CN112979816B

CN112979816B - 针对ckmb的结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112979816B
Application number: CN201911308270.8A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 覃婷; 周全兴; 王晨
Original assignee: Fapon Biotech Inc
Current assignee: Fapon Biotech Inc
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN112979816A

Abstract

本发明公开了一种针对CKMB的结合蛋白及其应用，涉及抗体技术领域。本发明公开的针对CKMB的结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括至少一个互补决定区。该结合蛋白可以特异性结合CKMB，并具有较好的结合活性和亲和力，其可以用于检测CKMB以及用于诊断与CKMB相关的疾病。

Description

针对CKMB的结合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及针对CKMB的结合蛋白及其应用。

背景技术

肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK)有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，是由两个相同的亚基组成的二聚体，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。CKMB(即杂化型肌酸激酶同工酶)通常分为MB 1与MB2两个异型，在心肌细胞中，CKMB主要以MB 2的形式存在，一旦心肌细胞发生损伤就会释放MB 2，使血清中的CKMB水平在短时间内迅速升高，其升高时间通常于发病6h内，且在24h左右达到峰值，并于72h后逐渐降低，直至恢复正常水平，这表明CKMB可于早期反映出心肌受损情况。由于CKMB在诊断急性心肌梗死中的敏感性和特异性比较高，经过多年的深入研究和临床分析，血清中CKMB升高已成为公认的诊断急性心肌梗死(AMI)和确认有无心肌坏死的重要指标，具有较高的诊断准确率，临床上诊断心肌损害标准就是在排除服用对心肌有损害药物及其他引起心肌酶、心电图异常疾病的基础上，出现含CKMB在内至少1项心肌酶增高合并心电图可能表现异常。特别是各级医院中对于AMI患者的溶栓治疗以及急诊经皮冠状动脉介入治疗的使用越来越广泛，这就要求必须要对AMI进行早期诊断。

由于AMI发病急，进展迅速，病人就诊后需要尽快进行对症治疗。临床应用较多的检测方法是大型生化仪，其检测结果准确，且可以覆盖多个检测指标。但是由于其耗时长，仪器每天需要校准和室内质控，不适合AMI急诊检测需要。琼脂糖凝胶电泳在分离CKMB时，主要根据CK各同工酶不同的分子量及电荷，主要通过扫描各酶谱，获取各区带所占的百分比，并与总酶CK的活力相结合，获取各同工酶的酶活力，但该方法与免疫抑制法相比操作较为复杂，耗时较长且无法达到CKMB质量的定量检测。基于免疫层析的胶体金颗粒检测方法具有使用简便、快速的特点，在传染病以及自身抗原检测方面有较多应用。但是，由于灵敏度不高、不能准确定量，限制了其在AMI检测方面的应用。

目前在临床实验室多采用免疫抑制法测定CKMB，该方法简单迅速，但特异性差。其检测原理是通过抗CK-M抗体，使M亚基活性受到抑制，对B亚基的活性进行检测，因为CKBB在健康人体中的含量极少，可直接忽略，将所测结果乘以2，即可获得血液中CKMB的活性。该方法具有操作简单、检测速度快、成本低等优势，在临床实验室检验中被广泛应用。但后来发现，肌肉分解和一些非心脏疾病均可导致B亚基含量升高从而带来CKMB的假阳性增加。

酶质量法采用化学免疫发光技术进行定量检测，以双抗体夹心法为主，使抗人CKMB抗体包被于磁微粒等固相载体，其标记物为酶标抗人CKMB抗体，对CKMB进行定量分析检测。该检测方法对抗原抗体反应具有较高的特异性，与CKBB及CKMM无交叉反应，具有更高的灵敏度，不受血清中巨CK及其他酶类等因素的影响。因此，酶质量法在准确性上有更明显的优势。但酶质量法所用的抗人CKMB抗体也多为杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体，其受小鼠个体影响特别大，生产不稳定、批间差异大，小鼠自身抗体纯化难度大。另外，现有的抗CKMB抗体由于活性低、亲和力差，无法很好地应用于CKMB的检测中。因此本领域对于有效且特异性结合CKMB并可对其进行检测的抗体存在着强烈需求。

