CN112574990A - 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用 - Google Patents

沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112574990A
CN112574990A CN202011463626.8A CN202011463626A CN112574990A CN 112574990 A CN112574990 A CN 112574990A CN 202011463626 A CN202011463626 A CN 202011463626A CN 112574990 A CN112574990 A CN 112574990A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dapk1
shrna
silencing
gene
shrna molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011463626.8A
Other languages
English (en)
Inventor
潘勤
章晓联
王亚平
孙月华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN202011463626.8A priority Critical patent/CN112574990A/zh
Publication of CN112574990A publication Critical patent/CN112574990A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase

Abstract

本发明提供了一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及应用，沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子，包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，构建了含有此shRNA分子的慢病毒载体，并证明此shRNA分子能敲低人DAPK1蛋白的表达，从而抑制细胞死亡，具有应用于急性慢性炎症和感染性疾病的免疫治疗前景。

Description

沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用，尤其涉及一种治疗急性慢性炎症和感染性疾病的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用。
背景技术
炎症是机体对于刺激的一种防御反应，主要表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是病原微生物侵入人体引起的感染性炎症，也可以是与病原微生物无关的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的防御反应；但有的时候，炎症也是有害的，造成对人体自身组织的攻击。目前，抗生素类药物广泛和长时间使用，使得临床耐药细菌出现愈加频繁，其相关治疗也变得更为严峻。如影响人类健康的主要杀手之一结核病，结核分枝杆菌往往不能被病人完全清除，导致细菌在结核病人体内长期存活造成慢性感染。
死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)是一种依赖钙离子调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是凋亡的正调节因子之一，广泛参与γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Fas和转化生长因子-β(TGF-β)等多种途径诱导的细胞凋亡(夏海发，尚游，姚尚龙.死亡相关蛋白激酶1的分子结构与炎症调节作用的研究进展[J].中华危重病急救医学.2015；27(2)：158-160.DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2015.02.018.)。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象，该现象能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-25nt及3’端突出的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC被已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而抑制相应基因表达。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定基因沉默，从而使得基因功能丧失或基因表达量降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。shRNA，即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，可通过RNA干扰来抑制基因的表达。shRNA可以在细胞内被加工成siRNA，通过与目标mRNA特异性地互补结合，从而实现靶mRNA降解。
