CN112557550A - 一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，属于药物分析技术领域。其HPLC检测条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ACE Excel C18‑AR 5μm 250×4.6mm，或效能相当的色谱柱）；以0.01mol/L磷酸氢二钾（用磷酸调节pH至6.5）‑甲醇（85：15）为流动相A，甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。本发明的有益效果是，各杂质之间分离度好，分析时间短，成本低，能有效地控制甲硝唑氯化钠注射液的有关物质，确保产品的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，更具体地说，本发明涉及一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法。
背景技术
甲硝唑氯化钠注射液为一种抗菌药物，主要用于厌氧菌感染的治疗。
中国药典2020版收载了甲硝唑氯化钠注射液的质量标准，采用高效液相色谱法控制其中有关物质的含量，但该方法只控制杂质Ⅰ的含量，其他杂质以杂质总量的方式确定，没有对每种杂质进行归属及测定。其他药典如美国药典40和欧洲药典9.0也没有控制每种杂质的含量。综合以上情况，为了更有效地控制甲硝唑氯化钠注射液的有关物质含量，保证用药安全有效，本申请人以欧洲药典9.0中甲硝唑原料的有关物质检查方法为基础，研制开发了适合本品的有关物质检查方法。本方法能够有效分离杂质A～G，且方法快速简便，具有较好的准确度、专属性和线性。
发明内容
鉴于现有技术的严重不足，本申请人以欧洲药典9.0为基础，经过了大量实验摸索了甲硝唑氯化钠注射液的质量控制方法，并严格进行了方法学验证，保证了方法的科学严谨，满足了研发和生产的需求。因此，本发明的目的在于提供一种甲硝唑氯化钠注射液有关物质的HPLC（高效液相色谱仪）测定方法。
表1 有关物质分析方法优化内容
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，采用高效液相色谱法（HPLC）检测， 包括以下步骤：
步骤一：取样品适量，用15%甲醇定量稀释制成甲硝唑的溶液；
步骤二：以磷酸氢二钾-甲醇溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；
步骤三：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱仪，以紫外检测器为检测器对样品采用高效液相色谱法检测。
优选地，以0.01mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钾与甲醇的体积比85：15为流动相A。
优选地，所述磷酸氢二钾的PH值用磷酸调节至6.5。
优选地，步骤三中，高效液相色谱仪以ACE Excel C18-AR 5μm 250×4.6mm为色谱柱，以0.01mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钾与甲醇的体积比85：15为流动相A，以甲醇为流动相B，按照下表程序进行梯度洗脱。
优选地，所用高效液相色谱仪检测方法如下：样品注入色谱仪的进样体积为20μl，检测波长为315nm。
优选地，样品为供试品溶液、对照溶液、灵敏度溶液或***适用性溶液。
优选地，包括如下步骤：
1）样品制备
供试品溶液的制备：取本品适量，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml中含甲硝唑0.5mg的溶液；
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
灵敏度溶液的制备：精密量取对照溶液5ml，置25ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
***适用性溶液的制备：取甲硝唑杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，精密称定，加少量甲醇溶解后，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml约含杂质A～G各5μg的混合溶液，精密量取5ml、样品5ml，置同一50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
2）采用所述高效液相色谱法检测条件对上述供试品溶液、对照溶液和***适用性溶液进行检测，对待测样品的有关物质的定性分析和定量分析。
优选地，甲硝唑杂质A 为2-甲基-5硝基咪唑。
优选地，步骤2）具体如下：取***适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，再精密量取供试品溶液和对照溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与杂质A～G相对保留时间一致的色谱峰，按加校正因子主成分自身对照法计算，峰面积与其相对校正因子的乘积不得大于对照溶液主峰面积的0.1%；其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.1%；杂质总量不得过0.5%；供试品溶液色谱图中与甲硝唑相对保留时间为0.22，之前的峰忽略不计。
本发明的技术效果和优点：各杂质之间分离度好，操作简便快捷，分析时间短，成本低，能有效地控制甲硝唑氯化钠注射液的有关物质，确保产品的安全性和有效性。
附图说明
图1 为本发明样品有关物质检查-供试品(20040216)图谱；
图2 为本发明样品有关物质检查-供试品(20040316)图谱；
图3 为本发明样品有关物质检查-供试品(20040416)图谱；
图4 为本发明专属性试验图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1-3所示，本发明提供了一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，包括以下步骤：
步骤一：取样品适量，用15%甲醇定量稀释制成甲硝唑的溶液；
步骤二：以磷酸氢二钾-甲醇溶液为流动相；
步骤三：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱仪；
步骤四：以紫外检测器为检测器。
