CN112625952B - 一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，主要涉及一株具有抑藻活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种菌株及其在抑制和预防虾蟹养殖塘蓝藻水华方面的应用。所述菌株具体为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)TK812，该菌株于2020年11月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.20996。本发明中首次采用枯草芽孢杆菌斯氏亚种来防治蓝藻水华，所用枯草芽孢杆菌斯氏亚种分离自自然界，无基因修饰，无二次污染威胁；且本发明提供的菌剂中不含防腐剂，化学添加剂，无化学污染威胁，成本低廉，应用前景广阔。

Description

一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用
技术领域：
本发明属生物技术领域，主要涉及一株具有抑藻活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)菌株及其在抑制和预防虾蟹养殖塘蓝藻水华方面的应用。
背景技术：
蓝藻，又称蓝细菌，是广泛分布于地表水的一种可进行光合作用的原核微生物。蓝藻水华，是指由于水体富营养化而造成蓝藻在短时间异常迅速增殖的现象，由于多数蓝藻可以产生对水生生物及人类有害的藻类毒素，所以蓝藻水华又被归为“有害藻类水华(Harmful Algal Bloom，HAB)”。在国内，目前蓝藻水华的研究主要集中在淡水水域，从上世纪80年代开始，随着工农业的飞速发展，我国淡水湖泊开始大规模发生蓝藻水华，尤以长江中下游流域湖泊及滇池严重，其中蓝藻主要类型是铜绿微囊藻、水华鱼腥藻和颤藻。当蓝藻水华发生时，水体透明度下降，水生植物种类降低，严重时会导致水体腐臭发黑，对当地旅游业、人畜用水及水产养殖业带来巨大危害。在国外，蓝藻水华归为浮游植物水华(phytoplankton blooms)。目前如何对蓝藻水华进行防治已经成为世界性难题，每年有大量科研人员在预防蓝藻水华方面投入资金与精力。蓝藻水华发生的根本原因是水体的富营养化，正常情况下，水体的富营养化是一种缓慢的自然过程，但随着近代工农业的发展，越来越多的氮、磷等物质排入自然界，加速了水体富营养化的进程，尤其在现代化的虾蟹等水产品养殖中，由于现在水产品养殖过程中会有大量有机营养物质投入，而为了保证虾蟹高产，虾蟹养殖水塘还会定期清鱼苗，使得食藻鱼类的严重匮乏，这样造成虾蟹养殖水塘在每年春夏交际及夏末极易形成蓝藻水华，其最直接的后果为虾蟹因缺氧而大量死亡，造成严重经济损失。此外，持续性的影响还有养殖水体蓝藻毒素污染以及食物链生物累积效应导致的水产品蓝藻毒素污染、蓝藻菌体腐败产生有毒气体污染等一系列生态环境问题。为了降低蓝藻水华带来的损失，目前虾蟹等水产养殖一线一般采用向水塘泼洒硫酸铜来进行抑藻、杀藻，但过量的铜会造成水产品中重金属超标，还会威胁饮用水安全，所以安全高效防治蓝藻方式的开发和应用是当前亟待解决的问题，目前蓝藻水华的防治方式主要有生物防治、物理防治、化学防治以及三种方式共用进行联合防治，其中微生物防治是目前蓝藻水华防治研究的热点领域之一。
当前，已经有很多抑藻微生物被发现，但只有很少一部分被应用到实际生产中，例如公开号为：CN109609405A的发明《产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途》公开了一种利用可产抑藻活性物质的芽孢杆菌(Bacillus sp)dhs 330进行发酵生产抑藻物质的方法及用途。公开号为：CN102308852A的发明《一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂及制备方法》公开了一种利用侧孢芽孢杆菌 VKPM B-10531与膨胀珍珠岩颗粒载体混合组成的微生物抑藻制剂，该微生物抑藻制剂可以抑制水体中微藻的生长与微藻生物膜的形成，最终导致藻类死亡。本发明所提供的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)应用于蓝藻水华的防治尚属首次。
目前枯草芽孢杆菌共包含四个亚种，分别为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilis subsp.Subtilis)，Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum，枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)与Bacillus subtilis subsp.Stercoris，近年来科学研究发现这四种亚种均可以作为一个独立的菌种，但由于缺乏可明显区分的表型，四株菌株无法用常规方式区分，Christopher A.Dunlap.Michael J. Bowman.DanielR.Zeigler等三人从基因组与代谢组方面对四株菌株进行对比，发现在代谢组方面四株菌株均存在差异，主要差异为：Bacillus