CN101307085B - 抑制铁调素调节蛋白的siRNA、重组慢病毒及其应用 - Google Patents

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葛啸虎
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Abstract

本发明公开了一种抑制铁调素调节蛋白(HJV)表达的小干扰性RNA，所述小干扰性RNA与铁调素调节蛋白基因mRNA反向互补，其长度为19-27bp。本发明进一步公开了编码所述小干扰性RNA的相应shRNA的DNA以及能表达所述shRNA的重组慢病毒。本发明的小干扰性RNA、编码shRNA的DNA以及重组慢病毒能够有效抑制体内铁调素调节蛋白表达、上调体内铁调素的水平并降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。

Description

抑制铁调素调节蛋白的siRNA、重组慢病毒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学、生物医药及基因工程技术领域，具体涉及利用慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术，构建针对铁调素调节蛋白(HJV)基因的慢病毒干扰体系(PLT-HJVi)，并将其运用到铁代谢相关疾病的药物开发制备当中。
背景技术
RNAi指的是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。
RNA干扰过程主要有2个步骤：(1)长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA(small interfering RNA，siRNA)。(2)小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。
1998年，安德鲁·法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正链或反链RNA显示出了更强的抑制效果(Fire et al.，1998)。从与靶mRNA的摩尔比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。随后，又相继发现具有RNase III活性的Dicer可将长的双链RNA加工成称之为siRNA(small interfering RNA)的21～23nt及3′端突出的短的双链RNA，siRNA与若干个蛋白组成称之为RISC复合物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白复合物，并由该复合物主导RNAi效应。2001年，Tuschl等将短的siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于生物种中，因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性
双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS(post transcriptional gene silencing)，如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
由外界导入的长的双链RNA首先被称作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21～23碱基对的小的双链RNA，这种RNA被称作smallinterfering RNA(siRNA)，其特征是3′端相对于互补链突出两个碱基。完成上述过程后，siRNA上结合RNAi蛋白因子，并形成称为RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白复合物。在RISC复合物中，siRNA依赖于ATP/或ATP非依赖性的转换为单链，进而RISC被活化。活化型RISC受已成单链的siRNA引导(guide strand)，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇(Drosophila melanogaster)RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(slicer activity)，RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。
RNAi在基因沉默方面的具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于靶标基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势。因此，RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。