慢病毒载体是逆转录病毒载体的一种，将shRNA构建在慢病毒载体上，一方面可以方便其扩增；另一方面，shRNA经过慢病毒包装***包装后，可用于感染传统转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞和处于非***状态的细胞，并且在感染后，shRNA可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。目前DAPK1与炎症与感染性疾病的机制以及治疗的潜在关系并不清楚，尚未见报道特异性沉默DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用，影响了对DAPK1功能的研究及其应用。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因，其特征在于，所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因的核苷酸序列是CCACGTCGATACCTTGAAATT。
一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子，其特征在于，所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子包括正义链和反义链；
所述正义链的核苷酸序列是：
5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'；
所述反义链的核苷酸序列是：
5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'。
如前所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备降低细胞DAPK1基因mRNA试剂中的应用。
如前所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备抑制细胞DAPK1蛋白表达试剂中的应用。
如前所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备用于治疗急性慢性炎症和感染性疾病药物的应用。所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子，能够特异性敲低DAPK1的表达，最终促进T细胞存活，提高成人抗病原微生物感染的免疫力。
如前所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因在制备用于治疗急性慢性炎症和感染性疾病药物的应用。
本发明的优点在于：
其一，通过特异性降低DAPK1靶基因的表达、促进T细胞的存活，在治疗急性慢性炎症和感染性疾病中发挥免疫治疗作用。其二，将shRNA构建在慢病毒载体上，通过shRNA-慢病毒感染T细胞来进行基因沉默，提高了基因沉默的效率。本发明获得的shRNA分子未见以往公开报道。以上shRNA分子能够干扰DAPK1基因的表达，降低急性慢性炎症和感染性疾病中T细胞的死亡，为治疗急性慢性炎症和感染性疾病提供新的方案。
附图说明
图1是EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切重组shRNA-DAPK1后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2是空载pLKO.1或者重组shRNA-DAPK1转染293T细胞后的RTqPCR检测其DAPK1的mRNA表达的结果。
图3是重组shRNA-DAPK1沉默T细胞系Jurkat细胞DAPK1表达的Western Blot检测结果。
图4是沉默后的活化T细胞系细胞死亡的检测柱状图；
图5是沉默后的活化T细胞系细胞死亡的检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明：
本发明所有方法中未注明具体条件的实验方法和所用试剂，如无特殊说明均购自promega公司，干扰序列由擎科生物科技有限公司合成。实施例中的实验方法来自https：// www.addgene.org/protocols/plko/，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：沉默人DAPK1基因表达的特异性干扰序列shRNA的获得
设计方案一：
根据网站：
www.sigmaaldrich.com/catalog/genes/DAPK1？lang＝zh&region＝CN#shRNA％ 20Products～human设计shRNA序列，获得的靶基因序列：CCACGTCGATACCTTGAAATT(SEQ IDNO：1)，具体如下：
正义链：
5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'(SEQID NO：2)
反义链：
5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'(SEQID NO：3)
设计方案二：NCBI-Nucleotide上查找DAPK1 mRNA序列，利用网站http：// rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do，设计shRNA2，获得的基因序列为GCGAGCTGTTTGACTTCTTAG，此为control shRNA具体如下：
正义链：
5'-CCGGCTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAGTCAAACAGCTCGCTTTTTG-3'(SEQ ID NO：4)
反义链：
5'-AATTCAAAAAGCGAGCTGTTTGACTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAG-3'(SEQ ID NO：5)
实施例2：DAPK1的shRNA-慢病毒载体的构建
慢病毒载体为pLKO.1，辅助载体为psPAX2和pMD2.G，均为优宝生物公司购入。
制备感受态细胞
