CN112624975A - 一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用 - Google Patents

一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用。本发明设计合成一种妥拉唑林半抗原、人工抗原，并通过妥拉唑林半抗原与载体蛋白偶联后免疫新西兰大白兔获得高特异性的妥拉唑林多克隆抗体，并建立了一种保健食品中妥拉唑林的快速免疫检测方法，实现了能够快速检测保健食品中妥拉唑林的目的，对降压类保健食品中非法添加药物的***具有重大意义。

Description

一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种妥拉唑林半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用。
背景技术
截至到2019年，我国18岁及以上高血压患病人口规模达到3.58亿，占总人口的31.89％，且呈逐年上升趋势。高血压不仅是一种高发性心血管疾病，而且是其它慢性疾病的重要诱因，如慢性肾病、冠心病、脑中风等，而随着我国老龄化程度的逐渐增加，慢性疾病成为我国疾病死亡率之首。另一方面，随着我国物质生活的改善，人民对生活品质也提出了更高的要求。在这种背景下，辅助降血压类保健食品便迎合了广大消费市场的需求，成为一种高收益的产品。但是，一些唯利是图者为了获取更高的利润，往往在其产品中添加一些西药成分，来使产品达到其所夸大虚假宣传的作用。而妥拉唑林便是一种常被添加的降压类化学药品。
妥拉唑林(TOL)是一种短效α-受体阻断剂，能选择性与α受体结合，竞争性阻断神经递质或α受体激动剂与α受体结合，从而产生拮抗α受体激动现象的药物，在临床上主要用于治疗高血压、***增生等疾病。患者在不知情的情况下，若同时服用其他降压类西药，将会造成肝、肾、心脏的损伤及不良反应，严重者可导致死亡。
为了规范辅助降血压类保健食品，市场监管总局发布《食品中5种α-受体阻断类药物的测定》食品补充检验方法的公告〔2018年第28号〕，该方法规定了食品(含保健食品)中酚妥拉明、妥拉唑林、哌唑嗪、特拉唑嗪、育亨宾的高效液相色谱-串联质谱测定方法，此外，保健食品中妥拉唑林的检测方法还有薄层色谱法、高效液相色谱法等。这类方法虽然准确度高，但仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作，不符合现场即时检测的要求。因此，解决如何快速、准确检测保健食品中妥拉唑林非法添加的问题，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术对妥拉唑林检测方法的不足和缺陷，提供一种可应用于快速检测妥拉唑林的半抗原及人工抗原，以及灵敏度高、特异性强的特异性人工抗体，利用该人工抗体可以实现对保健食品中妥拉唑林的快速免疫检测，能够快速、准确地检测保健食品中妥拉唑林非法添加的问题。
本发明的第一个目的在于提供一种妥拉唑林半抗原及其在制备妥拉唑林人工抗原中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种妥拉唑林人工抗原。
本发明的第三个目的在于提供一种免疫检测妥拉唑林的人工抗原组合物。
本发明的第四个目的在于提供所述妥拉唑林半抗原和/或所述妥拉唑林人工抗原在制备妥拉唑林人工抗体中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种妥拉唑林人工抗体。
本发明的第六个目的在于提供一种妥拉唑林的免疫检测试剂盒。
本发明的第七个目的在于提供一种妥拉唑林的免疫检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明设计合成一种妥拉唑林半抗原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002804760480000021
其中n＝2～6。
因此本发明要求保护上述妥拉唑林半抗原在制备妥拉唑林人工抗原中的应用。
进一步优选地，妥拉唑林半抗原的制备方法为：往乙腈溶剂中加入妥拉唑林、溴-酸酯和无水碳酸钾，反应完全后脱去乙腈溶剂，萃取，保留有机相，得到中间产物；用甲醇溶液溶解中间产物，再加入氢氧化锂溶液进行水解，待反应完成后，调节pH，脱去溶剂，萃取，保留水相，脱去溶剂后得到妥拉唑林半抗原。
本发明还要求保护一种妥拉唑林人工抗原，其结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002804760480000031
优选地，所述载体蛋白为乳铁蛋白、鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
更优选地，所述载体蛋白为乳铁蛋白、鸡卵清蛋白。
本发明还要求保护一种妥拉唑林人工抗原组合物，包括妥拉唑林免疫原和妥拉唑林包被原，所述妥拉唑林免疫原由上述半抗原与乳铁蛋白偶联所得，其结构式如式(Ⅲ)所示；所述妥拉唑林包被原由上述半抗原与鸡卵清蛋白偶联所得，其结构式如式(Ⅳ)所示：
Figure BDA0002804760480000032