在药物靶标发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。一旦所发现的基
因属于可用药的靶标(如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外)，就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外，被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。
在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化。
然而要将RNA干扰技术运用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。
shRNA即短发夹RNA(short hairpin RNA)。在RNAi感染过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，从而降解目的基因抑制其表达。
铁调素(hepcidin)是一个近年新发现的小分子多肽，主要由肝脏合成。它是肝脏、小肠和网状内皮***之间铁代谢调节信号的传递者，是机体铁平衡的中心调节者。当任何原因引起循环铁增加时，肝细胞增加合成和分泌铁调素进入血液，铁调素经血流运输到铁的吸收部位十二指肠及铁储存的主要部位巨噬细胞，与细胞膜上的膜铁转运蛋白1(Ferroportin1)结合，并降解膜铁转运蛋白1，从而抑制铁从肠腔进入血液，同时减少巨噬细胞分泌铁进入血液，使血液铁水平降低。当循环铁较低时，肝脏合成与分泌的铁调素减少。肠吸收上皮相关蛋白降解减少，肠铁吸收量增加，使铁水平回复到正常。
我们最近的研究发现并在国际上首先报导了脑有能力表达铁调素。我们的实验也己初步显示脑室内注射铁调素可降低脑内铁水平，说明铁调素能调节脑铁代谢，参与脑铁平衡的维持。早在1991年，我们已经发现脑铁的失调以及铁诱导的氧化应激，是促进神经退行性变的重要诱因。实验数据显示，脑铁的失调至少是某些神经退行性疾病(例如：帕金森氏病PD以及老年性痴呆AD)的起病的始发原因之一。
铁调素调节蛋白(Hemojuvelin，HJV)是最近发现的一种重要的铁代谢调节蛋白。2004年，Papanikolaou等首次在1号染色体短臂分离鉴定出这一新的基因。两年多来的研究显示，Hemojuvelin是一种极为重要的调节铁调素(hepcidin)表达的蛋白，通过参与调节和控制铁调素的表达从而在铁代谢中发挥重要作用。综合其他研究结果与我们自己的研究显示，HJV的表达与铁调素(hepcidin)的表达水平呈负相关关系，通过抑制铁调素调节蛋白的表达，能够上调体内铁调素的水平，降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种能够有效抑制体内铁调素调节蛋白表达、从而调节体内铁水平的小干扰性RNA(siRNA)。
本发明的另一目的在于提供编码含有上述小干扰性RNA的shRNA(短发夹RNA)的DNA。
本发明的再一目的在于提供具有优良的靶向性、安全性以及持续表达上述shRNA、进而抑制铁调素调节蛋白(HJV)表达的重组慢病毒。
本发明的再一目的在于提供上述DNA以及重组慢病毒在制备药物方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种抑制铁调素调节蛋白(HJV)表达的小干扰性RNA(siRNA)，所述小干扰性RNA与铁调素调节蛋白基因mRNA反向互补，其长度为19-27bp。
优选的，所述小干扰性RNA含有以下序列：
Seq ID No.1：5’-CAAUCUUCCUGCAGCCUUUGA-3’
Seq ID No.2：3’-GUUAGAAGGACGUCGGAAACU-5’
本发明进一步公开了一种编码含有上述小干扰性RNA的正义链及反义链的shRNA的DNA。
优选的，所述DNA还含有启动子及PolyA终止信息序列，启动子优选为U6启动子。
优选的，所述DNA含有序列表中Seq ID No.3和/或Seq ID No.4所示的序列。
在本发明优选的实施方式中，所述DNA为双链DNA，模板链为序列表中Seq ID No.3所示的序列，编码链为序列表中Seq ID No.4所示的序列。
本发明还公开了一种抑制铁调素调节蛋白(HJV)表达的重组慢病毒，所述重组慢病毒含有上述DNA以及慢病毒载体。
优选的，所述慢病毒载体为自身失活慢病毒载体(SIN)。
本发明进一步公开了上述小干扰性RNA、上述DNA以及上述重组慢病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。