发明内容

本发明的目的在于提供针对CKMB的结合蛋白及其应用。本发明提供的针对CKMB的结合蛋白可以特异性结合CKMB，并具有较好的结合活性和亲和力，其可以用于检测CKMB以及用于诊断与CKMB相关的疾病，本发明为CKMB的有效检测和与CKMB相关的疾病的诊断提供了更多蛋白选择。

名词定义

“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，“骨架区”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语“分离的”或“纯化的”是指所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明的示例性实施方案：

第一方面，本发明实施例提供一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性且与CKMB蛋白具有KD≤5.99×10^-8mol/L的亲和力的相似互补决定区：

互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列G-F-S-X1-X2-T-S-G-X3-G-X4-S，其中：X1是I或L，X2是N或S，X3是M或F，X4是I、L或V；

互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列H-X1-Y-W-X2-D-D-X3-R-Y-N-P-S-X4-K-S，其中：X1是L或I，X2是D或E，X3是Q或K，X4是I或L；

互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列X1-R-R-X2-T-X3-Y-F-D，其中：X1是S或A；X2是F或Y；X3是N或D；

互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列S-X1-S-S-X2-V-X3-Y-M-Y，其中：X1是G或A，X2是S或T，X3是S或T；

互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列X1-T-X2-N-X3-A-S，其中：X1是I或L，X2是S或T，X3是I或L；

互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列Q-X1-W-S-X2-N-X3-W，其中：X1是Q或K，X2是S或R，X3是P或A。

本发明实施例提供的结合蛋白含有抗原结合结构域，该抗原结合结构域包括上述互补决定区中的至少一个，上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该结合蛋白特异性结合CKMB蛋白的能力，且该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，其可以用于检测CKMB以及用于诊断与CKMB相关的疾病，为CKMB的有效检测以及诊断与CKMB相关的疾病提供更多的抗体选择。

在可选的实施方式中，所述相似互补决定与上述至少一个互补决定区的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性且与CKMB蛋白具有K_D≤5.99×10^-8mol/L的亲和力；或K_D≤5×10^-8mol/L；或K_D≤4×10^-8mol/L；或K_D≤3×10^-8mol/L；或K_D≤2×10^-8mol/L；或K_D≤1×10^-8mol/L；或K_D≤9×10^-9mol/L；或K_D≤8×10^-9mol/L；或K_D≤7×10^-9mol/L；或K_D≤6×10^-9mol/L；或K_D≤5×10^-9mol/L；或K_D≤4×10^- ⁹mol/L；或K_D≤3×10^-9mol/L；或K_D≤2×10^-9mol/L；或K_D≤1×10^-9mol/L；

在可选的实施方式中，1.04×10^-9mol/L≤K_D≤5.99×10^-8mol/L。

K_D的检测参考本发明实施例中的方法进行。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是F；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Y；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是S；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是P。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是N；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是S；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X4是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X4是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X4是V；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是Q；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是K；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是S；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是A；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是N；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是S；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是T；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是S；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是T；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是I；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是L；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是K；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S；

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是R。

在可选的实施方式中，上述的各互补决定区中的突变位点(即Xn位点，n＝1，2，3或4)选自下述突变组合1-54中的任一种：

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是M；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是E；

所述互补决定区CDR-VH3中，X2是F；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是T；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是A。

在可选的实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合55-60中的任一种：

在可选的实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个互补决定区(例如重链的3个互补决定区，或者轻链的3个互补决定区)；或者，所述结合蛋白包括至少6个互补决定区(如：重链的3个互补决定区以及轻链的3个互补决定区)；

在可选的实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在可选的实施方式中，所述结合蛋白为抗体的功能性片段，例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的任意一种；

上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原***二硫键的方法获得。

上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在可选的实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

需要说明的是，基于本发明揭示的内容，所述结合蛋白的重链或轻链骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。

在可选的实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。

在可选的实施方式中，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述抗体恒定区来源于小鼠。

在可选的实施方式中，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

SEQ ID NO:1-10的序列如下表所示：

第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断具有CKMB水平异常的疾病的试剂或试剂盒中的应用。

需要说明的是，CKMB水平异常是指相较于正常的水平，CKMB水平明显升高或降低。

在可选的实施方式中，CKMB水平异常是指血清中CKMB水平异常。

在可选的实施方式中，所述CKMB水平异常的疾病包括导致心肌细胞发生损伤的疾病。心肌细胞发生损伤就会释放MB 2，使血清中的CKMB水平在短时间内迅速升高。因此，通过检测血清CKMB水平，将其与正常的水平相比较，如果CKMB水平升高，则可以指示机体患有导致心肌细胞发生损伤的疾病。

