CN112618578A

CN112618578A - 肠膜明串珠菌tci007或其代谢产物用于改善过敏状况的用途

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Publication number: CN112618578A
Application number: CN202011019107.2A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 邱渝凯
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN112625936B; CN112625936A; TWI764295B; TW202113066A; TWI815042B; TW202113065A; CN112618578B

Abstract

一种肠膜明串珠菌TCI007或其代谢产物用于改善过敏状况的用途，其中肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存于财团法人食品工业发展研究所(寄存编号为BCRC 910981)、以及寄存于德国微生物保藏中心(DSMZ)(寄存编号为DSM33502)。

Description

肠膜明串珠菌TCI007或其代谢产物用于改善过敏状况的用途

技术领域

本发明关于一种肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)或其代谢产物，特别是关于一种肠膜明串珠菌TCI007或其代谢产物用于改善过敏状况的用途。

背景技术

益生菌(Probiotics)一般认为是指食入后对宿主(或称受体，如动物或人类)有正面效益的食入性微生物。其命名源于希腊语「for life」(对生命有益)，又称为「原生保健性菌种」；并且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。

一般而言，「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物进行发酵生产多量乳酸的细菌总称，为一相当庞杂的菌群。在诸多乳酸菌的菌种中，部分乳酸菌菌种的菌株经研究发现其对于受体健康有益，故此些菌株被视为益生菌。换言之，益生菌大部分是乳酸菌，但乳酸菌中只有少数经研究证明对受体健康有益的菌株能被称为益生菌。

举例来说，常见的可作为益生菌的乳酸菌的菌种包括肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，而可作为益生菌的酵母菌的菌种包括酵母菌属(Saccharomyces)。

乳杆菌属是一群具有发酵能力、兼性厌氧、不会产生孢子的革兰氏阳性杆菌。乳杆菌因能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名，可用于制造液态酸奶、固态奶酪等各种发酵食品。

发明内容

本发明的一目的，在于提供一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备改善过敏状况的组合物的用途，其中肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroidesTCI007)寄存于财团法人食品工业发展研究所，且寄存编号为BCRC 910981。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007菌株包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007菌株具有生成多醣的能力。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物用以降低组织胺含量。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物用以改善肠道菌相。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007的有效剂量为5X10⁹cells。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007改善肠道菌相为增加双歧杆菌(Bifidobacterium)。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007改善肠道菌相为减少嗜血杆菌(Haemophilus)。

本发明的另一目的，在于提供一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备免疫调节的组合物的用途，其中肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroidesTCI007)寄存于财团法人食品工业发展研究所，且寄存编号为BCRC 910981。

在一些实施例中，肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物具有提升嗜中性球吞噬作用的功能。

本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。

附图说明

图1是细胞实验中组织胺含量检测的结果图；

图2是细胞实验中IL-8基因相对表现量的结果图(**表示与空白组比较有显著差异，p<0.01；#表示与比较组比较有显著差异，p<0.05)；

图3是细胞实验中嗜中性球吞噬能力的结果图(**表示与空白组比较有显著差异，p<0.01；#表示与比较组比较有显著差异，p<0.05)；

图4是人体实验中，第0周、第4周、第8周量测组织胺的结果图(**表示与第0周有显著差异，p<0.01)；

图5是人体实验中，第0周、第4周、第8周检测双歧杆菌比例(物种丰富度)的结果图；

图6是人体实验中，第0周、第4周、第8周检测嗜血杆菌比例(物种丰富度)的结果图。

生物材料的保藏

肠膜明串珠菌TCI007，于2019年03月27日提交至中国台湾财团法人食品工业发展研究所保藏，地址：中国台湾新竹市，保藏号：BCRC 910981；

肠膜明串珠菌TCI007，于2020年4月17日提交至德国微生物保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)保藏，地址：德国布伦瑞克市因霍芬大街7B，保藏号：DSM33502。

具体实施方式

为了使本领域具有通常知识者能了解本发明的特点，以下就说明书及申请专利范围中提及术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有说明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本文中所述用语「改善过敏状况」是指缓解过敏相关症状，具体来说是降低一或多种过敏反应的指标，例如但不限于降低组织胺、改善肠道菌相、减少流鼻水、鼻塞情况。在较佳的一个具体态样中，指降低血清中的组织胺、增加肠胃道的双歧杆菌以及减少肠胃道的嗜血杆菌。