所述铁代谢紊乱疾病如老年性痴呆、帕金森综合症、神经退行性疾病等。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备了以下有益效果：
本发明的小干扰性RNA、编码shRNA的DNA以及重组慢病毒能够有效抑制体内铁调素调节蛋白表达、上调体内铁调素的水平并降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。
特别地，本发明的重组慢病毒通过选择第三代慢病毒载体----自身灭活慢病毒载体(SIN)，大大的提高了载体的安全性以及靶向性。慢病毒载体可以选择性***染色体中，不会出现***失活的情况。慢病毒携带shRNA进入靶细胞，可以整合入细胞的基因组，持续长期的表达相关shRNA，而不会引起对细胞的毒害作用。本发明的慢病毒干扰体系具有优良的靶向性、安全性以及表达持续性，能够有效的提升铁调素(hepcidin)表达量，降低血清铁的浓度，并且对正常细胞无任何毒副作用。本发明的重组慢病毒将U6启动子***到自身灭活慢病毒***中，利用人源性的U6启动子启动***片段的转录，具有高效、准确等优点。通过多次实验，均证明本发明的慢病毒干扰体系能有效的调节铁调素的表达。
本发明设计的shRNA经过体内以及体外实验证明，能有效的抑制HJV表达95％以上，并能相应的升高铁调素的水平，有效的调节血清铁的水平。
附图说明
图1是PLT慢病毒载体的多克隆位点图；
图2是本发明干扰片段连接上人源U6启动子示意图；
图3是PLT-HJVi***构建流程图；
图4是PLT-HJVi***感染体细胞后，HJV蛋白的表达情况图；
图5是PLT-HJVi***感染体细胞后，继发引起铁调素蛋白(Hepcidin)表达上调图；
图6是通过高铁饲料饲养SD大鼠，构建高血清铁动物模型，然后利用PLT-HJVi***进行体内实验，降低血清铁水平结果图。
具体实施方式
本发明利用铁代谢相关疾病的发病机理，有针对性的调节HJV的表达，设计特定的小干扰性RNA以及编码shRNA的DNA，从而降低血清铁对于细胞的损害。本发明的小干扰性RNA以及DNA所编码的shRNA，能特异性的识别序列：CAATCTTCCTGCAGCCTTTGA，该序列位于HJV(AK098165)第953-973碱基处。
本发明的编码shRNA的DNA为双链DNA，其模板链为序列表中SeqID No.3所示的序列，编码链为序列表中Seq ID No.4所示的序列。其通过慢病毒载体介导后，在体内能够有效持续表达shRNA，该shRNA能特异性的识别序列：CAATCTTCCTGCAGCCTTTGA，该序列位于HJV(AK098165)第953-973碱基处。在本发明的序列Seq ID No.3及Seq IDNo.4中，已设计包含了polyA尾信号。
要将RNA干扰技术运用于临床治疗，就需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。我们利用失活慢病毒载体携带RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA，完美的解决了RNA干扰基因治疗的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。
本发明通过合成干扰片段，并将U6启动子定向连接在干扰片段5’端，测序后证实其序列的正确性，再将U6+shRNA的DNA模板连接至慢病毒载体当中。转染重组体入293T细胞，获取病毒上清，体外以及体内实验证明能够有效抑制HJV。
在本发明优选的实施方式中，构建了铁调素调节蛋白(HJV)的慢病毒干扰体系(PLT-HJVi)，并取得了良好的抑制效果。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
根据铁调素调节蛋白(HJV)序列(AK098165)，并根据人源性U6序列加上20bpU6序列接头以及PolyA终止信息序列。3’端加上XhoI酶切位点，送Invitrogen公司合成序列。经过筛选，获得干扰效果最为显著的本发明的HJV干扰片断序列如下：
模板链(Seq ID No.3)：
5’-GTGGAAAGGACGAAACACCGTCAAAGGCTGCAGGAAGATTGTTGATATCCGCAATCTTCCTGCAGCCTTTGACTTTTTCTCGAGCTGGA-3’
编码链(Seq ID No.4)：
5’-TCCAGCTCGAGAAAAAGTCAAAGGCTGCAGGAAGATTGTTGATATCCGCAATCTTCCTGCAGCCTTTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’
实施例2
PLT-HJVi***构建
构建重组PLT-HJVi质粒如附图2，3所示。构建过程共分为三大步骤：
一、获取人U6启动子；
a)室温下加入1mlSNET溶液裂解1X1010个人源性细胞株HEK293；