在可选的实施方式中，所述导致心肌细胞发生损伤的疾病包括急性心肌梗死。

需要说明的是，急性心肌梗死会导致心肌细胞发生损伤，表现出CKMB水平升高，利用本发明提供的结合蛋白可以检测血清中CKMB水平的变化，可以对急性心肌梗死进行诊断。同理，本领域技术人员容易理解到，其他疾病如果导致心肌细胞发生损伤，使得CKMB水平升高，利用本发明提供的结合蛋白也同样可以对该类疾病进行诊断。基于此，只要是将本发明提供的结合蛋白用于制备诊断具有CKMB水平异常的疾病的试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明实施例提供一种用于诊断CKMB水平异常的疾病的试剂或试剂盒，其含有前述实施方式任一项所述的结合蛋白。

在可选的实施方式中，CKMB水平异常是指血清中CKMB的水平异常。

在可选的实施方式中，所述CKMB水平异常的疾病包括导致心肌细胞发生损伤的疾病。

第四方面，本发明实施例提供一种检测CKMB的方法，其包括：将前述实施方式任一项所述的结合蛋白与待测样本混合。

在可选的实施方式中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。

需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的CKMB蛋白进行定性或定量检测。基于抗体抗原结合形成免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括：

(1)通过沉淀反应实现检测目的，包括：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等；

(2)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的，包括：免疫荧光法、放射免疫分析法以及酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)等；

指示剂可以根据不同的检测方法合理选择，包括但不限于如下描述的指示剂：

(1)免疫荧光法中，指示剂可以是荧光染料，例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料(包括红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料(包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料(包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)；

(2)放射免疫分析法中，指示剂可以是放射性同位素，例如：212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F等。

(3)酶联免疫分析法中，指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。

基于此，在本发明公开了上述结合蛋白基础上，本领域技术人员容易想到采用上述的任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法，以实现对待测样本中CKMB的定量或定性检测，无论选用何种方法，只要是利用了本发明公开的结合蛋白来检测CKMB，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂，以使所述结合蛋白与CKMB蛋白结合的复合物被检测。

第五方面，本发明实施例提供一种分离的核酸，其编码如前述实施方式任一项所述的结合蛋白；

在可选的实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。

在本发明公开了上述结合蛋白的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述结合蛋白的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述结合蛋白的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述结合蛋白，其均属于本发明的保护范围。

第六方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式所述的核酸。

其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是核酸序列以允许表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，调节序列包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

本发明的核酸或其片段可以***到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

第七方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施方式所述的载体。

本发明的表达载体可用于转化宿主细胞。这种转化后的宿主细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的结合蛋白的培养细胞或细胞系。本发明的宿主细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如CHO细胞。

第八方面，本发明实施例提供一种生产前述实施方式任一项所述的结合蛋白的方法，其包括：

培养前述实施方式所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。

所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。

构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或***或置换等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1的CKMB单克隆抗体进行还原性的SDS-PAGE。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。本实施例提供了一种制备抗CKMB的重组抗体的方法

1重组质粒的构建

(1)引物

扩增重链和轻链5’RACE引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’-(T)25VN-3’(N＝A，C，G，orT；V＝A，G，orC)；

Universal Primer A Mix(UPM)：

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

Nested Universal Primer A(NUP)：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

MIgG-CKR：5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3’；

MIgG-CHR：5’-TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTC-3’。

(2)抗体可变区基因克隆及测序

从分泌抗CKMB单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。轻链基因以UniversalPrimer A Mix(UPM)(5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’)、NestedUniversal Primer A(NUP)(5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’)和mIgG CKR引物(5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’)进行扩增，重链基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR(5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’)引物进行扩增。其中轻链的引物对扩增出0.8KB左右的目的条带，重链的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

(3)Anti-CK 8A27抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中轻链扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；重链引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为354bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(4)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计抗CKMB抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

CK8A9-HF：

5’>CAGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAATGCAGCTGTGTCATGCTCTTCTTC<3’；