subtilis subsp. Subtilis只产生3,3’-neotrehalosadiamine；而Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum则产生芽孢菌霉素F，丰原素和一个未知的PKS/NRPS结构簇；枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bacillus subtilissubsp.spizizenii则可产生枯草抑霉菌素，杆菌素和 3,3’-neotrehalosadiamine；Bacillus subtilis subsp.Stercoris则可以产生丰原素和未知的PKS/NRPS结构簇。另外在基因组差异的比较中，三人发现四种枯草芽孢杆菌为单系分支，即它们有共同的祖先，但目前相互之间进化关系较远。
枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)是为了纪念美国细菌学家J.Spizizen而命名，其细胞呈单个或链杆状，大小为0.5×2-3μm，有鞭毛，革兰氏染色阳性，间生椭圆形芽孢，兼性厌氧，可耐受7％浓度氯化钠，产淀粉酶与蛋白酶，可还原硝酸盐，具有编码枯草芽孢菌素、杆菌素、脂肽、霉菌素、表面素及抗生素3,3’-neotrehalosadiamine的基因，是一种开发潜力极强的菌株之一，目前，本发明将该菌株用于蓝藻水华防治尚属首次。
发明内容：
本发明申请目的之一在于提供一株具有良好抑藻作用的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)TK812，该菌株于2020年11月3日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.20996。
本发明申请目的之二在于提供枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilissubsp. spizizenii)TK812或包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的制剂或菌剂在防治蓝藻水华中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供利用枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812制备鱼虾养殖水塘防治蓝藻水华微生态制剂，具体方法如下：
(1)菌种活化及一级种子液制备
将菌株TK812甘油管按1-5％接种量接种于种子液培养基中，一级种子液培养条件为30-40℃，200-250rpm摇床通气培养24-48h；
进一步地，所述菌株TK812甘油管制备方法为：将菌株TK812营养肉汤培养基富集液用无菌生理盐水稀释至株菌浓度为107CFU/ml后按1-5％比例接种于盛有100ml甘油管培养基的500ml挡板瓶中，并在35-40℃、200-250rpm摇床条件下培养48-60h，待芽孢产生后将发酵液挡板瓶80-100℃水浴20-50min杀死活菌体保留芽孢，最后待培养液降至室温后加入菌液体积的10-50％无菌甘油进行工业生产用甘油管制作；
优选的，所述的甘油管培养基组成为：葡萄糖1-2％，玉米粉2-3％，大豆粉 1-2％，酵母浸膏0.5-1％，胰蛋白胨1-2％，矿物盐溶液(NaCl 0.5-1％，K2HPO4 0.5-1％，MgSO40.01-0.05％，MnSO4 0.01-0.05％，(NH4)2SO4 0.1-0.5％，其余为水) 1-2％，其余为水，pH＝7.4，115℃条件下灭菌15min；
优选地，所述工业生产用甘油管接种量为1％；
优选的，甘油管制备中，发酵液最佳水浴温度为82℃，处理时间为30min，甘油添加比例为32％；
(2)二级种子液及50L发酵罐发酵
将培养24-48h后的一级种子液按1-10％接种量接种于盛有1L种子液培养基的5L锥形瓶中，放入30-40℃摇床进行培养，转速200-250rpm，培养24-36h，培养完成后按照1-5％接种量接种于盛有30L发酵培养基的50L发酵罐中，转速 100-150rpm，温度30-40℃，通气，通气量为2-3:1(V/V·min)发酵36-60h，按照需求灵活补加酸碱与消泡剂，使得罐内发酵液ph值稳定在7.0-7.4之间；
优选的，所述种子液培养基组成为：葡萄糖2-3％，玉米粉2-3％，麸皮1-2％，大豆粉1-2％，酵母浸膏0.1-0.5％，矿物盐溶液(K2HPO40.5-1％，MgSO4 0.01-0.05％， MnSO40.01-0.05％，(NH4)2SO4 0.1-0.5％，其余为水)1-2％，其余为水，pH＝7.0， 115℃条件下灭菌15min。
优选的，所述发酵培养基组成为：葡萄糖2-5％，玉米粉1-3％，麸皮1-2％，豆粕粉1-2％，酵母浸膏1-2％，矿物盐溶液(K2HPO4 0.5-1％，MgSO4 0.02-0.03％， MnSO4 0.02-0.05％，(NH4)2SO4 0.2-0.5％，其余为水)0.5-1％，其余为水，pH＝7.0， 115℃条件下灭菌25min；