b)从研钵中吸取细胞裂解液至一个2ml的EP管中，加入40ul蛋白酶K以及2ulRNA酶；
c)密封EP管，水平放置离心管于55度水浴锅中，缓慢振荡消化至少3小时；
d)取出EP管，加入1ml苯酚—氯仿混合液，轻柔颠倒3次。至摇床上缓慢振荡30min。(<60rpm)；
e)室***式离心机最高速(13000rpm)离心5min；
f)小心分离水相至新EP管，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀；
g)4℃，离心(14000rpm—20000g)15min；
h)轻柔去除异丙醇；
i)加入1ml75％乙醇(不需吹打重悬，浸泡即可)；
j)室温离心10000rpm，3min；
k)小心清除乙醇，吸尽残余液滴；
1)通风橱晾干10min；
m)50ul，预热至60℃的ddH2O溶解，置60℃，30min；
n)4℃保存。
o)取上述基因组DNA1ul作为模板，利用U6启动子引物PCR扩增出U6启动子，纯化后保存与-20℃。
二、将合成的HJV干扰片段(Seq ID No.3及Seq ID No.4)利用多次PCR的方式进行退火，PAGE胶纯化退火产物。再利用纯化产物与预先获得的人U6启动子进行PCR反应，获得U6+HJVi片断，胶纯化产物，具体步骤如下：
1.建立1stPCR***
5ul      10xbuffer
6ul      2.5mM dNTP
1ul      50mM MgSO4
0.05nM   模板链Seq ID No.3
0.05nM   编码链Seq ID No.4
0.5ul    高保真聚合酶
用三蒸水补足至50ul，置冰上5分钟后，放入PCR仪，扩增35个循环。
2.制12％1x TAE聚丙烯酰胺胶，取10ul上述PCR产物跑胶200V1h。EB染色后切下80bp左右的条带，置50ul三蒸水中煮沸5分钟。
3.建立2nd PCR***
5ul       10xbuffer
6ul       2.5mM dNTP
1ul       50mM MgSO4
0.05nM    U6启动子上游引物
0.05nM    编码链Seq ID No.4
0.5ul     高保真聚合酶
2ul       纯化的U6启动子
1ul       1stPCR扩增产物
用三蒸水补足至50ul，置冰上5分钟后，放入PCR仪，扩增35个循环。
4.取5ul2nd PCR产物跑琼脂糖电泳，切下420bp的条带，利用试剂盒(invitrogen)纯化产物。
三、酶切(XbaI与XhoI)上述第二步中的纯化产物以及PLT慢病毒载体(PLT载体***为SIN病毒类型的一种)，胶纯化回收后，用T4连接酶与室温连接24小时，经转化筛选之后，获得正确克隆。送Invitrogen公司测序鉴定，命名为PLT-HJVi***。具体操作步骤如下：
1.构建质粒酶切体系
XbaI       10U
XhoI       10U
10xBuffer  5ul
BSA        0.5ul
PLT质粒    10ul
用水补足50ul， 37℃，2h。
2.构建2nd        PCR产物酶切体系
XbaI            10U
XhoI            10U
10x Buffer      5ul
BSA             0.5ul
2ndPCR产物      30ul
用水补足50ul，37℃，2h。
3.分别利用试剂盒(invitrogen)胶纯化上述酶切产物。
4.构建连接***
10x Buffer       2ul
T4连接酶         1ul
PLT酶切产物      1ul
2ndPCR酶切产物   5ul
用水补足20ul，16℃，16h。
5.取5ul连接产物转化感受态细胞，涂板后，氨苄青霉素筛选。
6.挑取阳克隆，小量扩增质粒。
7.用xbaI与XhoI酶切鉴定质粒，选择阳性结果质粒，测序保存。
实施例3
重组慢病毒PLT-HJVi的生产流程
1、接种293T细胞1.5X107个细胞于9cm培养皿(Coming)中，37℃，5％CO2培养过夜；
2、转染前20分钟换新鲜培养基；
3、按照9:8:1的比例将PLT-HJVi质粒与慢病毒包装质粒P8.2以及P-VSV(均购自Invitrogen公司)混合；
4、取20ul上述质粒混合物与DMEM培养基500ul混匀，标记为A管，另取20ul脂质体与500ul DMEM培养基混匀，标记为B管。将A管与B管混匀，室温放置30min，将混合物轻轻加入第1步中的9cm培养皿的培养基中，培养过夜；
5、24小时后加7.5ml培养基继续培养48小时；
6、收集细胞上清并用0.45um滤器过滤，细胞可以扩大培养，持续收取病毒上清。
7、测定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl调整细胞滴度至1000VP/ml。
8、包装入2ml西林瓶中(每瓶含1ml)，保存于-80℃。