转化：从-80℃冰箱取一支感受态，冰上放置5分钟，待感受态处于半溶状态时加入2μL pLKO.1空载质粒。冰上放置30分钟。42℃热刺激90秒，再次冰上放置5分钟。向感受态中加入700μL 37℃预热的LB培养基，上37℃摇床200rpm摇60分钟。离心5000rpm，5分钟。弃上清至剩100μL菌液用涂布棒均匀涂在含有氨苄抗生素(Amp)的固体LB培养基中。在37℃细菌培养箱培养16个小时。
挑取若干个单菌落，加入带5μL氨苄抗生素的5mL液体LB培养基的玻璃管内，在37℃，200rpm下进行小量细菌培养8个小时。之后转入含有200mL液体LB的锥形瓶(含有200μLAmp)中，在37℃，200rpm下进行细菌培养16个小时。
提取质粒采用Omega公司试剂盒根据其说明书进行大提质粒。
质粒pLKO.1浓度测定：642.6ng/L。
本发明将上述设计的干扰序列的shRNA分子常规退火后合成双链，得到退火片段，如下所示：
shRNA：
5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'
5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'
control shRNA：
5'-CCGGCTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAGTCAAACAGCTCGCTTTTTG-3'
5'-AATTCAAAAAGCGAGCTGTTTGACTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAG-3'
shRNA的退火。将浓度为100μM的shRNA，正义链和反义链两两混合，进行退火：
shRNA退火：
5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'(SEQID NO：2)
5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'(SEQID NO：3)
control shRNA退火：
5'-CCGGCTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAGTCAAACAGCTCGCTTTTTG-3'(SEQ ID NO：4)
5'-AATTCAAAAAGCGAGCTGTTTGACTTCTTAGCTCGAGCTAAGAAG-3'(SEQ ID NO：5)
退火体系(20μL)：
正义链 2μL
反义链 2μL
ddH2O 补足20μL
94℃退火5分钟，之后自然降温至室温。
慢病毒载体pLKO.1的酶切及核酸片段的回收。
酶切体系(50μL)：
AgeI单酶切
Figure BDA0002832348020000051
总50μL酶切体系置于水浴锅内，在37℃条件下酶切4个小时。
割胶回收。
电泳结束后切下包含目的片段的胶条，放入1.5mL无菌EP管。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg凝胶约为100μL来计算凝胶的体积，加入同等体积的Binding Buffer。置于65℃干浴锅内将凝胶彻底融化，期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，将上述液体全部转移到滤柱内，室温静置3分钟。10000rcf离心1分钟，弃掉滤液，向柱子内加入300μL的Binding buffer，13000rcf离心1分钟，弃掉滤液。加入700μL SPW Wash Buffer，13000rcf离心1分钟，弃滤液，重复一次。13000rcf吸附柱空离2分钟。开盖静置2分钟，去除无水乙醇。将滤柱转移至一个新的1.5mL的EP管，向柱子内加入15μL的去离子水，静置2分钟，13000rcf离心1分钟，离心管中的液体即为酶切回收的pLKO.1。浓度测定为120ng/μL。
EcoRI再次酶切割胶回收的目的片段，酶切体系(50μL)：
Figure BDA0002832348020000061
总50μL酶切体系置于水浴锅内，37℃酶切4个小时。割胶回收，操作同上。本次浓度测定为为69ng/μL。
shRNA与载体pLKO.1的连接
连接体系(6μL)如下：
高保真酶 2μL
shRNA 3μL
酶切过的载体 1μL
总6μL酶连体系置于水浴锅内，16℃条件下酶连2个小时。
转化。将感受态细胞置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入感受态细胞中于冰上放置30分钟，后于42℃水浴中90秒。然后迅速置于冰上放置5分钟。加入700μL不含抗生素的LB培养基于37℃，200rpm振荡培养60分钟。取出已转化的细胞，在5000rpm条件下离心5分钟，弃上清，EP管内留200μL左右即可。将管内剩余液体与下层质粒吹打混匀后，取100μL菌液加入到含有氨苄的固体LB培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内培养16个小时。
重组质粒的制备。挑取若干个单菌落，在37℃，200rpm下进行小量摇菌培养8个小时，提取质粒后，浓度测定为130ng/μL，进行双酶切鉴定。酶切体系(20μL)如下：
Figure BDA0002832348020000062
Figure BDA0002832348020000071
总20μL酶切体系置于水浴锅中在37℃，酶切2个小时。之后用1％的琼脂糖凝胶在120V条件下电泳40分钟，电泳结果见图1(图1中在前面转化培养后，挑取了若干个单菌落，设计的shRNA挑取了3个单菌落，分别命名为shRNA-DAPK1-1、shRNA-DAPK1-2、shRNA-DAPK1-3，对照control-shRNA也挑取了3个单菌落，分别命名为control-shRNA-DAPK1-1、control-shRNA-DAPK1-2、control-shRNA-DAPK1-3)。结果显示，重组shRNA-DAPK1为7084bp，EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切重组shRNA-DAPK1后，出现2个条带，分别为5111bp和1973bp。结果显示shRNA-DAPK1-1和control shRNA-DAPK1的3个单克隆条带正确。对酶切成功的shRNA-DAPK1和control-shRNA-DAPK1送由擎科生物科技有限公司测序，测序结果显示克隆测序正确，证明构建成功。
