CN112574303B - 一种抗c反应蛋白的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新颖的包含CRP抗原结合结构域的分离的结合蛋白,并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。本发明公开的结合蛋白包括至少一个互补决定区:或;与互补决定区具有至少80%的序列同一性且与C反应蛋白具有KD≤7.43×10‑10mol/L的亲和力。所述结合蛋白活性强,与人CRP蛋白具有很高的亲和力,可广泛应用于CRP蛋白的检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域,具体而言,涉及一种抗C反应蛋白的抗体。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是急性时相反应蛋白之一,1930年美国洛克菲勒研究院AVERY实验室的Tillett和Fransic发现急性感染患者的血清能和肺炎双球菌细胞壁上的C多糖发生沉淀反应,后证实参与反应的是一种蛋白质,故称之为C反应蛋白。CRP属于穿透素家族成员之一,相对分子质量为115KD-140KD,它由5个相同的亚单位以非共价键形式结合,形成对称的环状五球体,中间环绕一孔型结构其凹面含有配体结合位点,每个亚单位有206个氨基酸残。炎症、感染、组织损伤时,在细胞因子(如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子)等的刺激下,CRP主要由肝脏合成后存在于人的血液中,在血液中的半衰期大概为19h。此外,外周血淋巴细胞也能合成少量的CRP。
CRP具有多种生物学功能,参与多种自身生理及病理生理过程。CRP与磷脂胆碱残基具有高度亲和力,并且可以和多种自身配体(如浆细胞脂蛋白、损伤细胞的细胞膜、小核糖体蛋白颗粒和调理素细胞等)或外来配体(如多聚糖、磷脂以及细菌、真菌、寄生虫等微生物的组分)相结合。CRP与这些配体结合后,仅能激活补体活化经典途径的初级阶段,限制补体激活晚期炎症反应的发展及强度。此外,CRP还能增加淋巴细胞活性,增强巨噬细胞对各种细菌和异物的吞噬能力,抑制血小板凝集及抗炎等作用。
CRP是急性时相反应蛋白中变化最显著的一种,也是人体感染的一个重要的标志物。CRP虽然是一个非特异性的标志物,但它与一些感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病、恶性肿瘤和抑郁症等疾病的发生发展存在很大的相关性,具体例如:
血清CRP水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。通常情况下,机体CRP浓度较低,新生儿血清CRP<2mg/L,儿童和正常成年人血清中CRP≤10mg/L。在感染性疾病疾病中,CRP浓度可在6-8h内迅速上升,24-48h达到高峰。高峰值可达正常值的数百倍。而在感染消除后又急剧下降,一周内即可恢复正常。
CRP水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。各种细菌感染均可引起CRP水平的升高,10-99mg/L提示局灶性或浅表性感染,≥100mg/L提示败血症或侵袭性感染等严重情况。因此,血清CRP水平可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的长短、预后及复发。
CRP可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断。细菌感染时CRP水平显著上升,而病毒感染时CRP水平多正常或轻度升高,因此CRP还可以帮助细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。
CRP在大多数***病的活动期均可升高。***病多为自身免疫病,包括***性红斑狼疮和类风湿性关节炎等,虽然病因、病理及表现形式和治疗方式各不相同,但自身免疫性炎症在疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。CRP是类风湿性关节炎早期关节破坏及预后的重要预测指标之一。
CRP可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测斑块破裂的可能性,是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠脉综合症患者的CRP水平明显升高,其升高水平与冠状动脉硬化阻塞程度、冠心病终末事件的发生及预后、充血性心力衰竭的程度均有显著相关性。
恶性肿瘤患者的CRP水平大都增高,CRP与AFP的联合检测可用于肝癌和肝脏良性疾病的鉴别诊断。CRP对于肿瘤的治疗和手术效果的评估具有重要意义,有助于临床评估肿瘤的进程。
CRP的升高与代谢综合征密切相关。近年来,糖尿病也被认为是一种由细胞因子介导的慢性低度炎症性疾病,CRP等许多炎症因子在Ⅱ型糖尿病患者中显著升高,血清中的CRP水平与人群中Ⅱ型糖尿病的发病率增加密切相关,CRP基因的多态性也与糖尿病的发病相关。
传统的CRP测定方法有多种,如免疫沉淀法、免疫比浊法、标记免疫法等,其中以免疫比浊法最常用。不同方法都有各自的优缺点,但是都需要针对于CRP的特异性单克隆抗体。传统的临床诊断使用的都是鼠源的单克隆抗体。
长期以来,杂交瘤技术生产的鼠单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗。但由于杂交瘤方式生产采用小鼠腹腔诱生,受小鼠个体影响特别大,生产不稳定、批间差大,小鼠自身抗体纯化难度大,且现有的抗CRP抗体由于活性低、亲和力差,无法很好地应用于CRP的检测中,因此本领域对于有效且特异性结合检测CRP并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
发明内容
本发明涉及一种新颖的包含C反应蛋白(CRP)抗原结合结构域的分离的结合蛋白,并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。
所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区;或;与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80%的序列同一性且与CRP具有KD≤7.43×10-10mol/L的亲和力;
互补决定区CDR-VH1为G-X1-N-I-X2-D-I-Y-X3-H,其中,
X1是Y或F,X2是R或K,X3是I、V或L;
互补决定区CDR-VH2为R-I-X1-P-A-X2-T-H-T-X3-Y-X4-P-K-F-Q-D,其中,
X1是D或E,X2是N、H或Q,X3是I或L,X4是A或G;
互补决定区CDR-VH3为A-X1-P-R-X2-Y-G-R-X3-W-F,其中,
X1是I、V或L,X2是D或E,X3是G或A;
互补决定区CDR-VL1为H-X1-N-Q-X2-I-G-X3-W-L-S,其中,
X1是A或G,X2是Q、H或N,X3是F、V或W;
互补决定区CDR-VL2为E-X1-S-N-X2-H-T,其中,
X1是S或T,X2是I或L;
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-G-X2-I-X3-P-L-T,其中,
