CN112625947B - 一株强溶磷枯草芽孢杆菌及其炭基微生物复合肥和应用 - Google Patents

一株强溶磷枯草芽孢杆菌及其炭基微生物复合肥和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开强溶磷枯草芽孢杆菌及其炭基微生物复合肥和应用，所述枯草芽孢杆菌于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19564。本发明的枯草芽孢杆菌产芽孢能力强且保持稳定，溶解出的无机磷含量达到179 mg/L，卵磷脂的降解率最高达到100%。本发明采用落叶制备的生物质炭，含有较高的氮、磷、钾养分，利用落叶生物质炭结合强溶磷能力的枯草芽孢杆菌得到了落叶炭基微生物复合肥料，与施用常规化肥相比，施用落叶炭基微生物复合肥仍能使菠菜产量提高60‑64%，与不施肥和施用常规化肥相比，施用落叶炭基微生物复合肥显著提高菠菜的可溶性糖和Vc含量，降低了菠菜中硝酸盐含量，从而促进蔬菜生长和品质提升。

Description

一株强溶磷枯草芽孢杆菌及其炭基微生物复合肥和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株强溶磷枯草芽孢杆菌及其炭基微生物复合肥和应用。
背景技术
磷是生物重要的营养元素之一。磷参与了植物体内许多重要化合物的结构；磷参与了植物体内许多代谢过程；磷可以增强植物的抗逆性。我国土壤全磷的含量较高，大致在0.44-0.85g/kg范围内，但是土壤中大部分磷素以难溶性的磷酸钙盐存在，能被植物直接吸收利用的有效磷含量很低，因此造成土壤溶液中的磷满足不了当季作物对磷的需求。我国自50年代施用磷肥以来，积存于土壤中的难溶态磷高达6000万吨，超过目前全国磷肥10年消费量的总和。开发和有效利用这部分被土壤固定的磷是目前我国农业生产中急需解决的问题。
微生物可以分泌多种生理活性物质，直接刺激、调节植物生长；产生抗病和抗逆作用，间接促进植物生长。因此，施用能够分解土壤中难溶态磷的溶磷微生物肥料，使其在作物根际形成一个磷素供应较充分的微区，改善作物磷元素的供应，是一个符合现代农业和未来农业发展的重要途径。然而，大多数菌种进入土壤后由于难与土著微生物竞争，很难存活。芽孢杆菌因具有芽孢和较强的耐热抗逆性，在发酵工艺、剂型加工、贮存、繁殖等方面具有优势。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的常见菌种，但目前我们能够利用的具有溶磷作用的枯草芽孢杆菌还仅仅是极少数的一部分，技术成熟的更是少之又少，筛选解磷效率高的枯草芽孢杆菌，开发有效的微生物肥料，改善土壤磷环境对绿色农业发展具有重要意义。
随着我国城市化发展，城市绿化面积不断增加，由此产生的修剪枝、枯木落叶等园林废弃物规模巨大且逐年递增，仅北京市郊区每年产生的园林废弃物总量已超过400万吨。目前，园林废弃物多被作为固体垃圾填埋和焚烧，不仅给城市发展和垃圾处理增添巨大压力，而且造成环境污染和资源的浪费。行道树在春、秋季的集中性落叶，给城市环卫带来了极大的困扰。落叶并非垃圾，其含有大量的C、N、P、K等养分，将其资源化回收利用成为近年来的研究热点。近十年来，园林废弃物资源化利用途径主要是发酵堆肥。然而，堆肥过程仍存在一些问题，如发酵过程中会产生H2S，释放异味；堆肥温度只能达到70℃左右，无法杀死病原菌等。新近发展的生物质炭化技术能够将落叶等废弃物质在高温和限氧条件下热解产生生物质炭，克服了堆肥避免的问题，成为落叶等园林废弃物资源化利用的一条新的途径。然而，仅将落叶转化为生物质炭，尚不足以完全实现落叶的价值，“叶落归根”才是落叶资源化循环利用的最终归趋。
发明内容
发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株强溶磷的枯草芽孢杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了枯草芽孢杆菌在溶解有机磷和/或无机磷中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种炭基微生物复合肥。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的炭基微生物复合肥在蔬菜种植中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株强溶磷的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌简称为CNBG-PGPR-1，于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19564，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明内容还包括所述的枯草芽孢杆菌在溶解有机磷和/或无机磷中的应用。
