液OD600 调节至同一水平后，移取5mL种子培养液于150mL液体培养基中摇床培养，培养20h，作为二级种子培养液。取1ml菌液，测定OD600，稀释菌液为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，通过点接法测定不同菌落数量，用移液枪从各稀释梯度为10^-3、10-⁴、10^-5、10^-6的离心管中吸取10μl的稀释液均匀在平板中的对应区域内点样，每个区域的10μl菌液点5-6个点，平板自然晾干后倒置放在恒温培养箱中在每种菌最适宜的培养温度下进行培养，待菌落长到合适大小时进行计数，每个处理设置三个重复。实验结果如下表所示。

表2五种菌的菌落数统计表

菌株名称	菌株编号	OD600	菌落数
				嗜热链球菌	1	1.086	8*10^8
枯草芽孢杆菌	2	1.071	6*10^8
				地衣芽孢杆菌	L6-5-36(VH1-1)	1.533	6*10^8
嗜热脱氮芽孢杆菌	3	1.056	6*10^8
				波茨坦短芽孢杆菌	FF2-4-2(VH1-3)	1.154	4*108

从表2中可以看出，五种菌的菌落数均大于10⁸，满足配制复合菌剂的要求。

实施例1

(2)将扩大培养的五种菌液混匀，各菌液体积百分含量为：嗜热链球菌20％、枯草芽孢杆菌20％、地衣芽孢杆菌20％、嗜热脱氮芽孢杆菌20％、波茨坦短芽孢杆菌20％，即得复合菌剂。

实施例2

(1)将扩大培养的五种菌液混匀，各菌液体积百分含量为：嗜热链球菌15％、枯草芽孢杆菌25％、地衣芽孢杆菌20％、嗜热脱氮芽孢杆菌20％、波茨坦短芽孢杆菌20％，即得复合菌剂。

为了证明本发明的复合菌剂的效果，下面进行对比试验。

对比试验1

将实施例1制备得到的复合菌剂和市售菌剂S分别接种于装有100g餐厨废弃物的500mL 锥形瓶中，在温度50℃、振荡速度180rpm/min处理7天，每天16：00连续取样测量餐厨垃圾减量。减量效果按称重方式记录。同时设置不添加菌剂的对照组。得到的减重结果如图2所示。

CK：不添加菌剂

VH1(M)：实施例1得到的复合菌剂

S：添加市售苏柯汉菌剂。

如图1所示，第1天由于时间过短，减量效果不明显，3个处理减量为1-4‰。随着时间的变化，第7天，添加实施例1的复合菌剂的锥形瓶中的餐厨垃圾的减量比对照组的减量高 5％。可见添加实施例1的复合菌剂的减量效果最优。

对比试验2

将实施例2得到的复合菌剂和市售菌剂S分别接种于装有30Kg餐厨废弃物的50L餐厨垃圾处理设备中，添加量均为5‰，并添加10％的锯末用于调节物料的含水率。设备参数设定指标：物料加入反应器后设置参数为加热板温度50℃，生化仓温度60℃，搅拌参数：正转20min、反转20min、停20min；孵育2h后，调整运行程序为加热板温度100℃，生化仓温度105℃，搅拌参数：正转20min、反转20min、停20min；曝气、抽风区间设置为50-55℃，持续运行72h，每天16:00连续取样，并测量餐厨垃圾含水率、pH、GI、耗电量，如图3～4 所示。

从图3可以看出，各处理物料起始含水率均为79％左右，经过3天生物干化处理后，含水率分别为31.42％、37.64％、32.98％，说明添加菌剂后含水率下降更快。添加VH1(M)菌剂下降最为明显。三个处理中，添加实施例2得到的复合菌剂耗电量最低。后期可能是由于物料含水率降低，水分传输效率增加以及微生物分解放热维持温度能力增加等因素导致耗电量较小。由此可见，含水率越高，需要的能耗就越高。

从图4可以看出，添加VH1(M)的餐厨垃圾的pH上升速度快，但各处理pH变化基本为5-5.4，可能是由于酸性物质被微生物分解了，导致pH略有上升，可能是生物干化速率过高，含水率下降过快，堆体环境已经不适合微生物生长，pH并没有上升到7.0及以上。在整个生物干化过程中，添加VH1(M)菌剂处理发芽率达到80以上，达到了腐熟要求。

本领域普通技术人员可以理解，以上所述仅为发明的优选实例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所做的修改、等同替换等均应包含在发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，其特征在于，该嗜高温复合菌剂包括：

嗜热链球菌 15～20 vol％

枯草芽孢杆菌 20～25 vol％

地衣芽孢杆菌 20 vol％

嗜热脱氮芽孢杆菌 20 vol％

波茨坦短芽孢杆菌 20 vol％；

其中，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCC No.21231；

波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年11月26日，保藏编号为CGMCC No.21232。

2.根据权利要求1所述的用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，其特征在于，所述嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌的体积比为15 vol％、25 vol％、20 vol％、20 vol％、20 vol％。

3.根据权利要求1所述的用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂，其特征在于，所述嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脱氮芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌的体积比为20 vol％、20 vol％、20 vol％、20 vol％、20 vol％。