CKT8A9-HR：

5’>CATCGAATTCTTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGA<3’；

CKT8A9-LF：

5’>CATCAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG<3’；

CKT8A9-LR：

5’>CAGCGAATTCTTACTAACACTCATTCCTGTTGAAGC<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.75KB的轻链基因片段和1.42kb的重链基因片段。重链和轻链基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后重链基因和轻链基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到重链和轻链的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释羊抗鼠IgG 1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的CKMB抗原，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的CKMB单克隆抗体，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对CKMB抗原都有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度，相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体(即为CKMB单克隆抗体)进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(即重链，SEQ ID NO:12)，另一条Mr为28KD(即轻链，SEQ ID NO:14)。

实施例2

抗体的性能检测

(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测

进一步分析，实施例1的CKMB单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ ID NO:11所示，其中，重链的各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR-VH1：G-F-S-I(X1)-N(X2)-T-S-G-M(X3)-G-V(X4)-S；

CDR-VH2：H-I(X1)-Y-W-E(X2)-D-D-Q(X3)-R-Y-N-P-S-I(X4)-K-S；

CDR-VH3：A(X1)-R-R-F(X2)-T-N(X3)-Y-F-D；

其轻链可变区如SEQ ID NO:13所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR-VL1：S-G(X1)-S-S-T(X2)-V-S(X3)-Y-M-Y；

CDR-VL2：L(X1)-T-T(X2)-N-I(X3)-A-S；

CDR-VL3：Q-Q(X1)-W-S-S(X2)-N-A(X3)-W。

在实施例1的CKMB单克隆抗体基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。见下表1。

表1与抗体活性有关的突变位点

结合活性检测：

包被液(PBS)稀释羊抗鼠IgG 1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(PBS)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的CKMB单克隆抗体，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释CKMB抗原，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入另一株标记HRP的CKMB单克隆抗体，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

结果见表2。

表2抗体及其突变体的活性数据

样品浓度(ng/ml)	50	25	12.5	6.25	3.125	0
							WT	2.162	1.424	0.608	0.331	0.218	0.091
突变1	2.412	2.091	0.948	0.610	0.301	0.081
							突变2	2.368	1.932	0.916	0.547	0.276	0.080
突变3	2.268	1.992	0.903	0.537	0.219	0.083
							突变4	2.352	1.972	0.931	0.546	0.232	0.085
突变5	1.933	1.333	0.712	0.558	0.254	0.015
							突变6	1.945	1.256	0.801	0.525	0.288	0.013
突变7	0.352	-	-	-	-	-
							突变8	0.236	-	-	-	-	-
突变9	0.321	-	-	-	-	-
							突变10	0.257	-	-	-	-	-

从表2数据可以看出，WT，以及突变1-突变6具有较好的结合活性，而突变7-10的结合活性比较差，基本不具有结合活性，说明表1中所列的突变方式不具有可预期性。

(1)实施例1抗体及其突变体的亲和力检测

在突变1的基础上，对其他与亲和力有关的位点进行突变，各突变的序列见下表3。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力检测：

(a)利用AMC传感器，将纯化出来的抗体用PBST稀释到10ug/ml，CKMB蛋白用PBST从50ug/ml开始进行2倍梯度稀释；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。结果见表4(K_D表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率)。

表4亲和力检测数据

表4的数据显示，突变1，突变1-1至突变1-53基本上都有比较低的K_D值，说明这些抗体的亲和力都比较好，也说明表3中所列的突变位点的突变方式对抗体亲和力不具有负面影响，充分说明按表3中所列的突变位点的突变方式进行突变可以获得具有较好亲和力的抗体。

(b)在WT的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。

表5以WT为骨架进行的突变

表6以WT为骨架进行的突变的亲和力检测

K<sub>D</sub>(M)

kon(1/Ms)

kdis(1/s)

K<sub>D</sub>(M)

kon(1/Ms)

kdis(1/s)

WT

3.67E-08

1.90E+04

6.97E-04

WT 1-3

5.20E-08

1.69E+04

8.78E-04

WT 1-1

5.66E-08

1.61E+04

9.12E-04

WT 1-4

4.25E-08

1.87E+04

7.96E-04

WT 1-2

4.57E-08

1.86E+04

8.50E-04

WT 1-5

5.99E-08

1.65E+04

9.89E-04

从表6的数据可以看出，WT，WT 1-1至WT 1-6的亲和力也比较好，说明按表5所列突变位点的突变方式进行突变可以获得亲和力较好的抗体。

(3)抗体稳定性检测

将上述实施例的抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降越势，说明自产抗体稳定。下表为突变1考核21天的酶免活性检测OD结果。