实施例3RTqPCR和Western Blot检测Jurkat细胞DAPK1蛋白的表达
慢病毒包装。提前一天将293T细胞接种10cm平板，细胞密度80％，转染前2小时移除原有培养基，换为新的完全培养基(10mL)。10μgDNA质粒用500μL无血清稀释液稀释，充分混匀(pLKO.1：PSPAX2：PMD2.G质量比为4：3：1，质粒浓度调整为300ng/μL，稀释液为opti-MEM)。向DNA稀释液中加10μLNeofect，轻柔混匀，室温静置15分钟。将上述混合液加入细胞培养基，混匀细胞，继续培养12小时。12小时后更换为含有1％双抗的培养基，以去除转染试剂，培养24小时。收上清即为包装好的病毒颗粒，并用含有0.45μm滤膜的离心管过滤，以去除上清中残余的细胞。加新鲜培养基，培养24小时，重复上一步。
shRNA感染。提前一天铺板Jurkat细胞，第二天细胞密度70％，更换新鲜培养基，并加8μg/mL polybrene，加慢病毒颗粒溶液2.5mL。24小时后更换新鲜培养基，加嘌呤霉素1μg/mL，传3代收细胞。
RTqPCR检测DAPK1蛋白的表达。细胞层加1mL Trizol，室温放融，加200μL氯仿，充分颠倒混匀，静止10分钟，4℃条件下12000g离心15分钟，取上清，移入新的EP管。按1：1体积比加入异丙醇，充分颠倒混匀，静止10分钟，4℃条件下12000g离心10分钟，弃上清。加1mL75％乙醇，将沉淀浮起，4℃条件下7500g离心10分钟，弃上清。加1mL无水乙醇，4℃条件下7500g离心10分钟。倒掉上清，空离2分钟，开盖静置5分钟，加65℃预热的DEPC水20μL(据沉淀量加10-30μL)混匀。测RNA浓度。65℃条件下变性5分钟，立即放于冰上冷却。
逆转录体系(10μL)如下：
Figure BDA0002832348020000081
在37℃条件下，进行15分钟逆转录反应→在98℃条件下，进行5分钟的酶失活反应。
Realtime PCR
1)体系(20μL)如下：
Figure BDA0002832348020000082
2)PCR的循环条件：95℃30秒，之后进行40个PCR循环，每个循环条件为：95℃条件下5秒→55℃温度条件下10秒→72℃温度条件下15秒。
RTqPCR结果显示构建的shRNA-DAPK1在经过慢病毒包装后感染的Jurkat细胞DAPK1表达水平明显降而低，而control shRNA-DAPK1在经过慢病毒包装后感染的Jurkat细胞DAPK1表达水平并未降低。结果见图2。图2中依次为空载pLKO.1组、shRNA-DAPK1组和对照组(control shRNA-DAPK1组)。结果提示与慢病毒空载pLKO.1组和control shRNA-DAPK1组相比，慢病毒shRNA-DAPK1组感染的Jurkat细胞，表达的DAPK1显著降低。
Western Blot技术检测Jurkat细胞DAPK1蛋白的表达：
Western Blot结果显示构建的shRNA-DAPK1在经过慢病毒包装后感染的Jurkat细胞DAPK1表达水平明显降而低，而control shRNA-DAPK1在经过慢病毒包装后感染的Jurkat细胞DAPK1表达水平并未降低。结果见图3。图3检测了DAPK 1总量和其非活性形式P-DAPK1的表达。图3中依次为Marker、空载pLKO.1组、control shRNA-DAPK1组和shRNA-DAPK1组，结果显示慢病毒shRNA-DAPK1组感染Jurkat细胞后，细胞表达的DAPK1总量显著降低而非活性P-DAPK1的表达增高，提示慢病毒shRNA-DAPK1能有效降低T细胞内活性形式DAPK1的表达。
流式细胞术检测沉默后的活化T细胞系细胞死亡的变化：
流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，慢病毒shRNA-DAPK1组感染Jurkat细胞后，死亡细胞数(FVS780+)显著减少，存活细胞数增多。结果见图4以及图5。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用
<141> 2020-12-11
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacgtcgat accttgaaat t 21
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggccacgt cgataccttg aaattctcga gaatttcaag gtatcgacgt ggtttttg 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattcaaaaa ccacgtcgat accttgaaat tctcgagaat ttcaaggtat cgacgtgg 58
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggcttctt agctcgagct aagaagtcaa acagctcgct ttttg 45
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattcaaaaa gcgagctgtt tgacttctta gctcgagcta agaag 45