X1是Q或N,X2是Q或N,X3是T、Y或S。
一个重要优点在于,所述结合蛋白活性强,与CRP(特别是人的CRP)具有很高的亲和力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明抗CRP的抗体的单克隆抗体电泳图。
具体实施方式
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
在进一步叙述本发明之前,应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中,因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案,而非作为限制,因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
名词定义
“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段,特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体,“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段,包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位,以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外,“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体,包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体,以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分,并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义,例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),E.Kabat等,美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices),(1983))和Chothia中。抗体的构架区,即构成要件轻链和重链的组合的构架区,起到定位和对齐CDR的作用,所述CDR主要负责与抗原的结合。
当在本文中使用时,“骨架区”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
通常情况下,重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
当在本文中使用时,与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此,术语“分离的”包括从其原始环境,例如如果它是天然存在的,从天然环境取出的多肽或核酸。
本发明的示例性实施方案
本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白,其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区;或;与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80%的序列同一性且与CRP具有KD≤7.43×10-10mol/L的亲和力;
互补决定区CDR-VH1为G-X1-N-I-X2-D-I-Y-X3-H,其中,
X1是Y或F,X2是R或K,X3是I、V或L;
互补决定区CDR-VH2为R-I-X1-P-A-X2-T-H-T-X3-Y-X4-P-K-F-Q-D,其中,
X1是D或E,X2是N、H或Q,X3是I或L,X4是A或G;
互补决定区CDR-VH3为A-X1-P-R-X2-Y-G-R-X3-W-F,其中,
X1是I、V或L,X2是D或E,X3是G或A;
互补决定区CDR-VL1为H-X1-N-Q-X2-I-G-X3-W-L-S,其中,
X1是A或G,X2是Q、H或N,X3是F、V或W;
互补决定区CDR-VL2为E-X1-S-N-X2-H-T,其中,
X1是S或T,X2是I或L;
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-G-X2-I-X3-P-L-T,其中,
X1是Q或N,X2是Q或N,X3是T、Y或S。
在一些实施方式中,所述抗原结合结构域与上述氨基酸序列的互补决定区具有至少85%,或90%,或91%,或92%,或93%,或94%,或95%,或96%,或97%,或98%,或99%的序列同一性且与CRP具KD≤7.43×10-10mol/L,KD值也可以选择1×10-10mol/L、2×10- 10mol/L、3×10-10mol/L、4×10-10mol/L、5×10-10mol/L、6×10-10mol/L、7×10-10mol/L、8×10-10mol/L、9×10-10mol/L、1×10-11mol/L、2×10-11mol/L、3×10-11mol/L、4×10-11mol/L、5×10-11mol/L、6×10-11mol/L、7×10-11mol/L、8×10-11mol/L、9×10-11mol/L、1×10-12mol/L、2×10-12mol/L、3×10-12mol/L、4×10-12mol/L、5×10-12mol/L、6×10-12mol/L、7×10-12mol/L、8×10-12mol/L或9×10-12mol/L;
或者8.93×10-12mol/L≤KD≤7.43×10-10mol/L;
其中,亲和力按照本发明说明书中的方法测定。
在一些实施方式中:
所述互补决定区CDR-VH1中,X1是F;
所述互补决定区CDR-VH2中,X4是G;
所述互补决定区CDR-VH3中,X2是D;
所述互补决定区CDR-VL1中,X1是A;
所述互补决定区CDR-VL2中,X2是L;
所述互补决定区CDR-VL3中,X1是N。
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X2独立地选自R;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X2独立地选自K;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X3独立地选自I;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X3独立地选自V;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH1中,X3独立地选自L;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X1独立地选自D;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X1独立地选自E;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X2独立地选自N