其中，所述无机磷包括但不仅限磷酸三钙，其他无机磷也可以适用。
其中，所述有机磷包括但不仅限于卵磷脂，其他有机磷也可以适用。
本发明内容还包括所述的枯草芽孢杆菌在制备炭基微生物复合肥中的应用。
本发明内容还包括一种炭基微生物复合肥，所述炭基微生物复合肥是将枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1培养成芽孢形态并负载于生物质炭上获得。
其中，所述生物质炭为落叶炭生物质炭，所述落叶炭生物质炭可以包括但不仅限于法国梧桐落叶、银杏落叶、杨树落叶、栾树落叶等。
其中，所述生物质炭占复合肥总重量的20-40％，所述枯草芽孢杆菌为芽孢率≥80％的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的发酵液，所述发酵液占复合肥总重量的20-30％。
其中，所述炭基微生物复合肥还包括氮磷钾、皂土和石膏。
其中，所述氮磷钾占复合肥总重量的27-30％、皂土和石膏占复合肥总重量的13％。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1产芽孢能力强而且保持稳定，在25小时候后芽孢生成率均可以达到80％以上，菌液静置9天后芽孢生成率超过90％，3d内产芽孢率仍能维持在80％-90％，同时接种第6d，溶解出的无机磷含量达到179mg/L，接种2d，菌株CNBG-PGPR-1对卵磷脂的降解率为97％，6d时达到100％。
2、本发明采用落叶制备的生物质炭，结合本实验室分离纯化出的具有强溶磷能力的枯草芽孢杆菌，提供了落叶炭基微生物复合肥料，与施用常规化肥相比，本发明施用落叶炭基微生物复合肥仍能使菠菜产量提高60-64％，同时，与不施肥和施用常规化肥相比，施用落叶炭基微生物复合肥显著提高菠菜的可溶性糖和Vc含量，降低了菠菜中硝酸盐含量，从而促进蔬菜生长和品质提升。
附图说明
图1、枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1在平板上的菌落形态；
图2、显微镜100倍镜下枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1细胞形态；
图3、枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1***进化树；
图4、枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的芽孢染色显微镜图片；
图5、落叶炭基微生物复合肥对菠菜产量的影响；
图6、落叶炭基微生物复合肥对菠菜品质的影响。
具体实施方式
下面将结合以大肠杆菌为宿主菌的实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的分离、鉴定
(1)样品稀释与涂布
取0.5g土壤样品(采自江苏南京周边农田)于4.5mL无菌生理盐水中悬浮震荡，即为10-1梯度(十倍稀释)，从该稀释液中取出0.5mL于4.5mL无菌生理盐水中悬浮震荡，即为10-2梯度(百倍稀释)，以此类推，直至稀释至10-6梯度。分别从6个稀释梯度的稀释液中吸取100μL，涂布于Nutrient Agar(NA)固体培养基平板上，平行制备2份，倒置，放于30℃恒温培养箱中培养24-36h，不定时观察。
(2)菌株分离与纯化
将同一样品下所有长出菌落的平板取出，选出单菌落明显且数量适中的稀释度平板，将平板上形态不一样的菌落挑至新的NA平板上，并进行分区纯化，重复纯化直至单菌落出现，后再重复划线培养至少5次。
(3)染色与保藏
挑取待检测菌株的菌落于载玻片中央区域，经过草酸铵-结晶紫染液初染、碘液媒染、75％乙醇脱色、番红复染四个步骤后，显微镜镜检观察，记录染色结果；将完成纯化和染色的单菌落从NA固体培养基平板上挑至无菌NA液体培养基中，200r/min、30℃下培养24±2h，震荡摇匀后，将60％无菌甘油：菌液按V∶V＝1∶1进行混合，分装于无菌保菌管中，标记并置于-80℃冰箱中保藏。
(4)菌株鉴定
