CN112618579B - 一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂和制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂和制备方法及应用，包括，丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌和长双歧杆菌，其中，所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为10¹～10²⁰个/ml。本发明中的复合益生菌制剂显著降低了断奶仔猪腹泻率和死亡率。在仔猪日龄第6‑20天，将制备的复合益生菌制剂灌服至长×大二元杂交仔猪胃中，灌服剂量为5～10毫升/次，日服一次。与实施磷酸盐缓冲液(PBS)灌服的对照组相比，该复合益生菌制剂灌服组在断奶(21日龄)后第1～15天阶段的腹泻率显著降低了87％，死亡率降了70％。该复合益生菌制剂有效预防了仔猪腹泻。

Description

一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂和制备方法及应用

技术领域

本发明属于复合益生菌制剂技术领域，具体涉及到一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂和制备方法及应用。

背景技术

仔猪是现代化养猪生产的核心，其健康状况对后期的生长发育产生极其重要的影响。在实际生产中，为追求养猪经济效益最大化，国内外集约化养猪生产中普遍采用仔猪早期断奶的技术。但由于仔猪自身的免疫***发育还不完全，早期仔猪断奶时期环境变化、日粮变化、饲养方式不当使仔猪免疫力减弱，降低肠道抗体水平，有利于致病性大肠杆菌和其他有害微生物的侵入导致仔猪在断奶期发生腹泻，给养殖业带来巨大的损失。为减少这一风险，在过去的多年里，抗生素作为生长促进因子被大量用于畜禽养殖业，为养殖业做出了巨大贡献。但是，抗生素的长期大量使用，破坏了机体的微生态平衡，导致耐药菌的产生和细菌的变异。近几年，多重耐药性大肠杆菌引起的断奶仔猪腹泻发病率不断升高，严重影响仔猪成活率，并容易造成动物内源性感染或二次感染。抗生素在养殖业的淡出及全面禁止是大势所趋。因此，亟需研究开发一种新型制剂，有效的抗生素替代品控制仔猪腹泻。

目前，疫苗和益生菌制剂进行防治最为引人注目。然而由于产肠毒素大肠杆菌血清型多，变异性大，抗原复杂，实际使用疫苗效果反应不一，而且存在成本高，运输和保存条件要求也较高，且使用减毒活疫苗有体内返毒的风险。因此，疫苗的大规模推广困难较大。益生菌作为一种活菌制剂，具有促进营养物质代谢吸收，刺激动物免疫***，增强动物抗病能力，特别是肠道益生菌，可以促进动物肠道免疫***的发生发展且绿色无残留等优点受到各国研究者的广泛关注。

目前，已有益生菌作为饲料添加剂降低仔猪腹泻率的相关研究，由于益生菌本身存在一些不利因素例如，抑菌效果参差不齐；胃肠液不耐受；胆汁不耐受；抗生素不耐受等问题导致益生菌制剂在实验室条件下往往具有良好效果，但在生产条件下往往很难达到预期效果。同时可用于抑制致病菌预防或治疗仔猪腹泻的优良益生菌种严重缺乏，可用于微生态制剂的菌种更少，相关产品也较为单一。因此，筛选高效抑菌的菌种，制备具有高效防治仔猪腹泻效果的复合微生态制剂成为当前的研究热点。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂，包括，丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌和长双歧杆菌，其中，所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为10¹～10²⁰个/ml。

作为本发明所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的一种优选方案，其中：所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为10⁵～10¹⁵个/ml。

作为本发明所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的一种优选方案，其中：所述丁酸梭菌活菌数为10⁶～10⁷CFU/g，罗伊氏乳酸杆菌活菌数为10⁸～10⁹CFU/g，长双歧杆菌活菌数为10⁷～10⁸CFU/g。