优选的，所述一级、二级种子液、发酵罐培养温度为37℃；
优选的，一级、二级种子液培养时间为36h，发酵罐发酵时间为48h；
优选的，一级、二级种子液摇床转速为220rpm，发酵罐转速为150rpm，通气量为3:1(V/V·min)；
优选的，一级种子液接种量为2％，二级种子液接种5％，发酵罐接种量为 1％；
(3)高效抑藻活性菌粉的制备与抑藻活性菌乳液的制备
高效抑藻活性菌粉的制备：对发酵菌液进行离心，离心条件为5000-7000rpm，离心15min，取发酵液上清与粘土(本发明所用粘土均为无菌粘土)混合风干后粉碎，使得粉碎后的TK812菌粉活菌数到达109-1010CFU/g，即得枯草芽孢杆菌斯氏亚种高效抑藻活性菌粉；
优选地，取发酵液上清，分若干次喷淋至黏土上，喷淋过程中对黏土进行翻搅，每次喷淋之后置于30-40℃环境风干至水分含量为1-10％；
更优选的，离心转速为6000rpm，喷淋后的黏土置于35℃条件下烘干至水分含量为5％，粉碎后活菌数不低于109CFU/g；
抑藻活性乳液的制备：对发酵菌液进行5000-7000rpm离心15min，加入菌体沉淀质量1-5％的吐温80、10-20％的甘油，混匀后即为微生态抑藻活性乳液；
优选的，吐温80加入量为3％，甘油加入量为14％；
(4)抑藻活性颗粒的制备
将发酵液与粘土按质量比1：1.5-2混合，然后通过造粒机压制成颗粒，这种抑藻颗粒具有较大比表面积，可以提高其吸附效果；
优选的，抑藻活性颗粒制备过程中发酵液与粘土质量比为1：1.5，压制颗粒直径为4mm。
进一步地，上述包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的制剂在防治蓝藻中的使用方法如下：
(1)当水体中出现肉眼可见的藻华颗粒以后，添加上述抑藻活性菌粉或抑藻活性乳液，使用量为每1kg活性菌粉用于200-260立方米水体，或每1kg抑藻活性乳液泼洒200-300立方米水体；
(2)当蓝藻爆发后24h内，施用上述抑藻活性颗粒，用量为每1kg泼洒 300-400立方米水体，48h后二次等量泼洒；
所述蓝藻爆发的主要特征为水体浊度在24h内迅速升高并大于60NTU。本发明有益效果：
1)本发明所用枯草芽孢杆菌斯氏亚种分离自自然界，无基因修饰，无二次污染威胁。
2)本发明中首次采用枯草芽孢杆菌斯氏亚种来防治蓝藻水华。
3)本发明提供的菌剂中不含防腐剂，化学添加剂，无化学污染威胁，成本低廉，应用前景广阔。
附图说明：
为了更好的展示本发明中所用的枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812及其对蓝藻的抑制作用，本文以以下附图展现菌株TK812的菌株性状、生长特性及抑藻特性。
图1为枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的菌落形态照片。
图2为枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的菌体显微照片、扫描电镜照片。
图3展示了枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812在营养肉汤培养基中的生长曲线。
图4为枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812***发育树。
图5为加入枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的鱼腥藻培养液与空白对照组图片(左侧为实验组，右侧为空白对照，培养4d)。
图6为枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812对鱼腥藻的抑制曲线。
图7菌株TK812抑制铜绿微囊藻曲线图。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案来具体阐述本发明的目的，技术方案及优点，除非特别注明，本发明中所用的技术手段均为当前在该领域公开的方法，以下结合附图、表格及实施例，对本发明进行具体说明。应当注意，以下所描写具体实施例仅仅解释说明本发明，但本发明并非局限于以下实施例，对本领域技术人员而言，在以本发明的基础上，对下列实施例中的原料及其含量等具体参数进行各种修改或变动也属于本发明的保护范围。
在以下实施例中涉及到的百分号“％”若未特别说明，具体指物料质量百分比，溶液浓度百分比指每100mL溶液中所含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。实施方案中所涉及到的质量体积比“W/V”或“m/V”，若未特别注明，单位均为g/mL；质量比为“m/m”。
以下实施例中，藻类培养均采用BG11培养基(Medium for Blue Green Algae，BG11)，枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812采用营养肉汤培养基(Nutrient Broth， NB)。
BG11培养基主要成分为(g/L)：NaNO3 1.5，K2HPO4 0.04，MgSO4.7H2O 0.075，CaCl2.7H2O 0.036，Na2CO3 0.02，柠檬酸0.006，柠檬酸铁铵0.006，微量元素溶液A5 1ml，蒸馏水1L。