将含有对应编号菌株的平板从4℃冰箱中取出，挑取单菌落为DNA模板，进行PCR扩增和16S rDNA测序与序列比对，具体操作如下：
①扩增体系50μL：
50μL体系有以下五部分组成：Taq酶Mix(25μL)、上游引物27F(1μL)、下游引物1492R(1μL)、DNA模板(1μL)、ddH2O(22μL)。其中27F序列为：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3’，1492R序列为：5’-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。扩增出的片段长度为1401bp，扩增出的核苷酸序列见末页。
②扩增条件
预变性温度：105℃
第一步变性：95℃ 7min；95℃ 30s
第二步退火：55℃ 30s
第三步延伸：72℃ 90s
循环次数：95℃ 30s，33次循环
第四步最后延伸：72℃ 5min
第五步保持：12℃ 10min
③琼脂糖凝胶电泳
称取1g琼脂糖溶解于100mL TBE电泳缓冲液，微波加热至溶液澄清透明，加入1‰的GelRed核酸染料，摇晃均匀，静置至无气泡，缓慢倒入胶板，静置1h左右，取出凝固的胶块置于电泳槽中，在每个胶孔中加入4μL PCR扩增产物，120V 20min跑胶，取出胶块置于凝胶成像仪中，选择UV光照并拍照，记录胶块上1500bp处条带清晰的对应样品编号，将该样品的剩余PCR扩增产物置于4℃冰箱。
④DNA纯化
将4℃冰箱中贮藏的PCR扩增产物取出，使用AxyPrepTM PCR Cleanup Kit核酸纯化试剂盒纯化PRC产物。
⑤序列鉴定
将上述步骤得到的重悬DNA，送至南京擎科生物科技有限公司测序，将邮件返回的序列输入至NCBI网站的序列检索栏目中进行检索，比对结果，结果显示，本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1(CGMCC No.19564)菌株的菌落形态为：在平板培养基表面菌落较小，圆形，整体扁平，奶白色，表面粗糙不透明，边缘呈锯齿状、质地均匀，前期表面光滑，后期表面褶皱明显。于油镜下观察到的筛选出的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的菌体呈杆状，细胞长度为2μm～3μm，宽度为0.7μm～0.8μm，周身鞭毛，能运动。革兰氏染色结果为紫色，即为革兰氏阳性菌。
该枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19564。
实施例2枯草芽孢杆菌在NA培养基中芽孢的产生
(1)培养基配制
液体培养基a：NB液体培养基：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1L。
液体培养基b：LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1L。
(2)芽孢生成与扩大培养
从平板上挑取单菌落到配制好的装有5mL液体培养基a或b的离心管中，30℃，200rpm震荡培养。从19h开始取样，涂片自然干燥，通过火焰加热固定，滴加5％孔雀绿染色液，加热，在30秒钟内使其冒蒸汽3-4次，切勿沸腾，冷却后，自来水冲洗30秒，加0.5％沙黄复染液，3秒后，水洗，风干，镜检计数，结果见图4。细菌营养体呈红色，芽孢呈绿色。枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1在NB和LB培养基中振荡培养19个小时候开始形成芽孢，25小时候后芽孢生成率均可以达到80％以上，菌液静置9天后芽孢生成率超过90％。
将上述种子液转接入50mL，进而转接入1L和5L发酵罐放大培养时，枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的产芽孢能力保持稳定，3d内产芽孢率仍能维持在80％-90％，可以满足工业发酵生产要求。
实施例3枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的无机磷溶解能力
(1)培养基的配制
无机磷液体培养基成分为葡萄糖10g，磷酸三钙5g，碳酸钙0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，水1L。
(2)无机磷溶解能力