仪器和条件
Waters2695高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ACE Excel C18-AR 5μm 250×4.6mm，或效能相当的色谱柱）；以0.01mol/L磷酸氢二钾（用磷酸调节pH至6.5）-甲醇（85: 15）为流动相A，甲醇为流动相B，按照下表程序进行梯度洗脱；柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量25μl。
实验步骤：
供试品溶液的制备：取本品适量，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml中约含甲硝唑0.5mg的溶液。
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。
灵敏度溶液的制备：精密量取对照溶液5ml，置25ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。
***适用性溶液的制备：取甲硝唑杂质A(2-甲基-5硝基咪唑)、B、C、D、E、F、G对照品适量，精密称定，加少量甲醇溶解后，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml约含杂质A～G各5μg的混合溶液，精密量取5ml、样品5ml，置同一50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。
精密量取供试品溶液和对照溶液，分别注入色谱仪，记录色谱图。
分别使用以上方法检测3批甲硝唑氯化钠注射液中试样品中的有关物质，检测结果见表2，图谱见图1-图3，在上述色谱条件下，甲硝唑氯化钠注射液有关物质之间分离度好，各杂质理论板数均大于2000，拖尾因子符合要求。
表2：有关物质(杂质A，杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G)检测结果
相关验证
1.专属性
辅料供试液：按单制剂处方比例配制不含甲硝唑的单辅料溶液各100ml，分装于西林瓶中，于121℃灭菌12分钟，取单个辅料溶液各1ml，置同一10ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀；
杂质对照品溶液：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G对照品适量，精密称定，分别用稀释溶剂定量稀释制成每1ml约含杂质100μg的溶液（单个杂质贮备液），精密量取上述对照品贮备液各1ml，置同一20ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀（贮备液），精密量取1ml，置10ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀；
供试品（自研）溶液：精密量取样品1ml，置10ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀；
供试品（参比）溶液：精密量取样品1ml，置10ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀；
混合（自研）溶液：精密量取样品2ml、混合杂质对照品贮备液2ml，置同一20ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀；
混合（参比）溶液：精密量取样品2ml、混合杂质对照品贮备液2ml，置同一20ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
取上述各溶液，在初步确定的色谱条件下分别进样20μl，记录色谱图，见图4。
试验结果显示：
（1）空白溶液、空白辅料供试液在3min之前出峰，其在主成分峰及各杂质峰处无保留，不影响杂质的检出；
（2）供试品溶液，扣除空白辅料及溶剂峰后，主成分峰与相邻杂质峰之间、各杂质之间的分离度均大于1.5，各组分峰均为纯峰；
（3）混合溶液，扣除空白辅料及溶剂峰后，主成分峰与相邻杂质峰之间、各杂质之间的分离度均大于1.5。
以上结果说明该检测方法专属性好。
2.定量限、检测限
取甲硝唑、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G对照品适量，精密称定，分别加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含甲硝唑5μg、杂质A0.5μg、杂质B0.5μg、杂质C0.5μg、杂质D0.5μg、杂质E0.5μg、杂质F0.5μg、杂质G0.5μg的溶液，该溶液逐级稀释，当主峰的峰高与噪音比值S/N不小于10时，计算此时的浓度即为定量限浓度，当主峰的峰高与噪音比值S/N不小于3时，计算此时的浓度即为检测限浓度。照上述检测方法进样20μl，记录色谱图，实验结果见下表
表3：有关物质(杂质A，杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G)定量限及检测限试验结果
试验结果显示：6份定量限溶液重复进样，保留时间的RSD不大于2.0%，峰面积的RSD不大于10%；符合接受标准。
3.线性及范围
取甲硝唑、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G对照品适量，精密称定，分别加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含甲硝唑2.5μg、杂质A2.5μg、杂质B2.5μg、杂质C2.5μg、杂质D2.5μg、杂质E2.5μg、杂质F2.5μg、杂质G2.5μg的溶液，作为对照品贮备液。取对照品贮备液适量，配制定量限浓度溶液；精密量取对照品贮备液1、2、3、4、5、6、7、8ml，分别置于20ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取上述对照品溶液，分别进样20μl，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性回归方程，结果见下表：
表4：有关物质(杂质A，杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G)线性及范围试验结果
试验结果显示：
（1）各组分线性相关系数R均大于0.990；