上述妥拉唑林半抗原和/或上述妥拉唑林人工抗原在制备妥拉唑林人工抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还要求保护一种妥拉唑林人工抗体，利用上述妥拉唑林人工抗原制备得到。
优选地，所述人工抗原为上述妥拉唑林免疫原，所述人工抗体为多克隆抗体。
更优选地，所述人工抗体由上述妥拉唑林免疫原免疫动物后分离纯化实验动物的抗血清得到。
上述人工抗原组合物在检测妥拉唑林或制备用于检测妥拉唑林的免疫检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还要求保护一种妥拉唑林的免疫检测试剂盒，利用上述人工抗原组合物制备得到。
优选地，利用所述的免疫原制备得到的妥拉唑林抗体标记辣根过氧化物酶，作为酶结合物。
优选地，所述包被原包被于酶标板。
优选地，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒，包括酶标记的妥拉唑林人工抗体、妥拉唑林包被原处理过的酶标板、妥拉唑林标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液。
更优选地，所述底物显色液包括过氧化脲和四甲基联苯胺。
更优选地，所述终止液为硫酸。
进一步优选地，所述终止液为2mol/L硫酸。
更优选地，所述洗涤液包括吐温、叠氮化钠防腐剂和磷酸盐缓冲液。
进一步优选地，所述洗涤液各组分为：0.5％～1.0％(w/v)吐温-20、0.01％～0.03％(w/v)叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7。
优选地，所述试剂盒还可为胶体金检测试纸条，包括PVC底板、样品垫、结合垫、NC膜、检测T线、质控C线、吸水垫；
所述结合垫结合有标记利用所述免疫原制备得到的妥拉唑林抗体的金标记抗体；所述NC膜上结合有以上所述妥拉唑林包被原和羊抗鼠IgG，妥拉唑林包被抗原为检测线T点，羊抗兔IgG为对照线C点。
更优选地，所述金标记抗体为抗体浓度为30μg/mL的胶体金溶液。
更优选地，将包被原作为检测T线，以羊抗兔IgG作为对照C线。
本发明还要求保护一种妥拉唑林的免疫检测方法，利用上述人工抗原组合物或上述试剂盒。
优选地，一种妥拉唑林的酶联免疫检测方法，利用上述酶联免疫检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1.将样本和标准品加入到包被有所述包被原的酶标板的微孔中，然后加入酶结合物工作液，避光反应；
S2.将微孔内液体甩干，加入洗涤工作液，洗涤后拍干，再加入底物显色液，避光反应；
S3.将终止液加入微孔中，用酶标仪测定每孔OD值。
S4.分别绘制标准品和样品的标准曲线，进行定量检测结果分析。
酶结合物为辣根过氧化物酶标记的妥拉唑林多克隆抗体，所述妥拉唑林多克隆抗体利用所述免疫原制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明设计合成一种妥拉唑林半抗原和人工抗原，并通过半抗原与载体蛋白偶联后免疫新西兰大白兔获得灵敏度高、特异性强的妥拉唑林多克隆抗体，并建立了一种保健食品中妥拉唑林的快速免疫检测方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低等优点，适用于现场大量样品的快速检测，实现了能够快速检测保健食品中妥拉唑林的目的，对保健食品中非法添加药物的***具有重大意义。
附图说明
图1为妥拉唑林半抗原TOL-4C合成路线。
图2为妥拉唑林半抗原TOL-6C合成路线。
图3为妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF合成路线。
图4为妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF紫外扫描鉴定图。
图5为妥拉唑林包被原TOL-6C-OVA合成路线。
图6为妥拉唑林包被原TOL-6C-OVA紫外扫描鉴定图。
图7为妥拉唑林抗体间接竞争ELISA标准曲线。
图8为妥拉唑林胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图，其中1：PVC底板；2：样品垫；3：结合垫；4：NC膜；5：检测线(T线)；6：质控线(C线)；7：吸水垫。
图9为妥拉唑林胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1妥拉唑林半抗原的合成与鉴定
1、妥拉唑林半抗原TOL-4C的合成
妥拉唑林与4-溴-丁酸甲酯经亲核取代后水解得具有式(Ⅰ)-1所示妥拉唑林半抗原TOL-4C，合成路线如图1所示。具体合成步骤如下：
(1)往50mL圆底两口烧瓶中加入15mL乙腈，加入妥拉唑林480mg(3mmol)、无水碳酸钾276.42mg(2mmol)，混合均匀后逐滴加入4-溴-丁酸甲酯456μL(3.6mmol)，85℃回流反应6小时。经薄层液相色谱(TLC)检测，反应完全，减压脱去乙腈溶剂，用乙酸乙酯和水充分萃取，保留有机相，得到中间产物4-(2-苄基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)丁酸甲酯。