取出菌株CNBG-PGPR-1冻存在-80℃冰箱中的保菌管，冰上解冻至流体状，震荡混匀，用接种环挑取适量菌液于NA固体平板上进行三区划线，将平板置于30℃下恒温培养24±2h，挑取单菌落纯化1-2次并作鉴定确认，确认无误后挑取单菌落至NA液体培养基中活化，离心去NA培养基，将菌泥重悬于等体积的无菌生理盐水中，按体积比5％的接种量将菌株CNBG-PGPR-1的重悬液加入无机磷液体培养基中，每个处理组三个重复，同时设置不添加菌液的空白对照，动态取样测定液体中磷含量。
无机磷培养基以磷酸三钙为磷来源，添加量为999.42mg/L，测定方法参照国标GB17378.4-2007“磷钼蓝分光光度法”进行溶液中无机磷酸盐的测定，结果见表1。接种菌株后，溶液中磷含量随培养时间逐渐增加。接种2d时，本发明提供的菌株CNBG-PGPR-1溶解除的无机磷含量显著高于对照组，且随着时间的延长溶磷量快速增加。接种第6d，溶解出的无机磷含量达到179mg/L。以上结果表明菌株CNBG-PGPR-1可快速降解无机磷并释放至周围环境中，且可保持长时间的释放能力。
表1溶液中释放出的无机磷含量(mg/L)
Figure BDA0002839016520000061
Figure BDA0002839016520000071
实施例4枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的有机磷溶解能力
(1)培养基的配制：
有机磷液体培养基成分为葡萄糖10g，卵磷脂2g，碳酸钙5g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，水1L。
(2)有机磷降解能力的定量
取出菌株CNBG-PGPR-1冻存在-80℃冰箱中的保菌管，冰上解冻至流体状，震荡混匀，用接种环挑取适量菌液于NA固体平板上进行三区划线，将平板置于30℃下恒温培养24±2h，挑取单菌落纯化1-2次并作鉴定确认，确认无误后挑取单菌落至NA液体培养基中活化，离心去NA培养基，将菌泥重悬于等体积的无菌生理盐水中，按体积比5％的接种量将枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的重悬液加入有机磷液体培养基中。每个处理设三个重复，同时设置不添加菌液的空白对照，动态取样测定有机磷含量。
有机磷培养基以大豆卵磷脂为磷来源，纯度为90％以上，添加量为5g/L，参照国标GB/T 35867-2018“高效液相色谱蒸发光散射检测法”进行溶液中有机磷含量的测定，结果见表2。接种2d，菌株CNBG-PGPR-1对卵磷脂的降解率为97％，6d时达到100％，表明本发明提供的菌株CNBG-PGPR-1具备很强的降解有机磷能力。
表2卵磷脂降解率(％)
Figure BDA0002839016520000072
实施例5混合落叶生物质炭及其养分测定
将法国梧桐落叶、银杏落叶、杨树落叶、栾树落叶晾干，称重，装入定制金属罐，压实，置于马弗炉中，采用热裂解工艺制备生物质炭。初始炉温200℃，程序升温10℃/min，最终温度500℃，滞留时间1h，自然冷却，得到法国梧桐落叶炭。称重，计算产率。混合落叶炭中的全量养分测定采用硫酸-过氧化氢消化法消煮，凯氏定氮法测定全氮，矾钼黄法测定全磷，火焰光度法测定全钾。混合落叶炭的产率为33％，固碳量为43.57％。混合落叶炭的全量养分N，P和K总体较高，分别为10.03g/kg，4.28g/kg和16.5g/kg，适合作为肥料制作。
实施例6落叶炭基微生物肥料
将落叶炭生物质炭、尿素、磷酸一铵、硫酸钾分别粉碎过20目筛；称取一定量的落叶生物质炭、尿素、磷酸一铵、硫酸钾、皂土与石膏，搅拌均匀后放入圆盘造粒机中，将芽孢率≥80％的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的发酵液，初始浓度(1.6±0.2)×109个/mL，缓缓喷入，与原料均匀混合造粒。各组分所占比例按重量百分比如下：
1、落叶生物质炭40％，尿素10％，磷酸一铵9％，硫酸钾8％，皂土10％，石膏3％，菌液20mL(20％)；
2、落叶生物质炭30％，尿素15％，磷酸一铵9％，硫酸钾8％，皂土10％，石膏3％，菌液25mL(25％)；
3、落叶生物质炭20％，尿素15％，磷酸一铵10％，硫酸钾12％，皂土10％，石膏3％，菌液30mL(30％)。
成型后的颗粒放入电热鼓风干燥箱中，在30-40℃下干燥(也可在太阳下晾晒干燥)、定型。干燥定型完成后将颗粒肥料过1mm和4.75mm金属筛，保留1mm-4.75mm粒径的肥料，装袋封存。