;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X2独立地选自H;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X2独立地选自Q;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X3独立地选自I;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH2中,X3独立地选自L;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1独立地选自I;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1独立地选自V;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X1独立地选自L;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X3独立地选自G;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VH3中,X3独立地选自A;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X2独立地选自Q;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X2独立地选自H;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X2独立地选自N;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3独立地选自F;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3独立地选自V;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL1中,X3独立地选自W;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X1独立地选自S;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL2中,X1独立地选自T;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X2独立地选自N;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X2独立地选自Q;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X3独立地选自T;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X3独立地选自Y;
在一些实施方式中,所述互补决定区CDR-VL3中,X3独立地选自S。
在一些实施方式中,各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种:
在一些实施方式中,所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如重链的3个CDRs,或者轻链的3个CDRs);或者,所述结合蛋白包括至少6个CDRs。
在一些实施方式中,所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
在一些实施方式中,所述结合蛋白为抗体的“功能片段”,例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。
scFv(sc=单链),双特异抗体(diabodies)。
这些抗体功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断,本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原***二硫键的方法获得上述的功能片段。
抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪,比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪,通过肽合成获得。
在一些实施方式中,所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4,和/或,序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
需要说明的是,除本申请上述公开的氨基酸序列外,骨架区的种属来源可以为人,以构成人源化抗体。
在一些实施方式中,所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
在一些实施方式中,所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
在一些实施方式中,所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中,所述恒定区来源于鼠;
轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示;
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:1-10的序列如下表所示:
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种分离的核酸分子,所述核酸分子为DNA或RNA,其编码如上所述的结合蛋白。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种载体,其包含如上所述的核酸分子。
本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体,例如质粒,进一步为表达质粒。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种宿主细胞,其被如上所述的载体转化。
所述宿主细胞可以为真核细胞,比如哺乳动物细胞。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为CHO细胞。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:
在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞,从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
合适的培养环境例如细胞系(如CHO),或者在裸鼠中培养等。
根据本发明的一方面,本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病、肿瘤和抑郁症的诊断剂或试剂盒中的应用。
在一些实施方式中,所述感染性疾病包括细菌感染、真菌感染或病毒感染。