表7抗体稳定性分析

样品浓度(ng/ml)	50	25	0
				4℃，21天样品	2.143	1.455	0.056
-80℃，21天样品	2.144	1.439	0.055
				37℃，21天样品	2.175	1.463	0.063

从表7数据看出，在不同温度下存放21天后，本发明实施例的抗体依然可以将抗原检测出，说明本发明实施例提供的抗体均具有优秀的稳定性，且位点的突变对稳定性无影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 菲鹏生物股份有限公司

<120> 针对CKMB的结合蛋白及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Thr Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Val Glu Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Lys Val Phe Leu Lys

1 5 10 15

Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala

195 200

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Ile Asn Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Val Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Glu Asp Asp Gln Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Ile Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Lys Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Phe Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Ile Asn Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Val Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Glu Asp Asp Gln Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Ile Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Lys Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Phe Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser

305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

435 440

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Gly Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Thr Asn Ile Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Ala Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Gly Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Lys Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Thr Asn Ile Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Ala Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：

互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-F-S-X1-X2-T-S-G-X3-G-X4-S；

互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为H-X1-Y-W-X2-D-D-X3-R-Y-N-P-S-X4-K-S；

互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为X1-R-R-X2-T-X3-Y-F-D；

互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为S-X1-S-S-X2-V-X3-Y-M-Y；

互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为X1-T-X2-N-X3-A-S；

互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为Q-X1-W-S-X2-N-X3-W；

所述互补决定区CDR-VH1中，X3是F；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是D；

所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Y；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL2中，X2是S；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是P；

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-54中的任一种：

突变组合 CDR-VH1 X1/X2/X4 CDR-VH2 X1/X3/X4 CDR-VH3 X1/X3 CDR-VL1 X2/X3 CDR-VL2 X1/X3 CDR-VL3 X1/X2 突变组合 1 I/N/V I/Q/I A/N T/S L/I Q/S 突变组合 2 L/N/V L/Q/L A/D S/T L/L Q/R 突变组合 3 I/SV I/Q/L S/N T/T I/I K/S 突变组合 4 L/S/V L/Q/I S/D S/S I/L K/R 突变组合 5 I/N/L I/K/L A/D T/T I/I Q/R 突变组合 6 L/N/L L/K/I S/N S/T L/L K/S 突变组合 7 I/S/L I/K/I A/N T/S I/L Q/S 突变组合 8 L/S/L L/K/L S/D S/S L/I K/R 突变组合 9 I/N/I L/Q/I A/D S/T L/I K/S 突变组合 10 L/N/I L/K/L A/N S/S I/L Q/R 突变组合 11 I/S/I I/Q/L S/D T/S I/I K/R 突变组合 12 L/S/I I/K/I S/N T/T L/L Q/S 突变组合 13 I/N/V L/Q/L S/D S/T I/L K/R 突变组合 14 L/S/I L/K/I A/D T/S L/I Q/S 突变组合 15 L/N/V I/Q/I S/N T/T L/L K/S 突变组合 16 I/N/L I/K/L A/N S/S I/I Q/R 突变组合 17 I/S/I L/Q/L S/N T/S L/L K/S 突变组合 18 I/SV I/K/I S/D S/T L/I Q/R 突变组合 19 L/N/L L/Q/I A/N T/T I/L K/R 突变组合 20 L/S/V I/K/L A/D S/S I/I Q/S 突变组合 21 L/N/I L/K/I S/D S/T L/I Q/R 突变组合 22 I/S/L I/Q/L A/N T/S L/L K/S 突变组合 23 I/N/I L/K/L S/N T/T I/I Q/S 突变组合 24 L/S/L I/Q/I A/D S/S I/L K/R 突变组合 25 I/S/L L/K/L A/D T/T I/I Q/S 突变组合 26 L/N/I I/K/I A/N S/T L/L Q/R 突变组合 27 L/S/L L/K/I S/D T/S I/L K/S 突变组合 28 I/S/V I/K/L S/N S/S L/I K/R 突变组合 29 I/N/I L/Q/I S/N S/T L/L K/S 突变组合 30 I/NL I/Q/L S/D S/S L/I Q/R 突变组合 31 L/S/V L/Q/L A/N T/S I/L K/R 突变组合 32 L/N/L I/Q/I A/D T/T I/I Q/S 突变组合 33 L/S/I L/Q/L A/D S/T L/I K/R 突变组合 34 I/N/V L/K/I A/N S/S I/L Q/S 突变组合 35 I/S/I I/Q/I S/D T/S I/I K/S 突变组合 36 L/N/V I/K/L S/N T/T L/L Q/R 突变组合 37 L/S/L L/Q/I A/N S/T I/L Q/S 突变组合 38 I/N/I L/K/L A/D T/S L/I Q/R 突变组合 39 I/N/V I/Q/L S/N T/T L/L K/S 突变组合 40 L/S/I I/K/I S/D S/S I/I K/R 突变组合 41 I/S/L L/Q/L A/D T/T L/L Q/R 突变组合 42 L/N/V I/K/I S/N S/T L/I K/S 突变组合 43 I/S/I L/Q/I A/N T/S I/L Q/S 突变组合 44 I/N/L I/K/L S/D S/S I/I K/R 突变组合 45 L/S/V L/K/I S/D T/S I/L K/R 突变组合 46 L/N/L I/Q/L A/D S/T L/I Q/S 突变组合 47 I/SV L/K/L S/N T/T L/L K/S 突变组合 48 L/N/I I/Q/I A/N S/S I/I Q/R 突变组合 49 I/N/V L/K/L S/N S/T L/I K/S 突变组合 50 I/S/I I/K/I S/D T/S I/L Q/R 突变组合 51 L/N/V L/Q/L A/N T/T I/I K/R 突变组合 52 L/S/L I/K/L A/D S/S L/L Q/S 突变组合 53 I/N/I L/Q/I S/D S/T I/I Q/R 突变组合 54 I/N/V I/K/L A/N T/S L/L K/S

