CN112592849A - 利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用兽疫链球菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法,本发明培养基组成中剔除了葡萄糖、蛋白胨等物质,并引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和酵母蛋白粉等物质,从而有效提高透明质酸发酵单位和分子量,降低发酵成本,并使得后续的提取纯化工艺更为简单。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,特别是涉及一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基和培养方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid)是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖,商品透明质酸一般为其钠盐,即透明质酸钠(SodiumHyaluronate),简称HA。习惯上仍称为透明质酸。透明质酸具有特殊的保水作用,份量更高达其本身重量的100倍,是目前发现的自然界中保湿性最好的物质,被称为理想的天然保湿因子。它可以改善皮肤营养代谢,使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老,在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用,可以起到促进营养吸收的更理想效果。
目前,国内透明质酸的发酵生产通常采用以兽疫链球菌为生产菌种的三级发酵模式,该方式存在的问题是:
1.国产医用透明质酸分子量低,大部分医用透明质酸仍需要进口。根据透明质酸理化性质,其分子量越高,吸收效果越好,特别是在医用方面,透明质酸分子量达到4000kDa以上,其治疗效果更好。但是,目前国产医用透明质酸分子量仅在2000-3000kDa,而且仅仅是少数企业生产的透明质酸分子量达到了2000kDa以上。
2.国内透明质酸的发酵技术水平相对较低,通常在11g/L以下。
3.国内透明质酸发酵生产成本较高,主要原因是培养基中加入了牛肉浸膏或蛋白胨及其它动物性蛋白,且用量较大,导致培养基成本较高。同国外生产企业比较,国际市场竞争力较弱。
4.国内透明质酸发酵技术中,通常以葡萄糖作为培养基的速效碳源,由于葡萄糖在灭菌过程中易产生“美拉德反应”,即产生抑制菌体的有毒物质,从而影响发酵效价。
5.国内透明质酸发酵技术中,有些在培养基组成中加入了动物蛋白胨,发酵培养结束,发酵液中残留了部分动物蛋白,增加了发酵液的粘度,对其提取和纯化有一定的影响。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种可提高透明质酸分子量,有效提高发酵单位,同时降低生产成本,降低提取纯化难度的利用兽疫链霉菌发酵生产透明质酸的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产透明质酸的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其中
所述一级种子培养基组成为:果葡糖浆25~30g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L;
所述二级种子培养基的组成为:果葡糖浆35~40g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基的组成为:果葡糖浆55~60g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,啤酒酵母蛋白粉26~30g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L,磷酸二氢钾0.1~0.5g/L,氯化钠0.002~0.006g/L,硫酸镁0.03~0.07g/L,硫酸亚铁0.1~0.5g/L,氯化锰0.003~0.007g/L,司盘80 0.1~0.5g/L,聚醚改性硅油0.2~0.4ml/L。
一种利用上述培养基发酵生产透明质酸的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:
1)一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养,OD≥2.0移种;
2)二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,OD≥2.0移种;
3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至透明质酸含量>12g/L、透明质酸分子量>4500KDa时终止发酵。
所述培养好的透明质酸摇瓶发酵液质量要求为菌体浓度20-30%;镜检无杂菌。
所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温35~36℃;空气流量20~40m3/h,搅拌转速60~80r/min;
所述二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温35~36℃;空气流量40~60m3/h;搅拌转速60~80r/min;
所述发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:35~36℃;
c 搅拌转速:转速控制在80-100r/min;
d 压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:150~200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补尿苷二磷酸葡萄糖、补水和补果葡糖浆,其中
a 补尿苷二磷酸葡萄糖工艺控制:
发酵21h时,补入腺苷二磷酸葡萄糖,控制其在发酵液中的浓度为0.1-0.3g/L;
b 补水工艺控制:
发酵9~21h时,当OD≥2.5,加入灭菌水,发酵过程中控制OD在2~2.5,每隔3h检测发酵液OD;
发酵21h~发酵结束,加入灭菌水,控制发酵液体积为发酵罐的75-80%;
c 补入果葡糖浆:
发酵9-21h时,当发酵液总糖含量<5mg/100ml时,补入已灭菌的果葡糖浆溶液,使总糖的含量控制在10~15mg/100ml。
本发明的技术优势体现在:
1 本发明确认了利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。