对以上3种落叶炭基微生物复合肥料按照中华人民共和国农业行业标准NY/T2321-2013进行检测，结果见表3。按照以上配方，即落叶生物质炭20％-40％，菌液20％-30％，尿素、磷酸一铵和硫酸钾27％-37％，皂土10％，石膏3％生产出的落叶炭基微生物肥料，其有机质(干基)含量为20％-36.5％，有效养分(N+P2O5+K2O)为15％-21％，水分11％-13％，pH6.3-6.8，有效活菌数为1.8-2.6亿/g，均符合国家复合微生物肥料标准(NY/T 798-2015)。
表3不同配方落叶炭基微生物复合肥技术指标
Figure BDA0002839016520000081
Figure BDA0002839016520000091
实施例7落叶炭基微生物肥料对蔬菜产量和品质的提升效果
在江苏丰县(34°37′53″N，116°36′53″E)开展肥效评价田间实验。实验设置五个处理，处理1为不施肥的对照(CK)；处理2为化肥(CF)，所用化肥为史丹利复合肥，养分含量N∶P2O5∶K2O＝15∶15∶15；处理3为实施例1中分离纯化出的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1，初始浓度(1.6±0.2)×109个/mL，芽孢率≥80％；处理4为实施例5中的落叶炭(使用前再次灭菌)；处理5为实施例6中配方1-3的落叶炭基微生物复合肥(CB1，CB2，CB3)。每个处理设置三个重复，每个重复小区面积为20m2。再按照以上设计施肥，处理2施肥量按照厂家推荐施用量0.8‰/kg，即120kg/亩；处理5落叶炭基微生物肥施用量为16.8kg/亩，按照有效养分计算大约是处理2化肥的70％。处理3和处理4中菌液和生物质炭的施用量参照处理5，按照最大含量，菌液30％，落叶炭40％换算，折算后为菌液5.04L/亩，落叶炭6.52kg/亩。平整土地后，将菠菜种子均匀拨入已施入土壤中，浇水，覆土。菠菜整个生长周期统一常规管理，一个月后收获。每个小区选取1m×1m区域进行采样，称重计算产量，参见图5，采用蒽酮比色法测定菠菜可溶性糖含量，考马斯亮蓝法测定菠菜中的可溶性蛋白，水杨酸比色法测定菠菜中的硝酸盐含量，维生素C(Vc)含量测定采用滴定法，结果见图6。与不施肥的对照相比，施用落叶炭基微生物复合肥能够提高菠菜产量1.66-1.73倍；与施用常规化肥相比，施用落叶炭基微生物复合肥处理，有效养分为化肥减量施用30％的情况下，仍能使菠菜产量提高60-64％。同时，与不施肥和施用常规化肥相比，施用落叶炭基微生物复合肥提高了菠菜的可溶性糖和Vc含量，降低了菠菜中硝酸盐含量。由以上结果可以看出，落叶炭基微生物复合肥能够菠菜的产量和品质显著提升作用。

Claims (10)

1.一株强溶磷的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CNBG-PGPR-1，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19564。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1在溶解有机磷和/或无机磷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述无机磷来源于磷酸三钙。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述有机磷来源于卵磷脂。
5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1在制备炭基微生物复合肥中的应用。
6.一种炭基微生物复合肥，其特征在于，所述炭基微生物复合肥是将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1培养成芽孢形态并负载于生物质炭上获得。
7.根据权利要求6所述的炭基微生物复合肥，其特征在于，所述生物质炭为落叶炭生物质炭。
8.根据权利要求6所述的炭基微生物复合肥，其特征在于，所述生物质炭占复合肥总重量的20-40%，所述枯草芽孢杆菌为芽孢率≥80%的枯草芽孢杆菌CNBG-PGPR-1的发酵液，所述发酵液占复合肥总重量的20-30%。
9.根据权利要求6所述的炭基微生物复合肥，其特征在于，所述炭基微生物复合肥还包括氮磷钾、皂土和石膏，所述氮磷钾占复合肥总重量的27-37%、皂土和石膏占复合肥总重量的13%。
10.权利要求6~9任一项所述的炭基微生物复合肥在蔬菜种植中的应用。
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