作为本发明所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的一种优选方案，其中：所述复合益生菌制剂中，丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌和长双歧杆菌活菌数量比为1：0.5～5：0.5～5。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的制备方法，包括，将丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌三种菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到三种细菌悬液；将制得的三种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用新鲜培养基重悬细菌沉淀，将三种活菌悬液按比例混合均匀后利用微囊化处理，将三种混合益生菌制备成含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊，即为防治仔猪腹泻复合益生菌制剂。

作为本发明所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂制备方法的一种优选方案，其中：所述丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌和长双歧杆菌三种益生菌，均为本实验室分离保存的高效抑菌菌株。

作为本发明所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂制备方法的一种优选方案，其中：所述将三种活菌悬液按比例混合均匀后利用微囊化处理，其为：

按比例将三种益生菌悬液混合作为种子液备用，每毫升复合益生菌制剂中总活菌数量为10¹～10²⁰个；微囊化步骤：向50L种子罐中加入800g海藻酸钠，200g碳酸钙，33L蒸馏水，混合均匀，灭菌后加入复合益生菌种子液10⁵～10¹⁵cfu·mL^-1，充分混匀作为水相；在500L发酵罐中，向160L液体石蜡添加体积百分含量为0.2％的Span80作为油相，将水相泵入油相，转速85r/min搅拌5min，然后逐滴加入400mL冰醋酸，反应10min，保持转速，使碳酸钙中的钙离子释放，与海藻酸钠中的钠离子进行置换反应，形成内部包被微生物活细胞的海藻酸钙凝胶珠；向反应体系中加入CaCl₂溶液，使微胶囊缓慢沉降于下层水相中，回收上层油相，无菌水冲洗微胶囊，喷干后，进口温度为120℃，出口温度80℃，得到含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊。

本发明的另一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在制备治疗或预防断奶仔猪致病性大肠杆菌感染的免疫制剂中的应用，提供防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在制备改善断奶仔猪肠道微生态环境的药物中的应用以及防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在在制备降低断奶仔猪致病性大肠杆菌感染性腹泻的药物中的应用。

本发明有益效果：

(1)本发明中的复合益生菌制剂显著降低了断奶仔猪腹泻率和死亡率。在仔猪日龄第6-20天，将制备的复合益生菌制剂灌服至长×大二元杂交仔猪胃中，灌服剂量为5～10毫升/次，日服一次。与实施磷酸盐缓冲液(PBS)灌服的对照组相比，该复合益生菌制剂灌服组在断奶(21日龄)后第1～15天阶段的腹泻率显著降低了87％，死亡率降了70％。该复合益生菌制剂有效预防了仔猪腹泻。

(2)本发明中的复合益生菌制剂不仅能够减低断奶仔猪腹泻率和死亡率，还能够提高动物的生长性能，增强机体对病原菌的抵抗力，刺激机体免疫应答的产生，并维持机体较高水平的免疫应答。给断奶仔猪饲喂本发明中的复合益生菌制剂，在致病性大肠杆菌感染的情况下能够显著改善机体肠道微生态环境，提高机体对病原菌的抵抗力。

(3)本发明所述的复合益生菌制剂能够抑制有害病原菌的定植和繁育，减少抗生素作为预防和治疗动物疾病的作用在饲料中的长期亚治疗剂量和超高剂量添加，避免饲用抗生素滥用导致的细菌耐药性、抗生素药物残留和食品安全等方面的危害。本发明中的复合益生菌制剂能够显著提高肠粘膜免疫水平，减少或避免肠道疾病的发生，维持肠道的微生态平衡。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明三株高效抑菌益生菌菌株图；

图2为实施例2中的实验设计流程图；

图3为益生菌和E.coli K88的排出情况图；

图4为复合益生菌制剂对E.coli K88感染试验仔猪生存率的影响图；

图5为复合益生菌制剂对E.coli K88感染试验仔猪肠组织结构形态的影响图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明中长双歧杆菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号：BNCC186143；丁酸梭菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号：BNCC337239；罗伊氏乳酸杆菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号：BNCC237526。