众所周知,由于碳源和氮源在生物生长过程中有着十分重要的影响,在分析营养源对兽疫链霉菌生长的影响时,企业技术人员在碳氮比以及碳源和氮源浓度对发酵过程的影响方面作了大量的研究。发现,碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累,过低导致菌体提早自溶;过高导致细菌代谢不平衡,最终不利于产物的积累。即使碳氮比处在合适水平,碳源和氮源浓度过高和过低也不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累,浓度过高,细胞在发酵过程后期生长缓慢,代谢废物产生较多,最终使得菌体代谢异常,影响外源蛋白合成;浓度过低,培养基所能提供的营养物质有限,影响细胞的繁殖。
本发明通过开展一些列研究,最终确认了利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例,以此为基础,其大生产的发酵技术水平是HA含量>12g/L、HA分子量>4500KDa,处于国内领先水平。
2 本发明培养基中引入了脱脂蚕蛹粉、鱼熔浆蛋白粉和酵母蛋白粉,三种原料含有完整的氨基酸群。脱脂蚕蛹粉蛋白质含量高,氨基酸组成较好,蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸含量高,富含亮氨酸、异亮氨酸和B族维生素;鱼溶浆蛋白粉参与透明质酸生化合成过程中形成的大量游离氨基酸,如谷氨酸、脯氨酸,鱼溶浆蛋白粉中大量的未知生长因子,还有些寡肽和多肽在蛋白质代谢中发挥着重要作用;啤酒酵母蛋白粉中含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、矿物质等多种营养成分。
依据透明质酸生化合成原理,培养基配方中引入了三种关键有机氮源,它们能提供HA生物合成过程中所需的关键物质和营养物质,保证了HA发酵的技术效果。
3 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述,确认了HA最佳的发酵工艺和控制参数。通过采用本工艺发酵生产HA,发酵单位达到12g/L以上;透明质酸分子量达到4500KDa以上,发酵技术水平处于国内领先水平。
3 培养基中使用果葡糖浆代替葡萄糖,避免出现“美拉德反应”。
4 同国内常规工艺水平比较,本发明HA发酵生产水平提高了10%左右,降低了生产成本,提高了产品市场竞争力。
5 本发明培养基配方中使用的关键有机氮源物料中脂肪含量较低,其中脱脂蚕蛹粉脂肪含量小于3.5%;鱼熔浆蛋白粉脂肪含量小于10%、啤酒酵母蛋白粉脂肪含量小于5%,并且菌种培养过程中,关键物料蛋白利用率较高,发酵培养结束,氨基氮含量较低,有利于该产品的提取和纯化。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用兽疫链霉菌,生产使用的菌种来源为摇瓶发酵液。摇瓶发酵液质量要求为:pH6~7;菌体浓度25~30%;镜检无杂菌。
实施例1
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:果葡糖浆25kg,脱脂蚕蛹粉36kg,鱼熔浆蛋白粉28kg、玉米浆干粉46kg,硫酸铵0.5kg,轻质碳酸钙1kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照40L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温36℃;空气流量20m3/h,搅拌转速60r/min;OD为2.0移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:果葡糖浆350kg,脱脂蚕蛹粉360kg,鱼熔浆蛋白粉280kg,玉米浆干粉490kg,硫酸铵5kg,轻质碳酸钙10kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温36℃;空气流量40m3/h;搅拌转速60r/min; OD为2.0移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆5500kg,脱脂蚕蛹粉3900kg,鱼熔浆蛋白粉2800kg,玉米浆干粉4600kg,啤酒酵母蛋白粉2600kg,硫酸铵50kg,轻质碳酸钙100kg,磷酸二氢钾10kg,氯化钠0.2kg,硫酸镁5kg,硫酸亚铁40kg,氯化锰0.5kg,司盘80 10kg,聚醚改性硅油20L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在80r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:150m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.3g/L,透明质酸分子量4580KDa。
实施例2
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:果葡糖浆30kg,脱脂蚕蛹粉36kg,鱼熔浆蛋白粉26kg,玉米浆干粉47kg,硫酸铵0.7kg,轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照41L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温35℃;空气流量30m3/h,搅拌转速70r/min;OD为2.3移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆400kg,脱脂蚕蛹粉360kg,鱼熔浆蛋白粉300kg,玉米浆干粉500kg,硫酸铵6kg,轻质碳酸钙40kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温35℃;空气流量50m3/h;搅拌转速70r/min;OD为2.1移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆6000kg,脱脂蚕蛹粉3700kg,鱼熔浆蛋白粉2600kg,玉米浆干粉5000kg,啤酒酵母蛋白粉2600kg,硫酸铵60kg,轻质碳酸钙150kg,磷酸二氢钾30kg,氯化钠0.4kg,硫酸镁3kg,硫酸亚铁50kg,氯化锰0.7kg,司盘80 50kg,聚醚改性硅油30L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:160m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.3g/L、透明质酸分子量4550KDa。
实施例3