(2)将300mg中间产物加入圆底烧瓶，加入5mL甲醇溶液溶解，再加入10mL 10％氢氧化锂溶液，在室温下搅拌三小时水解。经TLC检测反应完成后，滴加1mol/L HCl溶液调酸至5～6，脱去溶剂，用乙酸乙酯和水充分萃取，保留水相，过柱后旋干溶剂得到目标产物TOL-4C(4-(2-苄基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)丁酸)，结构式如(Ⅰ)-1所示。
TOL-4C质谱结果：MS：C14H18N2O2：246.14.，ESI+[M-H]+：247.3
Figure BDA0002804760480000061
2、妥拉唑林半抗原TOL-6C的合成
妥拉唑林与6-溴-己酸乙酯经亲核取代后水解得具有式(Ⅰ)-2所示妥拉唑林半抗原TOL-6C，合成路线如图2所示。具体合成步骤如下：
(1)往50mL圆底两口烧瓶中加入15mL乙腈，加入妥拉唑林480mg(3mmol)、无水碳酸钾276.42mg(2mmol)，混合均匀后逐滴加入6-溴-己酸乙酯638μL(3.6mmol)，85℃回流反应6小时。经薄层液相色谱(TLC)检测，反应完全，减压脱去乙腈溶剂，用乙酸乙酯和水充分萃取，保留有机相，得到中间产物6-(2-苄基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)己酸乙酯。
(2)将300mg中间产物加入圆底烧瓶，加入5mL甲醇溶液溶解，再加入10mL 10％(v/v)氢氧化锂溶液，在室温下搅拌三小时水解。经TLC检测反应完成后，滴加1mol/L HCl溶液调酸至5～6，脱去溶剂，用乙酸乙酯和水充分萃取，保留水相，过柱后旋干溶剂得到目标产物TOL-6C(6-(2-苄基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)己酸)，结构式如式(Ⅰ)-2所示。
TOL-6C质谱结果：MS：C16H22N2O2：274.17，ESI+[M-H]+：275.3
Figure BDA0002804760480000071
实施例2妥拉唑林免疫原的合成与鉴定
1、妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF的合成
以实施例1制备得到的TOL-4C作为半抗原，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(LF)，合成TOL-4C-LF，其合成路线如图3所示，结构式如(IV)所示。
Figure BDA0002804760480000072
(1)准确称取2mg TOL-4C，1mg NHS和2mg EDC溶解于150μL DMF中，室温下避光搅拌4小时，得到TOL-4C活化液；
(2)10mg乳铁蛋白(LF)加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将TOL-4C活化液缓慢逐滴加入LF溶液中，4℃反应12小时；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即TOL-4C-LF，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，PBS缓冲液的配方为：Na2HPO4·12H2O2 90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
2、妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF的鉴定
取上述合成的妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF，进行紫外扫描。具体地，取LF、免疫原、半抗原分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并比较偶联前后的各物质的最高吸光值。
结果如图4所示，发现妥拉唑林免疫原TOL-4C-LF的吸收曲线与载体蛋白LF明显不同，LF在250nm为峰谷，而偶联反应后，在250nm处，TOL-4C-LF的吸收峰明显比LF高，且对比TOL-4C的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与TOL-4C的复合物，说明偶联成功。
实施例3妥拉唑林包被原的合成与鉴定
1、妥拉唑林包被原TOL-6C-OVA的合成
以实施例1制备得到的TOL-6C作为半抗原，通过活泼酯法偶联鸡卵清蛋白(OVA)，合成TOL-6C-OVA，合成路线如图5所示,结构式如(V)所示。
Figure BDA0002804760480000081
(1)准确称取2mg TOL-6C、1mg NHS和2mg EDC溶解于150μL DMF中，室温下避光搅拌4小时，得到TOL-6C活化液；
(2)将10mg鸡卵清蛋白(OVA)加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将TOL-6C活化液缓慢逐滴加入OVA溶液中，4℃反应12小时；
(4)用PBS缓冲液(配方同实施例2)透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即TOL-6C-OVA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