实施例1：

一种抗致病性大肠杆菌感染的复合益生菌制剂，包括丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌，其制备方法为：

将丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌三种菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到三种细菌悬液；

将制得的三种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用新鲜培养基重悬细菌沉淀；

按比例将三种益生菌悬液混合作为种子液备用，每毫升复合益生菌制剂中总活菌数量为10¹～10²⁰个；

向50L种子罐中加入800g海藻酸钠，200g碳酸钙，33L蒸馏水，混合均匀，灭菌后加入复合益生菌种子液10⁵～10¹⁵cfu·mL^-1，充分混匀作为水相；

在500L发酵罐中，向160L液体石蜡添加体积百分含量为0.2％的Span80作为油相，将水相泵入油相，转速85r/min搅拌5min，然后逐滴加入400mL冰醋酸，反应10min，保持转速，使碳酸钙中的钙离子释放，与海藻酸钠中的钠离子进行置换反应，形成内部包被微生物活细胞的海藻酸钙凝胶珠；

向反应体系中加入CaCl₂溶液，使微胶囊缓慢沉降于下层水相中，回收上层油相，无菌水冲洗微胶囊，喷干后，进口温度为120℃，出口温度80℃，得到含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊，将三种混合益生菌制备成含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊，即为防治仔猪腹泻复合益生菌制剂。

实施例2：

将实施例1制得的抗仔猪腹泻大肠杆菌感染的复合益生菌制剂，其应用过程如下：实验前对所有仔猪进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)筛选，采用ETEC筛选平板对仔猪肛周棉拭子进行涂板平培养，如发现ETEC及时淘汰。

21日龄断奶仔猪40头。随机将仔猪平均分为组，Control组(I，10头)；Escherichiacoli K88+0.9％Nacl组(II，10头)；益生菌+Escherichia coli K88组(III，10头)；抗生素+Escherichia coli K88组(IV，10头)，实验流程如图2所示，具体试验流程：

第1-7天早上9点分别灌服0.9％Nacl 10mL；0.9％Nacl 10mL；复合益生菌制剂10mL；0.9％Nacl 10mL；

第8天早上9点分别灌服0.9％Nacl 10mL；E.coli K8810¹⁰cfu/mL 10mL；E.coliK8810¹⁰cfu/mL 10mL；E.coli K8810¹⁰cfu/mL 10mL，12小时后实验组IV皮下注射抗生素。

第1-17天分别于第1、4、8、16天早上10点收集粪便用于粪便菌群培养。

第18天五组均屠宰，取肝、脾、空肠、回肠、结肠、肠系膜***组织样及内容物。

试验猪饲养于南京农业大学动物医学院临床试验动物房，密闭猪舍漏缝地板，网上平养，仔猪饲喂标准基础日粮(NY/T 65-2004)，自由采食、饮水。每天早上8点清扫圈舍，观察临床症状，包括每天体温、粪便等级、仔猪状态、体重等数据的采集记录。

每天早晚(8:00，20:00)各测一次体温。每天3次人工足量添料(早上8:00；中午14:00；晚上20:00)，自由饮水。次日早晨称量食槽中剩余的饲料重量并记录，计算每天每组的采食量(饲喂量一剩余量)。试验周期为18天。

试验结果：

1、复合益生菌制剂对E.coli K88的抑菌效果

在实验第1、4、8、16天细菌平板计数检测饲喂的益生菌菌数；第8(0、6和12h)、9、13、16天细菌平板计数检测E.coli K88，结果如图3所示。

实验结果表明三种益生菌的排菌量较稳定，无显著差异，说明三种益生菌在仔猪肠道内能够稳定定植(图3A)。在攻菌后6h后E.coli K88组、益生菌保护组和抗生素保护组均有沙门菌的排出，且一直持续到试验结束(192h)。对照组在整个试验期间菌没有沙门菌检出。同时，在攻菌后第4d益生菌保护组中的E.coli K88活菌数显著低于E.coli K88组(P<0.05)，其抑菌效果与抗生素保护组一致(P>0.05)，为该复合益生菌制剂替代抗生素提供数据支持(图3B)。