Claims (6)

1.一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因，其特征在于，所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因的核苷酸序列是CCACGTCGATACCTTGAAATT。
2.一种沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子，其特征在于，所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子包括正义链和反义链；
所述正义链的核苷酸序列是：
5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGGTT TTTG-3'；
所述反义链的核苷酸序列是：
5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'。
3.如权利要求2所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备降低细胞DAPK1基因mRNA试剂中的应用。
4.如权利要求2所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备抑制细胞DAPK1蛋白表达试剂中的应用。
5.根据权利要求2所述的沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子在制备用于治疗急性慢性炎症和感染性疾病药物的应用。
6.根据权利要求1所述沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子的靶标基因在制备用于治疗急性慢性炎症和感染性疾病药物的应用。
CN202011463626.8A 2020-12-11 2020-12-11 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用 Pending CN112574990A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011463626.8A CN112574990A (zh) 2020-12-11 2020-12-11 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011463626.8A CN112574990A (zh) 2020-12-11 2020-12-11 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112574990A true CN112574990A (zh) 2021-03-30

Family

ID=75131923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011463626.8A Pending CN112574990A (zh) 2020-12-11 2020-12-11 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112574990A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100184037A1 (en) * 2007-03-02 2010-07-22 The Ohio State University Research Foundation Death associated protein kinase 1 (dapk1) and uses thereof for the treatment of chronic lympocytic leukemia
CN101914532A (zh) * 2002-11-22 2010-12-15 生物智囊团株式会社 Rna干扰的目标碱基序列的搜索方法
WO2017076864A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Netris Pharma Combination therapy of ntn1 neutralizing agent with drugs inhibiting epigenetic control

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914532A (zh) * 2002-11-22 2010-12-15 生物智囊团株式会社 Rna干扰的目标碱基序列的搜索方法
US20100184037A1 (en) * 2007-03-02 2010-07-22 The Ohio State University Research Foundation Death associated protein kinase 1 (dapk1) and uses thereof for the treatment of chronic lympocytic leukemia
WO2017076864A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Netris Pharma Combination therapy of ntn1 neutralizing agent with drugs inhibiting epigenetic control

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APARNA RAVAL等: "《Downregulation of Death-Associated Protein Kinase 1 (DAPK1) in Chronic Lymphocytic Leukemia》", 《CELL》 *
JIAN-YUN XIE等: "《The prognostic significance of DAPK1 in bladder cancer》", 《PLOS ONE》 *
ROY Z. GRANIT等: "《Regulation of Cellular Heterogeneity and Rates of Symmetric and Asymmetric Divisions in Triple-Negative Breast Cancer》", 《CELL REPORTS》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101307085B (zh) 抑制铁调素调节蛋白的siRNA、重组慢病毒及其应用
EP2352744B1 (en) Short hairpin rnas for inhibition of gene expression
CA2534991A1 (en) Short interfering rna as an antiviral agent for hepatitis c
JP2023509179A (ja) Ｌｅａｐｅｒ技術に基づくｍｐｓ ｉｈの治療方法及び組成物
CN107523569B (zh) Pdcd1基因的用途及其相关药物
CN112574990A (zh) 沉默人DAPK1基因表达的shRNA分子及其应用
RU2385939C1 (ru) Генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN109136377B (zh) 成人t细胞白血病的治疗药物及诊断试剂盒
CN114958851A (zh) 一种降低乳腺癌转移的抑制剂
CN110938691B (zh) 人dus4l基因的用途及相关产品
CN109266684B (zh) 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法
CN103667430B (zh) 一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物
CN102260672A (zh) 抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA
CN110964727A (zh) 特异抑制c-myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用
CN111803633A (zh) 人psmd7基因的用途及相关产品
CN116716302B (zh) 一种用于降低食管癌细胞中nek2基因表达的核酸分子
CN111549028A (zh) 一种shRNA及其应用
CN111235150A (zh) 用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途
WO2006090906A1 (ja) RNAi耐性ウイルス株を克服する新手法
CN102965371A (zh) 一种抑制BMP15基因表达的siRNA 及其应用
CN114958855B (zh) 一种促内皮细胞凋亡的siRNA及SIRT6低表达细胞系
CN116803424B (zh) Slc17a5基因抑制剂及其用途
WO2019023344A1 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF METASTATIC TUMORS
CN116622652A (zh) 用于神经母瘤基因治疗的慢病毒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210330