在一些实施方式中,所述自身免疫病包括***红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、类风湿关节炎、混合性***病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、Addisons病、白斑、Graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎縮性胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物疾病。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种检测测试样品中的CRP抗原的方法,其包括:
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下,使所述测试样品中的CRP抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物;和
b)检测所述免疫复合物的存在,所述复合物的存在指示所述测试样品中所述CRP抗原的存在。
在此实施方式中,所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂,以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述结合蛋白结合;
在此实施方式中,所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体,用于结合CRP的不同抗原表位;
所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂,以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述CRP抗原结合;
在此实施方式中,所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原,所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂,以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中,所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种试剂或试剂盒,其包括如上所述的结合蛋白。
在一些实施方式中,所述试剂或试剂盒还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种抗人CRP的重组抗体的示例性制备方法。
S1构建表达质粒:
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司;
MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司;BD SMARTTMRACEcDNAAmplification Kit试剂盒购自Takara公司;
pMD-18T载体购自Takara公司;
质粒提取试剂盒购自天根公司;
引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成;
分泌Anti-HCRP 11C2单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株,复苏备用。
S11,引物的设计与合成:
扩增重链和轻链的5’RACE上游引物:
SMARTER II A Oligonucleotide:
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’;
5'-RACE CDS Primer(5'-CDS):5’>(T)25VN<3’(N=A,C,G,or T;V=A,G,or C);
Universal Primer A Mix(UPM):
5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’;
Nested Universal Primer A(NUP):
5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’;
mIgG CKR:5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’;
mIgG CHR:5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’。
S12,抗体可变区基因克隆及测序:
从分泌Anti-CRP 9C5单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA,用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成,获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mkR引物进行扩增,Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.75KB左右的目的条带,Heavy Chain的引物对扩增出1.42KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收,产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。
S13,Anti-CRP 9C5抗体可变区基因的序列分析:
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析,并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的,其中Light Chain扩增出的基因片段中,VL基因序列为324bp,属于VkII基因家族,其前方有57bp的前导肽序列;HeavyChain引物对扩增出的基因片段中,VH基因序列为360bp,属于VH1基因家族,其前方有57bp的前导肽序列。
S14,重组抗体表达质粒的构建:
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体,该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点,并命名为pcDNA3.4A表达载体,后续简称3.4A表达载体;根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果,设计Anti-CRP 9C5抗体的VL和VH基因特异性引物,两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基,引物如下:
CRP-9C5-HF:5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC<3’;
CRP-9C5-HR:5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCTC<3’;
CRP-9C5-LF:5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTA<3’;