2、复合益生菌制剂对E.coli K88感染仔猪腹泻率的影响

在整个试验期间，每天检测各组仔猪的粪便情况，腹泻评分标准：

1分：固态，但不坚硬；能弯曲，有分段；捡拾粪便后地面无或少量粘黏粪；

2分：圆木状，没有或很少有可见的分段，表面湿润，捡拾后地面有残留，但粪便维持形状；

3分：非常潮湿；明显可见的圆木状粪便，捡拾后地面有残留且粪便不能维持形状；

4分：非常潮湿但有明显形状；呈堆状而不是明显的圆木样；捡拾后地面有残留且粪便不能维持形状；

5分：有纹理但没有一定的形状，呈堆状或斑点状；捡拾后地面有残留；

6分：水样，无纹理，扁平摊开，呈胶状。

每天对粪便结果进行汇总，每头猪每天***的粪便得分总和大于等于2，定义为腹泻，结果如表1所示。

表1复合益生菌制剂对断奶仔猪腹泻的影响

Group/item	Atrisk(n)	Withdiarrhea(n)	Diarrhearate(％)
				I	10	0	0
II	10	10	100
				III	10	4	40
IV	10	4	40

实验结果显示与E.coli K88组100％的腹泻率相比，复合益生菌制剂保护组的腹泻率下降至40％，并且与抗生素组的保护效果一致。该指标表明复合益生菌制剂在预防仔猪方面发挥一定作用。

3、复合益生菌制剂对E.coli K88感染仔猪生存率的影响

每天对仔猪死亡情况进行汇总，结果如图4所示。实验结果表明与E.coli K88组相比复合益生菌制剂能显著提高仔猪的生存率。

4、复合益生菌制剂对E.coli K88感染仔猪生长性能的影响

试验猪于试验开始之前进行预饲，试验开始和结束时空腹12h称重，按公式计算试验期平均日增重。平均日增重＝(试验末重－试验初重)/试验天数。

自试验开始后每天详细记录每个重复育肥猪的饲喂量及每周的剩料量，按公式计算平均日采食量和料重比。平均日采食量＝试验期总采食量/试验天数；料重比＝试验日总采食量/试验日总增重，结果表2所示。

表2复合益生菌制剂对断奶仔猪生长性功能的影响

注：数据后所标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，所标字母不同表示差异显著(P＜0.05)

5、复合益生菌制剂对E.coli K88感染仔猪肠道炎症的影响

每头仔猪空肠、回肠、结肠H&E染色切片进行镜检，评分标准见表3。

表3肠炎评判标准

将每一项的分值累加得到每头猪每段肠管的肠炎分值，总分为18分。0分：正常；1-5分：轻度炎症；6-10分：中度炎症；11-18分：重度炎症，结果如图5所示。E.coli K88可引起空肠、回肠和结肠重度炎症，并且炎症程度显著高于其余三组。主要表现为严重的中性粒细胞浸润，黏膜层脱落，轻度的中央乳糜管扩张，黏膜下层水肿等。