微量元素溶液A5(g/L)：H3BO4 2.86，MnCl2.4H2O 1.81，ZnSO4 0.222， Na2MoO40.39，CuSO4.5H2O 0.079，Co(NO3)2.6H2O 0.494，蒸馏水1L。
营养肉汤培养基(NB)：胰酪蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，蒸馏水100ml，pH＝7.6。
实施例1具有抑藻活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的分离与鉴定
本发明中具有抑藻活性的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)TK812分离自天津科技大学校园搜集的野生蚯蚓***物。
具体方法为：
1.样品处理
取捕获的野生蚯蚓一条，用无菌生理盐水对其表面进行冲洗，放置于试管中，待其产生***物后取出蚯蚓，向试管内加入适量无菌生理盐水，震荡摇匀后在营养肉汤培养基上进行稀释涂布，经过涂布的平板置于30℃培养箱中培养48h，挑取单菌落进行摇瓶培养。培养条件220rpm，37℃，培养24h后进行抑藻活性微生物筛选。
2.具有抑藻活性微生物的筛选
将处于对数生长期的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)FACHB-978培养液与含有1.5％琼脂的BG11培养基混合后倒蓝藻平板，在光照条件(3000lx，28℃) 下培养3天，用直径1cm的打孔器打孔，每个孔内加入富集好的菌液100μL，于无菌条件下晾干菌液后放入光照培养箱进行培养，培养3-7天后观察是否有抑藻圈，选取抑藻圈明显的菌落进行微生物物种鉴定。
3.具有抑藻活性微生物的菌种鉴定：
取该微生物富集液1ml，对于细菌，通过酚仿法提取其基因组，利用通用16S rDNA引物进行扩增，(通用引物序列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，扩增产物经测序后获得具体基因序列，然后上传基因数据与NCBI数据库比对，比对结果显示其与枯草芽孢杆菌斯氏亚种最为相似，相似度达99％，命名为：枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)TK812，该菌部分16SrDNA序列为：
CTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTT AGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGA TAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGT TCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGC ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGA CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGA GCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTA GGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTT AAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTC TGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGG TCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC ATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACA GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTC TAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACA AAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTT AGGAGCCAGCCGCCGAAGTGAC
4.菌落及显微形态特征
如图1、2所示，在营养肉汤固态培养基上该菌菌落呈乳白色，偏黄、扁平呈片状生长，有芽孢杆菌特殊气味，显微镜下观察到该菌为杆状革兰氏阳性菌，大多数呈两菌串联形态，芽孢呈椭圆形，端生或偏端生。
5.常见抗生物敏感性
在营养肉汤培养基中分别加入氨苄青霉素、卡纳霉素、林可霉素、丁胺卡纳霉素、四环素、氯霉素，使其在培养液中终浓度为100mg/mL，每种抗生素设两组平行，同时设置空白对照组，然后按照1％接种量接入菌株TK812，在37℃条件下培养48h，每隔12h测定培养液在600nm波长下的吸光度值，根据OD600 大小判断菌株TK812抗生素敏感性。测试结果如下：