本文所述的用语「肠道菌相」，是指一个体的肠内的微生物分布情况，包含微生物种类及比例。本文所述的用语「改善肠道菌相」，是指改变一个体的肠内的微生物种类及种类，特别是改变肠道内益生菌的种类及比例，以朝向降低过敏反应的生理状态。

本文所述的用语「组合物」，组合物为食品、保养品或医药品，特别是指食品。

本文所述的用语「吞噬作用」，是指细胞内吞作用的特殊形式，是将周围环境中的固体颗粒例如细菌等通过小泡的形式吞食进入细胞内部，在较佳的一个具体态样中，吞噬作用是指嗜中性球(Neutrophil)在人体有外来物入侵时诱发的非专一性吞噬作用。

本案发明人自人体母乳中筛选出一新颖菌株，经16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)序列分析，依亲缘关系鉴定为Lactobacillus gasseri(中文名称为肠膜明串珠菌)，且经命名为Leuconostoc mesenteroides TCI007(以下称为肠膜明串珠菌TCI007)，其寄存于财团法人食品工业发展研究所(寄存编号为BCRC910981)、及德国微生物保藏中心(DSMZ)(寄存编号为DSM33502)。该肠膜明串珠菌TCI007具有如SEQ ID NO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。

本案发明人研究发现，肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物具有改善过敏状况的功效。因此，本发明提供一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备改善过敏状况的组合物的用途，其中，该改善过敏状况所指可为：降低组织胺含量、改善肠道菌相或其组合。

本案发明人研究发现，肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物具有免疫调节的功效。因此，本发明提供一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备改善免疫调节的组合物的用途，其中，该改善过敏状况所指可为提升嗜中性球吞噬作用。

根据本发明，所采用的肠膜明串珠菌TCI007的代谢产物可以是透过在适于肠膜明串珠菌TCI007生长的环境下进行培养所产生者。例如：先以适当的培养液对肠膜明串珠菌TCI007进行培养，其后，视需要地去除前述培养液中的菌体等固体物，以获得含有代谢产物的液体。或例如，先以适当的培养液对肠膜明串珠菌TCI007进行培养，其后，以离心等方法使菌体沉降于底部，再直接吸取上清液所获得含有代谢产物的液体。

可选用任意合宜的培养液以进行肠膜明串珠菌TCI007的培养，以提供所欲的代谢产物，只要该培养液可提供肠膜明串珠菌TCI007生长、代谢所需养分(如酵母菌萃取物、蛋白质及葡萄糖)与条件(如酸碱值)即可。此外，肠膜明串珠菌TCI007的培养时间亦无特殊限制，只要足以使肠膜明串珠菌TCI007完成至少一次代谢循环即可。举例言之，于本发明一具体实施态样中，以MRS培养液对肠膜明串珠菌TCI007进行培养，历时18小时，使菌株进行代谢作用并产生代谢产物。

于本发明中，可直接使用经历肠膜明串珠菌TCI007的代谢循环的含肠膜明串珠菌TCI007与代谢产物的培养液，或使用经移除肠膜明串珠菌TCI007等固体物的含代谢产物的液体。可采用任何合宜的操作以移除固体物，只要对培养后所产生的代谢产物的所欲效益没有不利的影响即可。一般而言，采用物理手段以移除固体物，该物理手段包括，例如：离心分离、滤膜过滤、沉淀倾析等操作。视需要地，可重复或合并进行前述物理操作，以尽可能去除培养液中的菌体等固体物。

根据本发明所提供的组合物可为食品组合物，食品组合物可以为健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食类、饼干、***锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。

根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用，端视投予个体的年龄、体重、及健康状况而异。亦可针对特定族群的需要，调整据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品中的肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物的含量，例如，调整至每日应服用的量。

针对根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品及/或特殊营养食品，可于其外包装上标示建议使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕妇等)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项等，以利用户在无医师、药师或相关执事人员的指导下自行服用而无安全虞虑。于根据本发明所提供的食品组合物中，有关该肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物的态样，系如上述说明。

视需要地，可于根据本发明所提供的食品组合物、或饲料组合物中另外含有合宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物、食品组合物、或饲料组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物、食品组合物、或饲料组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。

以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书范围所示。

实施例

[制备实施例]

A：肠膜明串珠菌TCI007的筛选与鉴定

(A-1)筛选

将天然有机无花果(产地：中国台湾)的全果打碎成黏稠汁液状后，与MRS培养液(MRS broth)以体积比1：100(无花果体积为1)的比例混合，并置于37℃下进行厌氧培养(氧气浓度介于10％至1％，较佳为低于5％)，历时18小时。其后，将前述培养液涂布于MRS固态培养基(MRS agar)上，并置于37℃下进行厌氧培养，以生成不同的菌落。接着，为确保菌株的单一性，使用无菌接种环挑选一菌落，于固态培养基上进行分区划线，再置于37℃的厌氧培养箱中培养直到单一菌落(single colony)出现。