9、对病毒进行热源检测、微生物检测，确保无热源，无细菌、真菌、野生病毒污染。
实施例4
重组慢病毒PLT-HJVi体外实验
复苏神经元细胞株P12，接种于6孔板，每孔1X106个。取PLT-HJVi慢病毒液，按照每毫升培养基加1ul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12细胞培养基中，轻轻左右混匀，以充分感染细胞株，分别处理0h、6h、12h、24h、48h，收集细胞，利用real-time PCR技术进行定量测定HJV mRNA表达情况，以0h为对照组，可见HJV的表达在12h之后受到明显的抑制。如图4。
复苏神经元细胞株P12，接种于6孔板，每孔1X106个。利用PLT-HJVi慢病毒感染细胞株，分别处理0h、6h、12h、24h、48h，收集细胞，利用western-blot技术进行定量测定铁调素hepcidin的表达情况，以0h为对照组，可见hepcidin的表达在12h之后明显上调。如图5。
实施例5
重组慢病毒PLT-HJVi体内实验
选择3月龄SD大鼠雄雌各10只，按性别随机分为两组，两组实验鼠均以高铁饲料(购自SIGMA)喂养3个月，构建高血清铁大鼠模型，并测定血清铁浓度。
之后，实验组注射PLT-HJVi病毒液，每次剂量为500ul病毒液(1000VP/ml)，每3天注射一次，3次为一疗程；对照组注射PBS等渗盐水；
一疗程结束后，分别于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常规方法利用血清生化仪测定血清铁浓度。
结果发现，从第6天开始，病毒组血清铁浓度开始下降，12天达到正常血清铁水平。如图6。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。能够与HJV的mRNA反向互补的所有其他19-27个碱基序列的小干扰性RNA、编码此类小干扰性RNA的相应shRNA的DNA模板、以及含有这些DNA模板的重组慢病毒也同样可以实施到本发明中。
                    序列表
<110>钱忠明
葛啸虎
柯亚
汪程远
<120>抑制铁调素调节蛋白的RNA干扰、重组慢病毒及其应用
<130>0710199PJE
<160>4
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>寡核苷酸
<400>1
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>寡核苷酸
<400>2
Figure S07175360820070907D000122
<210>3
<211>89
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>3
<210>4
<211>89
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>4
Figure S07175360820070907D000132

Claims (10)

1.一种抑制铁调素调节蛋白HJV表达的小干扰性RNA，其特征在于：所述小干扰性RNA为以下序列：
Seq ID No.1：5’-CAAUCUUCCUGCAGCCUUUGA-3’
Seq ID No.2：3’-GUUAGAAGGACGUCGGAAACU-5’
2.一种编码shRNA的DNA，其特征在于：所述shRNA是含有权利要求1所述的小干扰性RNA的正义链及反义链的shRNA。
3.根据权利要求2所述的一种编码shRNA的DNA，其特征在于：所述DNA还含有U6启动子及PolyA终止信息序列。
4.根据权利要求2所述的一种编码shRNA的DNA，其特征在于：所述DNA含有序列表中Seq ID No.3所示的序列。
5.根据权利要求4所述的一种编码shRNA的DNA，其特征在于：所述DNA为双链DNA，模板链为序列表中Seq ID No.3所示的序列，编码链为序列表中Seq ID No.4所示的序列。
6.一种抑制铁调素调节蛋白HJV表达的重组慢病毒，其特征在于：所述重组慢病毒含有权利要求2～5中任意一项所述的DNA以及慢病毒载体。
7.根据权利要求6所述的一种抑制铁调素调节蛋白表达的重组慢病毒，其特征在于：所述慢病毒载体为自身失活慢病毒载体SIN。
8.权利要求2～5中任意一项所述的DNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。
9.权利要求6或7所述的重组慢病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。
10.权利要求1所述的小干扰性RNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。
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