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基:果葡糖浆26kg,脱脂蚕蛹粉40kg,鱼熔浆蛋白粉26kg,玉米浆干粉45kg,硫酸铵0.6kg,轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照43L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温35℃;空气流量25m3/h,搅拌转速65r/min;OD为2.1移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆360kg,脱脂蚕蛹粉350kg,鱼熔浆蛋白粉250kg,玉米浆干粉460kg,硫酸铵6kg,轻质碳酸钙20kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温35℃;空气流量45m3/h;搅拌转速65r/min;OD为2.1移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆5600kg,脱脂蚕蛹粉3500kg,鱼熔浆蛋白粉2600kg,玉米浆干粉4600kg,啤酒酵母蛋白粉2700kg,硫酸铵60kg,轻质碳酸钙200kg,磷酸二氢钾20kg,氯化钠0.3kg,硫酸镁4kg,硫酸亚铁20kg,氯化锰0.4kg,司盘80 20kg、聚醚改性硅油25L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:35℃;
c 搅拌转速:转速控制在85r/min;
d 压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:160m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.5g/L、透明质酸分子量4600KDa。
实施例4
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级培养基组成:果葡糖浆27kg,脱脂蚕蛹粉37kg,鱼熔浆蛋白粉25kg,玉米浆干粉48kg,硫酸铵0.9kg,轻质碳酸钙3kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照42L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温35℃;空气流量30m3/h,搅拌转速70r/min;OD为2.3移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:果葡糖浆370kg,脱脂蚕蛹粉370kg,鱼熔浆蛋白粉250kg,玉米浆干粉470kg,硫酸铵7kg,轻质碳酸钙30kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温35℃;空气流量50m3/h;搅拌转速70r/min;OD为2.3移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基:果葡糖浆5700kg,脱脂蚕蛹粉3800kg,鱼熔浆蛋白粉2500kg,玉米浆干粉4700kg,啤酒酵母蛋白粉2800kg,硫酸铵70kg,轻质碳酸钙300kg,磷酸二氢钾30kg,氯化钠0.4kg,硫酸镁3g,硫酸亚铁30kg,氯化锰0.5kg,司盘80 30kg,聚醚改性硅油30L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:35℃;
c 搅拌转速:转速控制在90r/min;
d 压力控制:罐压0.05MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:180m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量13.2g/L、透明质酸分子量4800KDa。
实施例5
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:果葡糖浆29kg,脱脂蚕蛹粉38kg,鱼熔浆蛋白粉30kg,玉米浆干粉49kg,硫酸铵0.8kg,轻质碳酸钙4kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照45L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温35℃;空气流量35m3/h,搅拌转速75r/min;OD为2.4移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆390kg,脱脂蚕蛹粉390kg,鱼熔浆蛋白粉300kg,玉米浆干粉450kg,硫酸铵8kg,轻质碳酸钙40kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温36℃;空气流量55m3/h;搅拌转速75r/min;OD为2.4移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆5900kg,脱脂蚕蛹粉4000kg,鱼熔浆蛋白粉2900kg,玉米浆干粉4900kg,啤酒酵母蛋白粉2900kg,硫酸铵80kg,轻质碳酸钙400kg,磷酸二氢钾40kg,氯化钠0.5kg,硫酸镁6kg,硫酸亚铁10kg,氯化锰0.6kg,司盘80 40kg,聚醚改性硅油35L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:35℃;
c 搅拌转速:转速控制在95r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:190m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量13.0g/L、透明质酸分子量4700KDa。
实施例6
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:果葡糖浆27kg,脱脂蚕蛹粉37kg,鱼熔浆蛋白粉28kg,玉米浆干粉50kg,硫酸铵0.5kg,轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照44L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温35.5℃;空气流量25m3/h,搅拌转速65r/min;OD为2.1移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆380kg,脱脂蚕蛹粉400kg,鱼熔浆蛋白粉290kg,玉米浆干粉500kg,硫酸铵5kg,轻质碳酸钙30kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温36℃;空气流量45m3/h;搅拌转速65r/min;OD为2.4移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆5800kg,脱脂蚕蛹粉4000kg,鱼熔浆蛋白粉3000kg,玉米浆干粉5000kg,啤酒酵母蛋白粉3000kg,硫酸铵70kg,轻质碳酸钙100kg,磷酸二氢钾20kg,氯化钠0.3kg,硫酸镁4kg,硫酸亚铁30kg,氯化锰0.7kg,司盘80 40kg,聚醚改性硅油25L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:170m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.2g/L、透明质酸分子量4530KDa。