表格1菌株TK812抗生素抗性
Figure GDA0002967553040000081
表中“+”表示菌株TK812具有该抗生素抗性，对该抗生素不敏感。“-”表示菌株TK812 对该种抗生素敏感。
由实验可知，菌株TK812对氨苄青霉素有一定的抗性，对其它抗生素无明显抗性。
6.菌株TK812生长曲线的绘制
将该菌富集培养液按照1％的接种量接种于空白营养肉汤培养基中，设三组平行，在37℃，220rpm条件下培养，每隔两个小时取样测量培养液在波长600nm 条件下的吸光度，最后利用数据处理软件绘制生长曲线图。OD600值测量结果如下表：
表格2菌株TK812 OD600测定值
Figure GDA0002967553040000091
如图3所示，该菌生长速度极快，接种2小时后开始进入指数增长期，8小时后生长速度减慢，20小时左右进入平稳期。
7.菌株TK812进化关系图的构建
为反映该菌株在细菌进化关系中所处进化地位，从NCBI细菌菌株16S rDNA 数据库中获取亲缘关系相近及具有代表性菌株的16S rDNA片段,利用MEGA-X 软件的最大简约法构建***进化关系图，构建结果如图4所示。
实施例2枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812对水华鱼腥藻的抑制实验
取6瓶处于对数生长期的健康鱼腥藻培养液(规格：100ml/250ml锥形瓶)，编号1-6，其中1-3号作为空白对照组，按照5％接种量加入空白营养肉汤培养基， 4-6号作为实验组，按照相同比例加入菌株TK812富集培养液(菌株TK812富集液：接种于营养肉汤培养基中在37℃摇床，220rpm条件下进行富集培养，培养至每毫升富集液中含有TK812活菌数为108个),接种菌株TK812富集培养液后的鱼腥藻培养液置于28℃，100rpm，12h:12h光照黑暗循环、光照强度3000lx 条件下培养，每隔24h取样，测定叶绿素a含量。图5为加入枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的鱼腥藻培养液与空白对照组图片。
叶绿素a含量测定方式：利用0.22μm孔径尼龙滤膜对水华鱼腥藻培养液进行抽滤，抽滤完成后用无菌PBS缓冲液洗涤2-3次，然后将尼龙滤膜置于90％丙酮溶液中，在4℃、避光条件下抽提20-24h，最后在10000g离心力条件下低温离心5-10min，用酶标仪测定上清液在664nm、630nm波长下的吸光度，最后根据公式：
叶绿素a(μg/L)＝11.47×OD664nm-0.40×OD630nm
计算获得叶绿素浓度：
表3菌株TK812对水华鱼腥藻培养液叶绿素含量的影响(叶绿素含量(μg/L))
Figure GDA0002967553040000101
在第2天后添加5％空白营养肉汤培养基或者菌株TK812富集培养液，第三天叶绿素持续下降的原因可能为胰酪蛋白胨中部分物质对鱼腥藻的抑制作用，第四天培养液中叶绿素含量回到原始水平作用，但第5天以后，空白组鱼腥藻开始快速增长，实验组鱼腥藻开始枯萎，叶绿素含量差距已达到显著水平。该实施例对鱼腥藻培养液抑制效果图见附图5，左侧为加入菌株TK812富集培养液4天后的鱼腥藻培养液，右侧未空白对照。该实施例对应的抑藻曲线见附图6。
实施例3枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812对铜绿微囊藻的抑制试验
取处于生长对数期的铜绿微囊藻六瓶，编号1-6，平均分为两组，第一组加入5％的营养肉汤空白培养基，第二组分别加入5％菌株TK812富集培养液，混匀后置于28℃，24h持续4000lx光照培养箱中培养，每隔24h取样测定730nm 处吸光度，根据OD730变化情况判断铜绿微囊藻生长情况，OD730测定情况如下表：
表格4菌株TK812对铜绿微囊藻OD730的影响
Figure GDA0002967553040000111
可以看出，与鱼腥藻不同的地方在于加入空白肉汤培养基后，实验组铜绿微囊藻生长速率略低于空白对照组，第4-5天中铜绿微囊藻细胞数开始下降，在后续的5-6天差距逐渐加大，实验组铜绿微囊藻枯萎现象明显，该实施例对应的铜绿微囊藻抑制曲线见附图7。
实施例4菌株TK812对小球藻(商品)生长的影响情况
小球藻是一种单细胞真核绿藻，与可造成水华的蓝藻不同，也是水产动物良好的食物来源及水产养殖塘除蓝藻以外可进行光合作用为水生动物提供氧气的重要藻类之一，本实施例通过测定菌株TK812对小球藻的正常生长有无影响来反应其对有益绿藻是否有抑制作用。
具体实验过程为取九瓶处于对数生长期的小球藻培养液(BG11培养基， 100ml/250ml锥形瓶)，编号1-9，平均分为三组，从第一天开始：第一组作为自然对照组，加入5％无菌生理盐水，第二组加入5％无菌空白培养基，第三组加入5％菌株TK812富集培养液，放置于28℃，100rpm摇床中培养，光照强度 3000lx,12h:12h光照黑暗循环，每隔24h取样，通过血球计数板对小球藻进行计数。
表格5菌株TK812对小球藻的生长状况的影响log(CFU/ml)
Figure GDA0002967553040000112