(A-2)鉴定

取(A-1)所分离出的单一菌落的菌株后，进行基因族谱分析(phylogeneticanalysis)，确认该菌株具有如SEQ ID NO:1所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)在线数据库进行比对，将SEQID NO:1所示的基因序列分别与其他肠膜明串珠菌亚种的16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16S rDNA序列与其他肠膜明串珠菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表1所示。

因此，将此分离菌株命名为肠膜明串珠菌TCI007(后文以TCI007表示)。将此肠膜明串珠菌TCI007以寄存编号BCRC 910981寄存于财团法人食品工业发展研究所，以及以寄存编号DSM33502寄存于德国微生物保藏中心(DSMZ)。

表1

(A-3)保存

使用液态培养的方式将(A-1)所获得的具单一性的肠膜明串珠菌菌株培养于MRS培养液中，以提供菌液，接着于菌液中添加25％的甘油，将所得混合液移至冷冻保存管中后，置于-80℃保存。

B.肠膜明串珠菌TCI007的活化与样品制备

(B-1)活化

将存有肠膜明串珠菌TCI007菌株的冷冻保存管解冻，以1％的植菌量(约1x10⁴CFU/mL)将TCI007菌株接种于MRS培养液中，并置于37℃下进行厌氧培养，历时18小时，以提供肠膜明串珠菌TCI007菌液，供后续实验使用。

(B-2)样品制备

取(B-1)提供的肠膜明串珠菌TCI007菌液，以1％的植菌量(约1x10⁴ CFU/mL)接种于MRS培养液之中，并置于37℃下进行厌氧培养，历时18小时。其后，以5000rpm转速对培养后的菌液进行离心，历时5分钟，再使用0.2μm的滤膜对所获得的上清液进行过滤，所得滤液即为TCI007样品(含有肠膜明串珠菌TCI007的代谢产物)。

[实验实施例]

实施例1：肠膜明串珠菌TCI007的多醣含量

以上述制备实施例中(B-1)活化所述步骤将肠膜明串珠菌TCI007活化。接着，将活化后的肠膜明串珠菌TCI007菌液，以1％的植菌量(约1x10⁴ CFU/mL)接种于20毫升的液态乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TMLactobacilli MRS Broth)中，然后于37℃下进行厌氧培养，分别在培养12小时、24小时时进行取样程序，取样程序包括：取1ml菌液，离心(5000rpm转速)20分钟后取上清液(不含菌体，即为肠膜明串珠菌TCI007的代谢产物或是TCI007的上清液)，此上清液即为本实施例检测多醣含量的测试样本。

多醣含量检测方式如下：

本案以D-葡萄糖(D-Glucose)当量作为总多醣相对含量的表示。故以D-葡萄糖(D-Glucose)作为标准品制作标准曲线(Standard curve)。

首先，精密秤取D-葡萄糖(D-Glucose)(购自J.T.Baker，料号：1916-01)10mg，置于10mL容量瓶中，以二次蒸馏水(ddH₂O)定量至10mL，配置成1mg/mL浓度的D-葡萄糖溶液。

接着，将上述标准品进行系列稀释，以二次蒸馏水稀释为0,20,50,100,150,200μg/mL的D-葡萄糖溶液。可参酌下表2的方式配置标准溶液：

表2：D-葡萄糖溶液标准溶液配置方法

之后，取标准溶液各100μL放置于玻璃试管中，再各加入500μL浓度为5％的苯酚溶液(Phenol)(购自Merck，料号：1.00206.0250)。

接着缓慢加入2.5mL浓度为95.5％，比重1.84的浓硫酸溶液(H₂SO₄)(购自Showa，料号：1970-5250)。经由涡旋(vortex)确保无气泡后，静置20分钟。最后，取200μL样品放入96孔培养盘，于490nm下测定其吸光值，并绘制标准曲线。

将上述的培养12小时及培养24小时所得的TCI007的上清液，以水稀释20倍至1200ml，并取100μL的体积至玻璃试管中，每组样品需三重复。之后，加入500μL浓度为5％的苯酚溶液(Phenol)(购自Merck，料号：1.00206.0250)。