实施例7
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级培养基组成:果葡糖浆30kg,脱脂蚕蛹粉40kg,鱼熔浆蛋白粉30kg,玉米浆干粉46kg,硫酸铵0.9kg,轻质碳酸钙5kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照43L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温35℃;空气流量40m3/h,搅拌转速80r/min;OD为2.5移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆400kg,脱脂蚕蛹粉400kg,鱼熔浆蛋白粉260kg,玉米浆干粉470kg,硫酸铵9kg,轻质碳酸钙50kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温35~36℃;空气流量60m3/h;搅拌转速80r/min; OD为2.5移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆6000kg,脱脂蚕蛹粉3700kg,鱼熔浆蛋白粉3000kg,玉米浆干粉4700kg,啤酒酵母蛋白粉2700kg,硫酸铵80kg,轻质碳酸钙500kg,磷酸二氢钾50kg,氯化钠0.6kg,硫酸镁7kg,硫酸亚铁50kg,氯化锰0.7kg,司盘80 50kg,聚醚改性硅油40L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.4g/L、透明质酸分子量4600KDa。
实施例8
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级培养基组成:果葡糖浆25kg,脱脂蚕蛹粉38kg,鱼熔浆蛋白粉28kg,玉米浆干粉50kg,硫酸铵0.7kg,轻质碳酸钙4kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照41L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.03MPa;罐温36℃;空气流量30m3/h,搅拌转速75r/min;OD为2.3移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:果葡糖浆350kg,脱脂蚕蛹粉400kg,鱼熔浆蛋白粉260kg,玉米浆干粉460kg,硫酸铵9kg,轻质碳酸钙40kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.04MPa;罐温35℃;空气流量55m3/h;搅拌转速75r/min;OD为2.2移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆5500kg,脱脂蚕蛹粉4000kg,鱼熔浆蛋白粉3000kg,玉米浆干粉5000kg,啤酒酵母蛋白粉2900kg,硫酸铵90kg,轻质碳酸钙500kg,磷酸二氢钾50kg,氯化钠0.6kg,硫酸镁7kg,硫酸亚铁50kg,氯化锰0.3kg,司盘80 40kg,聚醚改性硅油40L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:180m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.1g/L、透明质酸分子量4520KDa。
实施例9
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:果葡糖浆30kg,脱脂蚕蛹粉35kg,鱼熔浆蛋白粉25kg,玉米浆干粉46kg,硫酸铵0.5kg,轻质碳酸钙3kg。
一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液按照42L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养,一级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温36℃;空气流量40m3/h,搅拌转速75r/min;OD为2.2移种。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:果葡糖浆400kg,脱脂蚕蛹粉350kg,鱼熔浆蛋白粉290kg,玉米浆干粉450kg,硫酸铵5kg,轻质碳酸钙20kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,二级种子培养条件为:罐压0.05MPa;罐温36℃;空气流量50m3/h;搅拌转速70r/min;OD为2.3移种至发酵培养基。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:果葡糖浆6000kg,脱脂蚕蛹粉3500kg,鱼熔浆蛋白粉2500kg,玉米浆干粉4500kg,啤酒酵母蛋白粉2600kg,硫酸铵50kg,轻质碳酸钙200kg,磷酸二氢钾40kg,氯化钠0.5kg,硫酸镁6kg,硫酸亚铁40kg,氯化锰0.6kg,司盘80 35kg,聚醚改性硅油30L。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:36℃;
c 搅拌转速:转速控制在100r/min;
d 压力控制:罐压0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:190m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
发酵10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵结束,透明质酸含量12.6g/L、透明质酸分子量4590KDa。