Figure GDA0002967553040000121
由以上数据可以看出，培养基的加入会对小球藻产生一定抑制作用，但菌株TK812对小球藻抑制作用不明显，显微镜镜检时发现商业化的小球藻中含有微量附生菌，这些菌在加入空白营养肉汤培养基后会大量增殖，造成部分小球藻死亡，但实验组在镜检时未发现与空白对照组相同情况，可能与文献中报道的同类菌株可产生抑菌物质有关。
实施例5枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812高效抑藻活性菌粉、抑藻活性菌乳液的工业化生产制备
(1)菌种活化及一级种子液制备
将菌株TK812甘油以2％的接种量接种于呈有100ml种子液培养基的500ml 挡板瓶中作为一级种子液，一级种子液培养条件为37℃，220rpm摇床通气培养 36h。
所述菌株TK812甘油管制备方法为：将菌株TK812营养肉汤培养基富集液用无菌生理盐水稀释至菌浓为107CFU/ml后按1％比例接种于盛有100ml甘油管培养基的500ml挡板瓶中，在37℃、220rpm摇床条件下培养48h，待芽孢产生后将盛有发酵液的挡板瓶在82℃条件下水浴30min，目的是为了杀死活菌体保留芽孢，最后待培养液降至室温后加入32％无菌甘油进行工业生产用甘油管制作。
所述的甘油管培养基配方为：葡萄糖1.5％，玉米粉2％，大豆粉1％，酵母浸膏1％，胰蛋白胨1％，矿物盐溶液(NaCl 0.5％，K2HPO4 0.5％，MgSO4 0.02％， MnSO4 0.02％，(NH4)2SO4 0.2％)1％，ph＝7.4，115℃条件下灭菌15min。
所述种子液培养基为：葡萄糖3％，玉米粉2％，麸皮1％，大豆粉2％，酵母浸膏0.5％，矿物盐溶液(K2HPO4 0.5％，MgSO4 0.02％，MnSO4 0.02％，(NH4)2SO4 0.2％)1％，ph＝7.4，115℃条件下灭菌15min。
(2)二级种子液及50L发酵罐发酵。
将培养36h后的一级种子液按5％接种量接种于盛有1L种子液培养基的5L 锥形瓶中，放入37℃摇床进行培养，转速220rpm，培养36h，培养36h后按照 1％接种量接种于盛有30L发酵培养基的50L发酵罐中，转速150rpm，温度37℃，通气，通气量为3:1(V/V·min)发酵48h，按照需求灵活补加酸碱与消泡剂，使得罐内发酵液ph值稳定在7.0-7.4之间。
所述发酵罐发酵培养基配方为：葡萄糖5％，玉米粉3％，麸皮2％，豆粕粉 2％，酵母浸膏1％，矿物盐溶液(K2HPO4 0.5％，MgSO4 0.02％，MnSO4 0.02％， (NH4)2SO4 0.2％)1％，115℃条件下灭菌25min。
(3)高效抑藻活性菌粉的制备与抑藻活性菌乳液的制备
高效抑藻活性菌粉的制备：利用GQ80-LD高速管式分离机对发酵菌液进行离心，离心条件为6000rpm，15min，发酵液上清分3次喷淋至相同质量的干燥粘土上，喷淋过程中要对粘土进行翻搅，每次喷淋之后置于35℃环镜风干，也可将多批发酵液喷淋至同一批粘土，最后将喷淋菌液粘土在40℃条件下烘干至水分含量不高于5％，经过粉碎后活菌数为109CFU/g即为枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812高效抑藻活性菌粉。
抑藻活性乳液的制备：管式离心机沉淀按质量比加入3％吐温80、14％甘油，混匀后即为抑藻活性菌乳液。
抑藻活性颗粒的制备：发酵液不进行离心，直接将发酵液与粘土按质量比1： 1.5混合，然后通过造粒机将混合好的颗粒压制成直径为4mm的颗粒，即为抑藻活性颗粒。
实施例6高效抑藻活性菌粉、抑藻活性乳液及抑藻活性颗粒对自然藻华蓝藻富集液的抑制实验
自然藻华蓝藻水样取自常州爆发蓝藻水华的常州虾蟹养殖塘，取样后于常温可见光状态下运至实验室，取50ml加入到盛有50ml无菌湖水BG11培养基(按照BG11培养基配方，以湖水为溶剂进行配置，使用时摇匀沉淀后分装。)的250ml 三角瓶中，于自然光照条件下培养一周，然后扩培至2L，经过镜检发现其中主要藻华藻类为颤藻或鱼腥藻。
具体实施方法为：将富集后的藻华培养液摇匀，以每瓶100mL的分装量分装于15个相同250mL规格的锥形瓶内，最后将15瓶藻华富集液平均分为5组，编号一、二、三、四、五组，其中第一组添加0.5％(W/V)的实施例5中使的无菌粘土，第二、三分别添加0.5％(W/V)实施例5中制备的高效抑藻活性菌粉、第四组添加抑藻活性乳液及0.25％(W/V)的抑藻活性颗粒，第五组设为空白对照，不添加任何东西，分别于第1天，第3天，第7天取样，测定富集液中叶绿素含量，测定结果如下：
表格6微生态制剂及活性颗粒对藻华富集培养液的抑制作用(叶绿素含量(μg/L))
Figure GDA0002967553040000141
由以上结果可得出，与未添加任何物质的空白蓝藻富集液相比，粘土及实施例5中提供的高效抑藻活性菌粉、抑藻活性乳液和抑藻活性颗粒对藻华蓝藻均有抑制效果，但实施例5中提供的高效抑藻活性菌粉、抑藻活性乳液及抑藻活性颗粒抑藻效果均高于单纯黏土。