接着缓慢加入2.5mL浓度为95.5％，比重1.84的浓硫酸溶液(H₂SO₄)(购自Showa，料号：1970-5250)。经由涡旋(vortex)确保无气泡后，静置20分钟。最后，取200μL样品放入96孔培养盘，于490nm下测定其吸光值，并以内插法算出浓度后再乘回稀释倍数以取得原TCI007的上清液浓度。

表3：TCI007多醣检测

如表3所示，随着培养时间增加，肠膜明串珠菌TCI007的培养液中的多醣含量提升，可得知肠膜明串珠菌TCI007可分泌或经由其代谢等途径使其培养液中的多醣含量提升，举例而言，经12小时培养的肠膜明串珠菌TCI007的培养液经离心后所得的上清液(不含菌体，为肠膜明串珠菌TCI007的代谢产物)中的多醣含量即为11.15g/L；经24小时培养的肠膜明串珠菌TCI007的培养液经离心后所得的上清液(不含菌体，为肠膜明串珠菌TCI007的代谢产物)中的多醣含量即为32.8g/L。

实施例2：肠膜明串珠菌TCI007调节过敏相关因子的细胞实验

(2-1)TCI007抑制组织胺能力实验

组织胺(histamine)是一种有机含氮的环状化合物，作为身体内的一种化学传导物质，可以影响许多细胞的反应，包括过敏、发炎反应，并具有作为瘙痒介体中心与调节肠道生理功能的作用。因此当过敏反应出现时，降低组织胺也成为改善过敏症状的重要方式。

在此实施例中，利用DNP-HAS诱发碱性粒细胞的组织胺的细胞模式，检测TCI007样品调节组织胺含量的能力。

A实验材料

1.细胞株：大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞RBL-2H3(Rat basophilic leukemiacells，购于ATCC，料号CRT-2256)。

2.培养液：最小必需培养液(Minimum essential medium)(MEM)(Gibco；Cat.11095080)，加入15％胎牛血清FBS(Gibco；Cat.10437-028)以及1％青霉素-链霉素(Gibco；Cat.15140122)。

3.组织胺检测试剂套组(购自USCN，型号CEA927Ge)，套组内含有以下溶液：

3-1：标准液(Standard)

3-2：标准稀释剂(Standard diluent)

3-3：检测试剂A(Detection reagent A)

3-4：检测试剂B(Detection reagent B)

3-5：分析稀释剂A(Assay diluent A)

3-6：分析稀释剂B(Assay diluent B)

3-7：TMB液(TMB substrate)

3-8：终止液(Stop solution)

3-9：清洗液(Wash buffer)

4.抗-DNP-IgE(购自Sigma，型号D8406)。

5.DNP-HAS溶液(dinitrophenyl-human serum albumin)(购自Biosearch，型号D-5059)。

实验前准备

1.1倍DPBS：用灭菌后的dd水将10倍DPBS稀释10倍；

2.1倍胰蛋白酶：用1X DPBS将10倍胰蛋白酶稀释10倍；

3.DNP-HAS溶液：用无血清的MEM配置成最终浓度为1μg/ml；

4.1倍清洗溶液：将20ml的30倍清洗液加入580ml的ddH₂O，混和均匀备用；

5.检测试剂A操作溶液：将检测试剂A以分析稀释剂A稀释100倍。

6.检测试剂B操作溶液：将检测试剂B以分析稀释剂B稀释100倍。

7.标准序列稀释：以2ml标准稀释剂回溶，静置至少10分钟使其充分溶解，达最终浓度100ng/ml，准备5个新的1.5ml微量离心管，分别加入600μl的标准稀释剂，接着在第一管加入300μl的标准液，混和均匀后再从第一管取300μl至第二管，依序稀释至第4管，最后得到浓度为100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml、3.70ng/ml及1.23ng/ml的序列稀释液。

以下简述组织胺检测步骤，详细操作步骤可参照组织胺检测试剂内所附的使用说明书执行。

首先，将RBL-2H3细胞以1.5x10⁵个细胞/孔的密度种入24孔细胞培养盘，培养液体积为500μl/孔，于CO₂培养箱中培养18小时。待细胞贴附后，将培养基换成实验和控制组培养基，培养基成分及额外添加成分如下表4所示。