上述实施例1-9的发酵过程中,根据检测情况,发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补尿苷二磷酸葡萄糖、补水、补果葡糖浆,其中
a 补尿苷二磷酸葡萄糖工艺控制:
在发酵21h时,补入腺苷二磷酸葡萄糖,控制其在发酵液中的浓度0.2g/L。
b补水工艺控制:
在发酵在9~21h,当OD≥2.5,加入灭菌水,控制发酵液OD在2~2.5,每隔3h检测发酵液OD。
在发酵21h~发酵结束,加入灭菌水,控制发酵液体积为发酵罐体积的80%。
c 补入果葡糖浆:
在发酵9-21h,当发酵液总糖含量<5mg/100ml时,补入已灭菌的果葡糖浆溶液,使总糖的含量控制在15mg/100ml。
对比实施例1
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成:葡萄糖30kg,牛肉浸膏34kg,酵母提取物24kg,玉米浆50kg,硫酸铵0.5kg,轻质碳酸钙2kg。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成:葡萄糖400kg,牛肉浸膏360kg,酵母提取物260kg,玉米浆470kg,硫酸铵6kg,轻质碳酸钙30kg。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:葡萄糖6000kg,牛肉浸膏3700kg,酵母提取物2600kg,玉米浆4600kg,蛋白胨2200kg,硫酸铵50kg,轻质碳酸钙200kg,磷酸二氢钾30kg,氯化钠0.4kg,硫酸镁3kg,硫酸亚铁50kg,氯化锰0.7kg,司盘80 50kg,聚醚改性硅油30L。
按照实施例1提供的工艺发酵生产,发酵结束,透明质酸含量9.1g/L、透明质酸分子量1850KDa。
对比实施例2
一级种子培养:一级种子培养基体积1m3。
一级培养基组成:糊精10kg,葡萄糖25kg,牛肉膏34kg,酵母粉30kg,玉米浆50kg,硫酸铵0.5kg,轻质碳酸钙2kg。
二级种子培养:二级种子培养基体积10m3。
二级培养基组成:糊精150kg,葡萄糖270kg,牛肉膏350kg,酵母粉270kg,玉米浆460kg,硫酸铵6kg,轻质碳酸钙30kg。
发酵培养:发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成:糊精160kg,葡萄糖280kg,牛肉膏3800kg,酵母粉2700kg,玉米浆4500kg,胆固醇1200kg,蛋白胨1100kg,硫酸铵40kg,轻质碳酸钙250kg,磷酸二氢钾40kg,氯化钠0.5kg,硫酸镁2kg,硫酸亚铁40kg,氯化锰0.6kg,司盘80 40kg,聚醚改性硅油40L。
按照实施例1提供的工艺发酵生产,发酵结束,透明质酸含量9.5g/L、透明质酸分子量1900KDa。
Claims (5)
1.一种利用兽疫链霉菌发酵生产高分子量透明质酸的培养基,其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基,其中
所述一级种子培养基组成为:果葡糖浆25~30g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L;
所述二级种子培养基的组成为:果葡糖浆35~40g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基的组成为:果葡糖浆55~60g/L,脱脂蚕蛹粉35~40g/L,鱼熔浆蛋白粉25~30g/L,玉米浆干粉45~50g/L,啤酒酵母蛋白粉26~30g/L,硫酸铵0.5~0.9g/L,轻质碳酸钙1~5g/L,磷酸二氢钾0.1~0.5g/L,氯化钠0.002~0.006g/L,硫酸镁0.03~0.07g/L,硫酸亚铁0.1~0.5g/L,氯化锰0.003~0.007g/L,司盘80 0.1~0.5g/L,聚醚改性硅油0.2~0.4ml/L。
2.按照权利要求1所述培养基发酵生产透明质酸的培养方法,其特征在于其工艺步骤为:
1)一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的透明质酸钠摇瓶发酵液接入一级种子培养基中进行种子培养,OD≥2.0移种;
2)二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养,OD≥2.0移种;
3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,至透明质酸含量>12g/L、透明质酸分子量>4500KDa时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述培养好的透明质酸摇瓶发酵液质量要求为菌体浓度20-30%;镜检无杂菌。
4.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于
所述一级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温35~36℃;空气流量20~40m3/h,搅拌转速60~80r/min;
所述二级种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温35~36℃;空气流量40~60m3/h;搅拌转速60~80r/min;
所述发酵培养条件为:
a 培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0-7.2;
b 温度:35~36℃;
c 搅拌转速:转速控制在80-100r/min;
d 压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6.9-7.2;
f 空气流量:150~200m3/h;
h 溶氧控制:
发酵前9h,不控制溶氧;
10h~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
5.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补尿苷二磷酸葡萄糖、补水和补果葡糖浆,其中
a 补尿苷二磷酸葡萄糖工艺控制:
发酵21h时,补入腺苷二磷酸葡萄糖,控制其在发酵液中的浓度为0.1-0.3g/L;
b 补水工艺控制:
发酵9~21h时,当OD≥2.5,加入灭菌水,发酵过程中控制OD在2~2.5,每隔3h检测发酵液OD;
发酵21h~发酵结束,加入灭菌水,控制发酵液体积为发酵罐的75-80%;
c 补入果葡糖浆:
发酵9-21h时,当发酵液总糖含量<5mg/100ml时,补入已灭菌的果葡糖浆溶液,使总糖的含量控制在10~15mg/100ml。
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