CRP-9C5-LR:5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA<3’。
通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.41kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切,3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切,将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中,分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
实施例2
重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞及表达上清抗体活性鉴定
质粒用超纯水稀释至400ng/ml,调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中,100μl质粒与700μl细胞混合,转入电转杯,电转,第3、5、7天取样计数,第7天收样检测,得到的抗体的电泳图如图1所示,在还原性SDS-PAGE后显示两条带,1条Mr为50KD(重链),另一条Mr为28KD(轻链),轻链和重链的序列分别如SEQ ID NO:11以及12所示。
经分析,重链的互补决定区(WT):
CDR-VH1为G-Y(X1)-N-I-R(X2)-D-I-Y-I(X3)-H;
CDR-VH2为R-I-D(X1)-P-A-N(X2)-T-H-T-I(X3)-Y-A(X4)-P-K-F-Q-D;
CDR-VH3为A-I(X1)-P-R-E(X2)-Y-G-R-G(X3)-W-F;
轻链的互补决定区:
CDR-VL1为H-G(X1)-N-Q-Q(X2)-I-G-F(X3)-W-L-S;
CDR-VL2为E-T(X1)-S-N-I(X2)-H-T;
CDR-VL3为Q-Q(X1)-G-Q(X2)-I-T(X3)-P-L-T;
其中,X1、X2、X3、X4均为待突变位点。
表1与抗体活性有关的突变位点
发明人将WT中的CDR位点进行上述突变,以获得活性更好的抗体。
包被液稀释CRP抗原(BBI)1ug/ml进行微孔板包被,每孔100μl,4℃过夜;次日,洗涤液清洗2次,拍干;加入封闭液(20%BSA+80%PBS),每孔120μl,37℃,1h,拍干;加入稀释后的CRP单克隆抗体,100μl/孔,37℃,30min,洗涤液清洗5次,拍干;加入标记羊抗鼠IgG-HRP(1:15K),每孔100μl,37℃,30min洗涤液清洗5次,拍干;加入显色液A液(50μl/孔),加入显色液B液(50μl/孔),10min;加入终止液,50μl/孔;酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
表2抗体活性分析数据
从上表可知,突变1的活性效果最佳,且性质相近的氨基酸突变结果也并非均可行,具有不可预期性。因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点,部分结果如下。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
亲和力分析
利用AMC传感器,纯化抗体用PBST稀释到10ug/ml,CRP抗原(BBI)用PBST进行梯度稀释:20ug/ml、6.66ug/ml、2.22ug/ml、0.74ug/ml、0.24ug/ml、0.082ug/ml、0.027ug/ml、0.0091ug/ml;
运行流程:缓冲液1(PBST)中平衡60s,抗体溶液中固化抗体240s,缓冲液2(PBST)中孵育180s,抗原溶液中结合240s,缓冲液2中解离1000s,用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生,输出数据。(KD表示平衡解亲常数既亲和力;kon表示结合速率;kdis表示解离速率)。
表4亲和力分析数据
从表4可以看出,表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。
为验证上述结果,以WT作为骨架序列重复上述实验,进行突变位点的亲和力验证,部分结果如下。
表5以WT为骨架进行的突变
表6亲和力分析数据
从表5和表6分析,在保证具有抗体活性的前提下,上述突变位点与其他位点的关联也不大。
申请人将表4中上述抗体与内部另一株抗体(与原WT序列的抗体配对的抗体)做配对抗体实验验证,抗体性质与WT抗体未发生明显改变,经双抗夹心法配对实验验证,特异性均维持原有高水平,未见明显改变,这说明上述抗体与突变前的WT抗体识别的为相同表位。但由于突变抗体活性和亲和力的升高而表现出了更高的灵敏度。
选突变1和WT作为包被抗体,分别与另一株作为标记的CRP抗体配套使用,在荧光快速诊断平台比较的具体性能见下表7:
表7性能评价表
条件 | 特异性 | 灵敏度 | 一致性 | 相关性 | 线性 |
WT | 100.0% | 92.0% | 91.9% | 0.9472 | 0.8972 |
突变1 | 100.0% | 95.7% | 97.3% | 0.9597 | 0.921 |
稳定性分析
将基于突变1的同批次抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天,取7天、14天、21天样品进行状态观察,并对21天样品进行活性检测,结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化,活性也未随考核温度的升高呈下降越势,说明自产抗体稳定。下表8为考核21天的酶免活性检测OD结果。
表8稳定性分析数据
样品浓度(ng/ml) | 40 | 8 | 0 |
4℃,21天样品 | 1.947 | 0.785 | 0.057 |
-80℃,21天样品 | 1.952 | 0.819 | 0.026 |
37℃,21天样品 | 1.906 | 0.763 | 0.031 |
进一步地将WT,以及随机抽取的8个突变抗体进行稳定性检测;将上述抗体在37℃保存72小时,取出后与同批次的4℃保存72小时的抗体在同一检测条件下检测相同的阴、阳性质控样本,检测方法如上述实施例中所采用的抗体活性分析方法,各组抗体的线性均可达99.90%以上,且CV值低于10%,不同温度保存的抗体活性未见统计学差异。这说明上述抗体均具有优秀的稳定性,且位点的突变对稳定性无影响。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 一种抗C反应蛋白的抗体
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys
20
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Lys Ala Thr Ile Thr Ser Ala Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Gly Asn Gln Gln Ile Gly Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Ser Asn Ile His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Gln Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 12