表4

接着，加入最终浓度为0.2μg/ml的抗-DNP-IgE，反应30分钟。将孔盘内液体移除，加入500μl DNP-HAS溶液，于37度下反应30分钟。反应结束后收集孔盘内的上清培养液备用。接着，将50μl/well的序列稀释(如上述多个浓度)、空白组、控制组以及实验组的上清培养液(不含细胞)加入已预涂且是随时可使用的96孔板(包含在组织胺检测试剂套组中)上，再立即加入50μl/孔的检测试剂A操作溶液，轻摇后，于37度下反应1小时。将孔盘中液体倒出，再加入350μl/孔的1倍清洗液，静至1-2分钟。倒置在纸巾上，尽量移除孔内所有液体。

接着，加入100μl/孔的检测试剂B操作溶液，于37度下反应30分钟。加入90μl/孔的TMB液，于37度下反应10-20分钟(此需避光，且作用不可超过30分钟)。加入50μl/孔的中止溶液，轻拍孔盘使其充分混和(变色)。

最后，以分光亮度计(Thermo Fisher Scientific

)测得O.D.450值，与序列稀释的吸光值比较，求出所测样品(各组别细胞培养液)的组织胺浓度，并使用Excel软件中的student t-test进行统计分析。

经过吸光值的比较换算，空白组所测得组织胺含量为0.025ng/ml，控制组所测得组织胺含量为0.041ng/ml，实验组所测得组织胺含量为0.011ng/ml；详细而言，以DNP-HAS诱发碱性粒细胞的组织胺后，再以0.125％体积百分比(相较于培养基)MRS培养液处理24小时后，组织胺并没有被抑制，然而，若是以DNP-HAS诱发碱性粒细胞的组织胺后，再以0.125％体积百分比(相较于培养基)TCI007上清液处理24小时后，组织胺明显被抑制。

请参阅图1。将空白组的组织胺的含量(0.025ng/ml)视为1(即100％)时，控制组的组织胺的含量(0.011ng/ml)为1.6238(即162.38％)，实验组相对于空白组的组织胺的含量为0.433(即43.30％)，代表细胞经TCI007上清液处理后，组织胺的含量降低，为空白组的0.43倍。

由此可知，当嗜碱性粒细胞经TCI007样品处理后，组织胺的含量被抑制，代表TCI007样品能有效抑制组织胺含量，可抑制过敏情况。

(2-2)TCI007调控免疫相关基因实验

此范例以RNA萃取套组、反转录酶、KAPA

FAST qPCR试剂组配合定量PCR仪，测定人类单核球细胞株受经TCI007样品处理后，细胞中免疫相关基因的变化。

举例来说，免疫相关基因为IL-8基因，IL-8是一种多功能因子，能特异性趋化中性粒细胞进入炎性组织，调节免疫，此处以IL-8基因作为免疫相关基因分析标的。

材料与仪器

1.细胞株(下称细胞)：人类单核球细胞株THP-1(ATCC公司(瑞士),TIB202)。

2.培养基：添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.05mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、100单位/mL青霉素、及100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(GibcoRPMI medium1640；Thermo Fisher Scientific)。

3.RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，型号：.FC24015-G)

4.反转录酶(Super

III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美国，编号18080-051)

5.测量标的基因引子，其中包含IL-8基因，另包括内部控制组(GAPDH基因)。

6.KAPA

FAST qPCR试剂组(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)

7.ABI StepOnePlus^TM实时PCR***(ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))。

8.TCI007样品：此实验中所使用的TCI007样品是透过如上制备实施例中的(B-2)样品制备步骤所获得。

首先，将人类单核球细胞(与此实施例简称为细胞)以每孔1×10⁵个细胞量培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将细胞分为以下三组：对照组、实验组与空白组。

表5：测试条件

详细来说，实验组是将如上实施例(B-2)所制备的TCI007样品0.125％(v/v)浓度的培养基2ml，培养人类单核球细胞株16小时；对照组是将MRS培养液0.125％(v/v)浓度的培养基2ml，培养人类单核球细胞株16小时。

空白组是单纯使用2毫升培养液来培养人类单核球细胞，未再加入其他添加成分，培养人类单核球细胞株16小时，用于作为实验空白组。

以上实验组及空白组，每组进行四重复。

将处理后的细胞(即对照组、实验组)以及空白组的细胞以细胞裂解液分别破细胞膜以形成三组的细胞溶液。接着，以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，LotNo.FC24015-G)分别萃取三组细胞溶液内的RNA。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作为模板，透过Super

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将萃取出的RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlus^TM实时PCR***(ABIStepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPASYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表6的引子(SEQ ID NO:2至SEQ IDNO:5)对两组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-timereverse transcription polymerase chain reaction)以观察三组的人类单核球细胞内的IL-8基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量IL-8基因的mRNA表现量，进而推断IL-8基因编码的蛋白质的表现量。