于E.coli K88组比较，添加复合益生菌制剂组中的空肠、回肠和结肠也有轻微的炎症病理变化，但仍可观察到益生菌可明显降低由E.coli K88引起的肠道炎症。

本发明丁酸梭菌能够促进动物肠道有益菌群(双歧杆菌,乳酸杆菌)的增殖和发育，能使糖类发酵形成大量丁酸、醋酸和乳酸等短链脂肪酸，这些短链脂肪酸能维持酸性环境，降低肠道的pH值，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生，大幅度降低腹泻率；丁酸梭菌的主要代谢产物是生物丁酸，是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质，对于预防和治疗肠炎、促进二次消化有着独特的作用。罗伊氏乳杆菌的主要代谢产物之一是罗伊氏菌素(reuterin)，可以抑制有害菌如大肠杆菌、沙门氏菌等的生长，保护肠道的微生态平衡；其次，罗伊氏乳杆菌细胞外存在黏附素，使其对宿主的黏膜黏液以及肠黏膜上皮细胞均表现较强的黏附能力。长双歧杆菌的主要代谢产物之一是乙酸，乙酸具有强酸性，能够提高肠内酸度，抑制痢疾、伤寒、肿瘤细胞等怕酸致病菌。此外，生活于肠道内的双歧杆菌.能在肠道黏膜上生长形成一道膜菌群，构成一道生物学屏障.从而使入侵的致病菌在肠道内失去生长繁殖的落足点。

本发明中的复合益生菌制剂显著降低了断奶仔猪腹泻率和死亡率。在仔猪日龄第6-20天，将制备的复合益生菌制剂灌服至长×大二元杂交仔猪胃中，灌服剂量为5～10毫升/次，日服一次。与实施磷酸盐缓冲液(PBS)灌服的对照组相比，该复合益生菌制剂灌服组在断奶(21日龄)后第1～15天阶段的腹泻率显著降低了87％，死亡率降了70％。该复合益生菌制剂有效预防了仔猪腹泻。

本发明中的复合益生菌制剂不仅能够减低断奶仔猪腹泻率和死亡率，还能够提高动物的生长性能，增强机体对病原菌的抵抗力，刺激机体免疫应答的产生，并维持机体较高水平的免疫应答。给断奶仔猪饲喂本发明中的复合益生菌制剂，在致病性大肠杆菌感染的情况下能够显著改善机体肠道微生态环境，提高机体对病原菌的抵抗力。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于：包括，

将丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌三种菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到三种细菌悬液；

将制得的三种细菌悬液分别离心获取细菌沉淀，用新鲜培养基重悬细菌沉淀，按比例将三种益生菌悬液混合作为种子液备用，每毫升复合益生菌制剂中总活菌数量为10¹～10²⁰个；

向50L种子罐中加入 800g海藻酸钠，200g碳酸钙，33L蒸馏水，混合均匀，灭菌后加入复合益生菌种子液10⁵～10¹⁵cfu·mL^-1，充分混匀作为水相；

在500 L发酵罐中，向160 L液体石蜡添加体积百分含量为0.2%的Span80作为油相，将水相泵入油相，转速85 r/min 搅拌5 min，然后逐滴加入400 mL冰醋酸，反应10 min，保持转速，使碳酸钙中的钙离子释放，与海藻酸钠中的钠离子进行置换反应，形成内部包被微生物活细胞的海藻酸钙凝胶珠；

向反应体系中加入CaCl₂溶液，使微胶囊缓慢沉降于下层水相中，回收上层油相，无菌水冲洗微胶囊，喷干后，进口温度为120℃，出口温度80℃，得到含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊，即为防治仔猪腹泻复合益生菌制剂；

其中，所述复合益生菌制剂中，丁酸梭菌、罗伊氏乳酸杆菌和长双歧杆菌活菌数量比为1：0.5～5：0.5～5；

所述长双歧杆菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号为BNCC186143；所述丁酸梭菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号为BNCC337239；所述罗伊氏乳酸杆菌来源于北京北纳创联生物技术研究院，资源编号为BNCC237526。

2.如权利要求1所述防治仔猪腹泻复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于：所述复合益生菌制剂中，总活菌数量为10⁵～10¹⁵个/ml。

3.如权利要求1或2所述方法制备的防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在制备治疗或预防断奶仔猪致病性大肠杆菌感染的免疫制剂中的应用。

4.如权利要求1或2所述方法制备的防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在制备改善断奶仔猪肠道微生态环境的药物中的应用。

5.如权利要求1或2所述方法制备的防治仔猪腹泻复合益生菌制剂在制备降低断奶仔猪致病性大肠杆菌感染性腹泻的药物中的应用。

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