2、妥拉唑林包被原TOL-6C-OVA的鉴定
取上述合成的妥拉唑林包被原TOL-6C-OVA，进行紫外扫描。具体地，取OVA、免疫原、半抗原分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并比较偶联前后的各物质的最高吸光值。
结果如图6所示，发现妥拉唑林免疫原TOL-6C-OVA的吸收曲线与载体蛋白OVA明显不同，OVA在250nm为峰谷，而偶联反应后，在250nm处，TOL-6C-OVA的吸收峰明显比OVA高，且对比TOL-6C的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与TOL-6C的复合物，说明偶联成功。
实施例4妥拉唑林多克隆抗体的制备
将实施例3中制备好的免疫原TOL-4C-LF与等量的免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。
将2.5～3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血的测定值为准，结果表明半抗原TOL-4C-LF对应的抗血清效价为1：128000。
实施例5抗体的特异性及灵敏度测定
一、实验方法
依据实施例4的效果，使用抗血清绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线；使用磷酸吐温缓冲液(PBST，0.1mol/L，pH＝7.4)作为所有样品的稀释液，使用INN-cBSA作为包被原：将50μL系列浓度的妥拉唑林药物标准品和50μL适当稀释倍数的妥拉唑林多特异性抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D，其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。
二、实验结果
以妥拉唑林为标准品建立ELISA的标准曲线，最低检测限为0.35ng/mL，半抑制浓度为7.4ng/mL。结合图7可知，以妥拉唑林为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好。
实施例6检测妥拉唑林的酶联免疫试剂盒的开发
1、酶结合物
酶结合物为辣根过氧化物酶标记的妥拉唑林多克隆抗体。
2、酶标板的制备
用包被缓冲液将妥拉唑林包被原稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
3、检测妥拉唑林的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测妥拉唑林的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被原(妥拉唑林半抗原与载体蛋白的偶联物)处理过的酶标板；
(2)妥拉唑林标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，1μg/L，10μg/L，100μg/L，1000μg/L。
(3)辣根过氧化物酶标记的妥拉唑林多克隆抗体。
(4)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(5)终止液为2mol/L硫酸；
(6)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％v/v吐温-20、0.01％～0.03％w/v叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
4、实际样品检测
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即1份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样本50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔的OD值。
5、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以妥拉唑林标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图；将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中妥拉唑林的实际浓度。
实施例7妥拉唑林胶体金快速检测试纸条的研制
1、金标抗体和金标结合物垫的制备
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回流条件下，把100mL 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1mL 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min，冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。