。

2.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述抗原结合结构域包括如下6个互补决定区：

互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-F-S-X1-X2-T-S-G-M-G-X4-S；

互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为H-X1-Y-W-E-D-D-X3-R-Y-N-P-S-X4-K-S；

互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为X1-R-R-F-T-X3-Y-F-D；

互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为S-G-S-S-X2-V-X3-Y-M-Y；

互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为X1-T-T-N-X3-A-S；

互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为Q-X1-W-S-X2-N-A-W，

各互补决定区的突变位点选自下述突变组合55-60中的任一种：

突变组合 CDR-VH1 X1/X2/X4 CDR-VH2 X1/X3/X4 CDR-VH3 X1/X3 CDR-VL1 X2/X3 CDR-VL2 X1/X3 CDR-VL3 X1/X2 突变组合 55 I/N/V I/Q/I A/N T/S L/I Q/S 突变组合 56 L/S/L I/K/I S/N T/T I/I K/R 突变组合 57 L/S/V I/Q/I A/N S/S L/L Q/S 突变组合 58 I/N/L I/K/L A/D T/T L/L K/S 突变组合 59 I/N/V I/K/I S/D S/T I/I K/R 突变组合 60 L/S/I I/Q/L A/D T/S L/L Q/S

。

3.如权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为抗体或其功能性片段。

4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的任意一种。

5.根据权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

6.根据权利要求1-2任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区。

7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

8.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

9.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛。

10.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为火鸡或斗鸡。

11.根据权利要求6所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区来源于小鼠。

12.根据权利要求11所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

13.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-12任一项所述的结合蛋白。

14.一种如权利要求1-12任一项所述的结合蛋白在制备检测CKMB的试剂盒中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：将权利要求1-12任一项所述的结合蛋白与待测样本混合；

通过沉淀反应实现CKMB检测或者是通过标记显示信号强度的指示剂实现CKMB检测。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述通过沉淀反应实现CKMB检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、免疫电泳以及免疫印迹法；所述免疫电泳包括对流免疫电泳。

17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述通过标记显示信号强度的指示剂实现CKMB检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：免疫荧光法、放射免疫分析法以及酶联免疫分析法。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所示指示剂选自荧光染料、放射性同位素和催化底物显色的酶中的任意一种。

19.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1-12任一项所述的结合蛋白的核酸。

20.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求19所述的载体。

21.一种生产权利要求1~12任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，其包括：

培养权利要求20所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述结合蛋白。