（2）y轴截距在100%响应值的25%以内，响应值的相对标准偏差小于10%。
4.准确度
以对照品溶液浓度(0.5μg/ml)为100%，考察杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G浓度在定量限、100%、200%时，加样供试品溶液的回收率。
对照品贮备液：分别取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G对照品适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
定量限对照品贮备液：取对照品贮备液适量，按照定量限10倍浓度配制，即得。
供试品溶液：精密量取样品1ml，置10ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限加样供试品溶液（一式三份）：精密量取样品1ml、定量限对照品贮备液1ml，置同一10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
100%加样供试品溶液（一式三份）：精密量取样品1ml、对照品贮备液1ml，置同一10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
200%加样供试品溶液（一式三份）：精密量取样品1ml、对照品贮备液2ml，置同一10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
取上述供试品溶液，进样20μl，记录色谱图，按加校正因子（相对校正因子1.00）主成分自身对照法计算回收率及RSD，结果见表5
表5：有关物质(杂质A，杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G)准确度试验结果
试验结果显示：
（1）定量限浓度杂质回收率在70.0%～130.0%；
（2）除定量限外，杂质回收率在90.0%～108.0%，回收率的RSD不大于10%。
需要说明的是：
首先，本发明未做具体说明的均采用现有技术；其次：本发明公开实施例附图中，只涉及到与本公开实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计，在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：取样品适量，用15%甲醇定量稀释制成甲硝唑的溶液；
步骤二：以磷酸氢二钾-甲醇溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；
步骤三：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱仪，以紫外检测器为检测器对样品采用高效液相色谱法检测。
2.根据权利要求1所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：以0.01mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钾与甲醇的体积比85：15为流动相A。
3.根据权利要求2所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：所述磷酸氢二钾的pH值用磷酸调节至6.5。
4.根据权利要求3所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：步骤三中，高效液相色谱仪以ACE Excel C18-AR 5μm 250×4.6mm为色谱柱，以0.01mol/L、pH为6.5的磷酸氢二钾与甲醇的体积比85：15为流动相A，以甲醇为流动相B，按照下表程序进行梯度洗脱：
5.根据权利要求1所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：所用高效液相色谱仪检测方法如下：样品注入色谱仪的进样体积为20μl，检测波长为315nm。
6.根据权利要求1所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于：样品为供试品溶液、对照溶液、灵敏度溶液或***适用性溶液。
7.根据权利要求6所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）样品制备
供试品溶液的制备：取本品适量，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml中含甲硝唑0.5mg的溶液；
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
灵敏度溶液的制备：精密量取对照溶液5ml，置25ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
***适用性溶液的制备：取甲硝唑杂质A、B、C、D、E、F、G对照品适量，精密称定，加少量甲醇溶解后，用15%甲醇溶液定量稀释制成每1ml约含杂质A～G各5μg的混合溶液，精密量取5ml、样品5ml，置同一50ml量瓶中，用15%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；
2）采用所述高效液相色谱法检测条件对上述供试品溶液、对照溶液和***适用性溶液进行检测，对待测样品的有关物质的定性分析和定量分析。
8.根据权利要求7所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于，甲硝唑杂质A 为2-甲基-5硝基咪唑。
9.根据权利要求7所述的甲硝唑氯化钠注射液中有关物质的测定方法，其特征在于，步骤2）具体如下：取***适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，再精密量取供试品溶液和对照溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与杂质A～G相对保留时间一致的色谱峰，按加校正因子主成分自身对照法计算，峰面积与其相对校正因子的乘积不得大于对照溶液主峰面积的0.1%；其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.1%；杂质总量不得过0.5%；供试品溶液色谱图中与甲硝唑相对保留时间为0.22，之前的峰忽略不计。
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