以上实施实例仅仅代表本发明的几种实施方式，公开了本发明初步优化的实施方式，但本发明仅仅局限于此，任何本领域技术人员在不违背本发明的根本基础上，可做相应增添或简化，本发明保护范围以权利 要求书所限定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌斯氏亚种（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）TK812
<400> 1
ctatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg cttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact 180
tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcaacga 240
tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt 420
tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg 540
caggcggttc cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa 600
actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 720
agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840
gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960
ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080
ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260
tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag tgac 1434

Claims (6)

1.一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种，其特征在于，具体为枯草芽孢杆菌斯氏亚种（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）TK812，保藏编号：CGMCC NO. 20996。
2.一种包含权利要求1所述枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812的菌剂，其特征在于，
所述菌剂为活性菌粉，是将TK812发酵液离心后的上清与粘土混合风干粉碎后获得的菌粉，粉碎后的TK812菌粉活菌数到达109-1010CFU/g；或
所述菌剂为活性乳液，是将TK812发酵液离心后的沉淀中加入1-5%的吐温80、10-20%的甘油，混匀后获得的乳液；或
所述菌剂为活性颗粒，是将TK812发酵液与粘土按质量比1：1.5-2混合，再通过造粒机压制成颗粒获得的。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，发酵液的制备方法如下：
（1）将菌株TK812甘油管按1-5%接种量接种于种子液培养基中，一级种子液培养条件为30-40℃，200-250rpm摇床通气培养24-48h；
（2）一级种子液按1-10%接种量接种于种子液培养基中，30-40℃，200-250rpm，培养24-36h，培养完成后按照1-5%接种量接种于发酵培养基中，转速100-150rpm，温度30-40℃，通气量为2-3:1，发酵36-60h，pH值稳定在7.0-7.4之间。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，
种子液培养基组成为：葡萄糖2-3%，玉米粉2-3%，麸皮1-2%，大豆粉1-2%，酵母浸膏0.1-0.5%，矿物盐溶液1-2%，其余为水，pH=7.0，115℃条件下灭菌15min；
矿物盐溶液组成为：K2HPO40.5-1%，MgSO4 0.01-0.05%，MnSO4 0.01-0.05%，(NH4)2SO40.1-0.5%，其余为水；
发酵培养基组成为：葡萄糖2-5%，玉米粉1-3%，麸皮1-2%，豆粕粉1-2%，酵母浸膏1-2%，矿物盐溶液0.5-1%，其余为水，pH=7.0，115℃条件下灭菌25min；
矿物盐溶液组成为：K2HPO4 0.5-1%，MgSO4 0.02-0.03%，MnSO4 0.02-0.05%，(NH4)2SO40.2-0.5%，其余为水。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种TK812或权利要求2所述菌剂在抑制蓝藻水华中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，当水体中出现肉眼可见的藻华颗粒以后，添加上述活性菌粉或活性乳液，使用量为每1kg活性菌粉用于200-260立方米水体，或每1kg抑藻活性乳液泼洒200-300立方米水体。
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