表6

引子名称	序列编号	序列	长度
				IL-8-F	SEQ ID NO:2	TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA	22
IL-8-R	SEQ ID NO:3	AACCCTCTGCACCCAGTTTTC	21
				GAPDH-F	SEQ ID NO:4	CTGGGCTACACTGAGCACC	19
GAPDH-R	SEQ ID NO:5	AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG	21

需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的各基因的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

请参阅图2。将空白组的IL-8基因的表现量视为1(即100％)时，控制组相对于空白组的IL-8基因的表现量为1.02(即102％)，实验组相对于空白组的IL-8基因的表现量为3.05(即305％)，代表细胞经TCI007样品处理后，IL-8基因的表现量升高，为空白组的3.05倍。

由此可知，当细胞经TCI007样品处理后，细胞内与免疫相关基因的表现量提高，代表TCI007样品有调节免疫的功能。

(2-3)TCI007提升嗜中性球活性实验

嗜中性球为体内数量最多的白血球，在异物入侵时能迅速聚集，透过非专一性吞噬作用吞噬外来物质或病原体，并透过细胞内特定酵素与过氧化物杀死病原体，在人体免疫***中扮演重要的角色。

本实验将样品与绿色荧光颗粒共同加入培养液培养四小时后，藉由测定细胞内聚集荧光颗粒的荧光强度，判断嗜中性球吞噬作用的能力。

实验材料

1.细胞株：嗜中性球Neutrophil(自人类血液分离)

2.培养液：无血清造血细胞培养基(X-VIVOTM 15Serum-free HematopoieticCell Medium)(X-VIVOTM 15)(购自Lonza；型号04-418Q)。

3.SPHERO荧光黄颗粒(Fluorescent Yellow Particles)(购自spherotech；型号Cat.FH-2052-2)

4.TCI007样品：此实验中所使用的TCI007样品是透过如上制备实施例中的(B-2)样品制备步骤所获得。

实验步骤

首先，从人体血液中分离出嗜中性球，以10⁶cells/well的密度种入6孔细胞培养盘，培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，然后将细胞分为以下三组：空白组、控制组与实验组；

表7

接着随即在每个孔中以1:1000的体积比例加入SPHERO荧光黄颗粒共培养4小时，收取细胞后以1倍PBS清洗细胞1次，去除上清液(去除未被嗜中性球吞噬的荧光黄颗粒)，以1ml/管的1倍PBS重新悬浮细胞，以流式细胞仪(购于Beckman)测得荧光信号，使用Excel软件中的student t-test进行统计分析。

请参阅图3。将空白组的荧光信号表现量视为1(即100％)时，控制组相对于空白组的荧光信号表现量为1.05(即105％)，实验组相对于空白组的荧光信号表现量为1.13(即113％)，荧光信号即为被嗜中性球吞噬的荧光黄颗粒所产生的荧光，荧光信号越强嗜中性球吞噬的荧光黄颗粒越多，吞噬作用越强；因此，代表细胞经TCI007样品处理后，嗜中性球的吞噬作用升高，为空白组的1.13倍。

实施例3：肠膜明串珠菌TCI007调节过敏的人体实验

(3-1)TCI007抑制人体组织胺能力实验

为进一步确认TCI007对于人体组织胺含量的影响。以每颗胶囊含有5X10⁹ cells(即5X10⁹ cells/cap)的TCI007的活菌胶囊提供给6位受试者(持续性过敏性鼻炎族群)，每人每日睡前服用一颗，并服用8周。并于服用TCI007胶囊前(视为第0周)及服用TCI007胶囊4周后(视为第4周)、服用TCI007胶囊8周后(视为第8周)进行受试者血液检测，检测项目包括受试者血液中的组织胺含量。其中，受试者血液中的体组织胺含量可将受试者血液以羟组织胺套组(厂牌：Elabscience，检测套组名称Hydroxyproline(Hyp)Colorimetric AssayKit)，检测方式是依照检测套组所附的使用说明书所进行，或是采外部医学检验所执行；较佳地，本实施例受试者血液中的体组织胺含量是委由立人检验所(中国台湾)执行。