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Arg Asp Ile
20 25 30
Tyr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr His Thr Ile Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Ala Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Pro Arg Glu Tyr Gly Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
435 440
Claims (21)
1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白,其特征在于,所述抗原为C反应蛋白,所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3;
互补决定区CDR-VH1为G-X1-N-I-X2-D-I-Y-X3-H,其中,X1是F;
互补决定区CDR-VH2为R-I-X1-P-A-X2-T-H-T-X3-Y-X4-P-K-F-Q-D,其中,X4是G;
互补决定区CDR-VH3为A-X1-P-R-X2-Y-G-R-X3-W-F,其中,X2是D;
互补决定区CDR-VL1为H-X1-N-Q-X2-I-G-X3-W-L-S,其中,X1是A;
互补决定区CDR-VL2为E-X1-S-N-X2-H-T,其中,X2是L;
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-G-X2-I-X3-P-L-T,其中,X1是N;
各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种:
2.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白,其特征在于,所述抗原为C反应蛋白,所述抗原结合结构域包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3;
互补决定区CDR-VH1为G-X1-N-I-X2-D-I-Y-X3-H,其中,X1是Y;
互补决定区CDR-VH2为R-I-X1-P-A-X2-T-H-T-X3-Y-X4-P-K-F-Q-D,其中,X4是A;
互补决定区CDR-VH3为A-X1-P-R-X2-Y-G-R-X3-W-F,其中,X2是E;
互补决定区CDR-VL1为H-X1-N-Q-X2-I-G-X3-W-L-S,其中,X1是G;
互补决定区CDR-VL2为E-X1-S-N-X2-H-T,其中,X2是I;
互补决定区CDR-VL3为Q-X1-G-X2-I-X3-P-L-T,其中,X1是Q;
各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种:
3.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白,其特征在于,所述结合蛋白为F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的一种。
4.根据权利要求1~2任一项所述的结合蛋白,其特征在于,所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4,和/或,序列依次如SEQID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
5.如权利要求1~2任一项所述的结合蛋白,其特征在于,所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白,其特征在于,所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白,其特征在于,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
8.根据权利要求7所述的结合蛋白,其特征在于,所述恒定区的种属来源为乳牛。
9.根据权利要求7所述的结合蛋白,其特征在于,所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。
10.根据权利要求7所述的结合蛋白,其特征在于,所述恒定区来源于小鼠。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白,其特征在于,轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示;重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
12.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子为DNA或RNA,其编码权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。
13.一种载体,其包含权利要求12所述的核酸分子。
14.一种宿主细胞,其被权利要求13所述的载体转化。
15.一种生产权利要求1~11任一项所述的结合蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:
在合适的培养条件下培养权利要求14所述的宿主细胞,从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
16.权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备用于CRP抗原检测试剂中的应用。
17.权利要求1~11任一项所述的结合蛋白在制备检测测试样品中的CRP抗原的试剂盒中的应用,其包括:
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下,使所述测试样品中的CRP抗原与权利要求1~11任一项所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物;和
b)检测所述免疫复合物的存在,所述复合物的存在指示所述测试样品中所述CRP抗原的存在。
18.根据权利要求17所述的应用,其特征在于,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述结合蛋白结合。
19.根据权利要求17所述的应用,其特征在于,在步骤a)中,所述免疫复合物中还包括第二抗体,所述第二抗体与所述CRP抗原结合。
20.一种试剂或试剂盒,其包括权利要求1~11任一项所述的结合蛋白。
21.根据权利要求20所述的试剂或试剂盒,其特征在于,所述试剂或试剂盒还包括缓冲液、稀释剂或载体中的一种或多种。
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