胶体金在与抗体标记前以0.2mol的K2CO3溶液调到pH为8.2左右，采用经典NaCl滴定法确定30μg抗体标记1mL胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％w/v BSA(使最终BSA浓度为1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。加入胶体金溶液同体积的5％w/v BSA溶液重悬，4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的TB溶液(含3％w/v BSA、3％w/v蔗糖、0.01mol/L硼酸钠和0.05％w/v叠氮化钠)重悬，4℃保存。用XYZ-3000三维喷膜仪把4％w/v BSA溶液以8μL/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以6μL/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜
用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/mL的包被抗原以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/L的羊抗兔IgG以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔8mm。
3、快速试纸条的组装
试纸条的组装如图8所示，把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条，即得妥拉唑林胶体金快速检测试纸条。
实施例8保健品中妥拉唑林的快速免疫检测方法
1、检测样品液的制备
根据保健品的形态不同作不同方式的前处理：
(1)口服液等液态保健品：取100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
(2)片剂：去外层糖衣，研磨成粉，将粉末用5倍体积处理液(含50％甲醇的碳酸盐缓冲液，pH 9.6)溶解，涡旋3min，3000r/min离心6min取上清100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
(3)胶囊：去囊衣，将粉末用5倍体积处理液(含50％甲醇的碳酸盐缓冲液，pH 9.6)溶解，涡旋3min，3000r/min离心6min取上清100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
2、快速检测试纸条检测及判断
当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形对照线6(羊抗兔IgG)结合，使隐形对照线6显红色。隐形对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效，判定结果如图9所示。
3、检出限的测定
往空白口服液，硬胶囊，软胶囊，片剂样品中添加一系列浓度的标准药物，经样品前处理，用上述胶体金试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。具体结果见表1。
表1标准药物的检出限
Figure BDA0002804760480000121
Figure BDA0002804760480000131
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种妥拉唑林半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002804760470000011
其中n＝2～6。
2.权利要求1所述妥拉唑林半抗原在制备妥拉唑林人工抗原中的应用。
3.一种妥拉唑林人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述妥拉唑林半抗原与载体蛋白偶联所得，其结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0002804760470000012
4.根据权利要求3所述妥拉唑林人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为乳铁蛋白、鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
5.一种妥拉唑林人工抗原组合物，其特征在于，包括妥拉唑林免疫原和妥拉唑林包被原，所述妥拉唑林免疫原由权利要求1所述半抗原与乳铁蛋白偶联所得，其结构式如式(Ⅲ)所示；所述妥拉唑林包被原由权利要求1所述半抗原与鸡卵清蛋白偶联所得，其结构式如式(Ⅳ)所示：
Figure FDA0002804760470000013
6.权利要求1所述妥拉唑林半抗原和/或权利要求3所述妥拉唑林人工抗原在制备妥拉唑林人工抗体中的应用。
7.一种妥拉唑林人工抗体，其特征在于，利用权利要求3所述妥拉唑林人工抗原制备得到。
8.权利要求5所述人工抗原组合物在检测妥拉唑林或制备用于检测妥拉唑林的免疫检测试剂盒中的应用。
9.一种妥拉唑林的免疫检测试剂盒，其特征在于，利用权利要求5所述人工抗原组合物制备得到。
10.一种妥拉唑林的免疫检测方法，其特征在于，利用权利要求5所述人工抗原组合物或权利要求9所述试剂盒进行检测。
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