请参阅图4，于服用TCI007胶囊前，6位受试者的平均血液中体组织胺含量为0.94ug/ml(图4标示第0周)，并于服用4周后，6位受试者的平均血液中体组织胺含量下降至0.41ug/ml(图4标示第4周)，于服用8周后，6位受试者的平均血液中组织胺含量下降至0.21ug/ml(图4标示第8周)。换言之，相较于第0周，于服用TCI007胶囊4周后，6位受试者的平均血液中体组织胺含量下降了0.53ug/ml，等于下降了57％；相较于第0周，于服用TCI007胶囊8周后，6位受试者的平均血液中体组织胺含量下降了0.73ug/ml，等于下降了78％。

换言之，当受试者每日服用5X10⁹ cells(即5X10⁹ cells/cap)的TCI007的活菌，持续服用4周后，血液中的组织胺含量下降了57％；持续服用8周后，血液中的组织胺含量下降了78％。

因此，由此可知，TCI007能有效抑制组织胺含量，可抑制过敏情况。

(3-2)TCI007改善过敏症状的问券调查结果

首先对上述6位受试者于第0周(服用上述的肠膜明串珠菌TCI007的活菌胶囊前)、第4周(服用上述的肠膜明串珠菌TCI007的活菌胶囊后)以及第8周进行过敏状况问卷调查，问卷中对于肌肤状况进行调查，其调查及计分方式如下表8。其中，第一部分的各分数代表各种症状的严重程度，0分为无困扰，1分为轻微，2分为中等，3分为稍严重，4分为严重，5分为非常严重。

表8

第一部分：症状/分数	0	1	2	3	4	5
							1.严重流鼻水或鼻塞
2.过敏情况严重
							3.经常打喷嚏

其中，过敏情况严重是指，受试者对于其自身整体过敏状况(例如皮肤搔痒等过敏性湿疹情况，或皱鼻、揉鼻等过敏性鼻炎)的程度评估。

项目1.问卷结果如下表9所示

表9

其中，平均分数是经由所有受试者填写的严重程度所对应的分数经过平均后求得，平均分数降低代表该项目的情况减轻。

综合以上，由表9可看出，服用上述的肠膜明串珠菌TCI007的活菌胶囊4周及8周后，受试者对于项目1.严重流鼻水或鼻塞、项目2.过敏情况严重情况有改善，而项目3.经常打喷嚏则是影响不大(结果未示)。

实施例4：肠膜明串珠菌TCI007调节菌相的人体实验

为进一步确认肠膜明串珠菌TCI007对于人体肠道菌相的影响。在上述受试者服用TCI007胶囊前(视为第0周)及服用TCI007胶囊4周后(视为第4周)、服用TCI007胶囊8周后(视为第8周)进行受试者肠道菌相检测，检测方式可以是采集受试者粪便检体后，对粪便进行DNA萃取，并进行16S核糖体基因(16S ribosomal gene)的定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，透过以知菌的引子序列来检测常见肠内菌的菌数比例；检测方式也可以将粪便进行DNA萃取后以次世代定序(Next Generation Sequencing(NGS))的方式，对检体进行微生物体16S扩增子定序(16SAmplicon Sequencing)，其中特别是针对16S DNA其中的V3-V4区域进行放大，并进行后续的定序分析。本实施例是以次世代定序方式进行，由图尔思生物科技股份有限公司进行微生物体16S扩增子定序(16S Amplicon Sequencing)，利用双端定序(Paired-End)，透过Reads拼接过滤以及OTU(Operational Taxonomic Units)聚类，以进行物种注释及丰度分析，揭示样品物种构成，分析检体内的微生物比例。

参照图5，相比服用前(第0周)，持续4周服用TCI007胶囊后可使双歧杆菌(Bifidobacterium)增加约155％，持续8周服用TCI007胶囊后可使双歧杆菌增加约117％。

参照图6，相比服用前(第0周)，持续8周服用TCI007胶囊后可使嗜血杆菌(Haemophilus)减少约52％。

经文献证实，双歧杆菌为肠道中常见的益生菌，具有调理免疫及抗过敏功效。嗜血杆菌属于正常成年人肠道菌相，极少引发疾病，经文献证实，当过敏发生时，嗜血杆菌会刺激嗜碱性球产生更多组织胺，使过敏反应更加严重。可参见例如：Various effects ofdifferent probiotic strains in allergic disorders:an update from laboratoryand clinical data,2010British Society for Immunology,Clinical andExperimental Immunology,160:295–304、Endotoxin from Haemophilus influenzaeenhances IgE-mediated and non-immunological histamine release,Allergy.1990Jan；45(1):10-7，该文献之全文并于此处以供参考。

透过受试者粪便检体的定序检测，分析TCI007对于人体菌相调节的能力，由以上结果可知，于服用TCI007胶囊后，受试者肠胃道内的双歧杆菌明显增加，代表TCI007具有调理免疫及抗过敏功效；于服用TCI007胶囊后，受试者肠胃道内的嗜血杆菌明显减少，代表TCI007具有减少组织胺，降低过敏反应的功效。

综上，透过实施例(2-1)可知，在细胞模式中，肠膜明串珠菌TCI007可降低组织胺含量。透过实施例(2-2)可知，肠膜明串珠菌TCI007有调节免疫相关基因的能力，特别是IL-8基因。透过实施例(2-3)可知，肠膜明串珠菌TCI007能提升嗜中性球吞噬作用，代表TCI007能提升嗜中性球活性。透过实施例(3-1)可知，在人体实验中，服用肠膜明串珠菌TCI007的菌体后，能降低人体组织胺的含量。透过实施例(3-3)可知，服用肠膜明串珠菌TCI007的菌体后，能改善人体流鼻水、鼻塞等过敏情况。透过实施例4可知，服用肠膜明串珠菌TCI007的菌体后，能调节人体肠胃道中的菌相，特别是增加双歧杆菌、减少嗜血杆菌，因此有减少组织胺，降低过敏反应的功效。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【序列表】

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 肠膜明串珠菌TCI007或其代谢产物用于改善过敏状况的用途

<130> 2109-TCI-TW

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1163

<212> DNA

<213> Leuconostoc mesenteroides

<400> 1

ggcaggggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgcac agcgaaaggt gcttgcacct 60

ttcaagtgag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtggacaac ctgcctcaag gctggggata 120

acatttggaa acagatgcta ataccgaata aaacttagtg tcgcatgaca aaaagttaaa 180

aggcgcttcg gcgtcaccta gagatggatc cgcggtgcat tagttagttg gtggggtaaa 240

ggcctaccaa gacaatgatg catagccgag ttgagagact gatcggccac attgggactg 300

agacacggcc caaactccta cgggaggctg cagtagggaa tcttccacaa tgggcgaaag 360

cctgatggag caacgccgcg tgtgtgatga aggctttcgg gtcgtaaagc actgttgtat 420

gggaagaaca gctagaatag gaaatgattt tagtttgacg gtaccatacc agaaagggac 480

ggctaaatac gtgccagcag ccgcggtaat acgtatgtcc cgagcgttat ccggatttat 540

tgggcgtaaa gcgagcgcag acggtttatt aagtctgatg tgaaagcccg gagctcaact 600

ccggaatggc attggaaact ggttaacttg agtgcagtag aggtaagtgg aactccatgt 660

gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggac 720

tgcaactgac gttgaggctc gaaagtgtgg gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacaccgta aacgatgaac actacgtgtt aggaggttcc gcctcttagt gccgaagcta 840

acgcattaag tgttccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 900

ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

cagtctgaca tcctttgagc ttttagagat agaagtgtct cttcggagac aagtgacagt 1020

gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt agtcccgcac gagcgcaccc 1080

ttatgtagtg cagcatccga tggcactcta gcgagactgc ggtgacaacg aagagcggac 1140

gacgtcagaa tcatcatgcc cat 1163

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-8-F

<400> 2

ttttgccaag gagtgctaaa ga 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-8-R

<400> 3

aaccctctgc acccagtttt c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH-F

<400> 4

ctgggctaca ctgagcacc 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH-R

<400> 5

aagtggtcgt tgagggcaat g 21

Claims

1.一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备改善过敏状况的组合物的用途，其中肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存于财团法人食品工业发展研究所，且寄存编号为BCRC910981。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，肠膜明串珠菌TCI007菌株包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，肠膜明串珠菌TCI007菌株具有生成多醣的能力。

4.如权利要求1所述的用途，其中该肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物用以降低组织胺含量。

5.如权利要求1所述的用途，其中该肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物用以改善肠道菌相。

6.如权利要求4或5所述的用途，其中该肠膜明串珠菌TCI007的有效剂量为5X10⁹cells。

7.如权利要求5所述的用途，其中该改善肠道菌相为增加双歧杆菌(Bifidobacterium)。

8.如权利要求5所述的用途，其中该改善肠道菌相为减少嗜血杆菌(Haemophilus)。

9.一种肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物在制备免疫调节的组合物的用途，其中肠膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存于财团法人食品工业发展研究所，且寄存编号为BCRC 910981。

10.如权利要求9所述的用途，其中该肠膜明串珠菌TCI007及/或其代谢产物具有提升嗜中性球吞噬作用(phagocytosis)的功能。