CN112557546B - 一种橘红梨膏uplc指纹图谱及多成分含量的检测方法 - Google Patents

一种橘红梨膏uplc指纹图谱及多成分含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种橘红梨膏UPLC指纹图谱及多成分含量的检测方法。所述UPLC指纹图谱的检测方法包括如下步骤：精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；精密吸取所述供试品溶液，进行超高效液相色谱测定，获得所述橘红梨膏UPLC指纹图谱；其中，所述超高效液相色谱测定采用的流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱方式。本发明还提供一种能同时测定橘红梨膏多成分含量的检测方法。本发明方法准确可靠、专属性强、重复性好，能够快速、全面、有效、高效地控制产品质量。

Description

一种橘红梨膏UPLC指纹图谱及多成分含量的检测方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种橘红梨膏UPLC指纹图谱及多成分含量的检测方法。
背景技术
橘红梨膏是一种中药制剂，含梨、化橘红、枇杷叶、苦杏仁、五味子、川贝母、天冬和麦冬，具有养阴清肺与止咳化痰的作用，用于肺胃阴虚、口干咽燥以及久咳痰少。
目前，橘红梨膏执行部颁药品标准(中药成分制剂WS3-B-0666-91)，仅对橘红梨膏的相对密度、不溶物、装量及微生物限度进行要求，未涉及处方药材的检查，不能有效控制产品质量。在目前已公开的橘红梨膏质量研究中，采取的均为药材的薄层色谱鉴定方法(TLC)。余国禧对橘红梨膏中的化橘红、苦杏仁和五味子进行薄层鉴别，该方法需要分别制备三种供试品，并采用三种不同的薄层展开条件，此外该研究还提供了测定化橘红中柚皮苷单组份含量的方法(余国禧.橘红梨膏质量标准研究[J].中药材,2003(05):363-365.)。但橘红梨膏内在物质丰富，各成分性质差异较大，传统单一成分含量测定不足以说明产品整体质量。目前尚缺乏可以同时鉴别橘红梨膏中多种药材或同时测定橘红梨膏中多种成分含量的快速检测方法，难以有效控制产品的质量和临床疗效。
发明内容
基于此，有必要提供一种橘红梨膏的UPLC指纹图谱检测方法，可以快速鉴别橘红梨膏中多种原料药材，同时能够对多个指标成分进行含量测定，快速、全面、有效、高效地控制橘红梨膏的质量。
本发明通过如下技术方案实现：
一种橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取所述供试品溶液，进行超高效液相色谱测定，获得所述橘红梨膏UPLC指纹图谱；
其中，所述超高效液相色谱测定采用的流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱方式；
所述加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)；
所述溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液或体积分数为20～50％的乙醇水溶液；
所述溶剂B为甲醇或乙醇。
在其中一个实施例中，所述流动相A为含酸的乙腈；和/或所述流动相B为含酸的水；其中，所述流动相A和/或所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01～4％；
所述酸为乙酸或甲酸。
在其中一个实施例中，所述流动相A和/或所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01～0.5％；
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0～24min，流动相A的体积百分数由5％变化至90％。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0～11min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；11～24min，流动相A的体积百分数由20％变化至90％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.2～0.4ml/min；柱温为20～45℃；检测波长选择200～220nm、244～264nm或310～330nm。
在其中一个实施例中，所述检测波长为205～215nm、250～260nm或315～325nm。
本发明还提供一种橘红梨膏多成分含量的检测方法，包括如下步骤：
精密称取对照品，加入甲醇溶解，制备对照品溶液；所述对照品为柚皮苷、野漆树苷与五味子醇甲对照品中的至少一种；
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液，进行超高效液相色谱测定；
其中，所述超高效液相色谱测定采用的流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱方式。
在其中一个实施例中，所述加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)；
所述溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液或体积分数为20～50％的乙醇水溶液；
所述溶剂B为甲醇或乙醇。
在其中一个实施例中，所述流动相A为含酸的乙腈；和/或
所述流动相B为含酸的水；
其中，所述流动相A和/或所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01～4％；
所述酸为乙酸或甲酸。
在其中一个实施例中，所述流动相A和/或所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01～0.5％；
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0～24min，流动相A的体积百分数由5％变化至90％。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0～11min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；11～24min，流动相A的体积百分数由20％变化至90％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.2～0.4ml/min；柱温为20～45℃；检测波长为244～264nm或310～330nm。
在其中一个实施例中，所述检测波长为250～260nm或315～325nm。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明首次构建了橘红梨膏的UPLC指纹图谱，充分展示了橘红梨膏多种药材的化学成分特征，能够同时鉴别橘红梨膏中多种药材，又能同时测定多个指标成分含量，能够有效控制产品质量，而且很大程度上节约了检测时间和检测成本，与高效液相色谱法相比，超高效液相色谱法进一步缩短了检测时间。
附图说明
图1为不同供试品制备方法得到的供试品溶液UPLC谱图；
图2为不同流动相得到的320nm波长下UPLC图谱；
图3为不同流动相得到的254nm波长下UPLC图谱；
图4为不同流动相得到的210nm波长下UPLC图谱；
图5为橘红梨膏320nm波长下的UPLC指纹图谱；
图6为橘红梨膏254nm波长下的UPLC指纹图谱；
图7为橘红梨膏210nm波长下的UPLC指纹图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的橘红梨膏的UPLC指纹图谱及多成分含量检测方法作进一步详细的说明。
一种橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取供试品溶液，进行超高效液相色谱测定，获得橘红梨膏UPLC指纹图谱；
其中，超高效液相色谱测定采用的流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱方式。
流动相选择乙腈-水***，其出峰时间较短，同时能保留较多峰信息。
在其中一个具体的示例中，加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)；
溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液或体积分数为20～50％的乙醇水溶液；
溶剂B为甲醇或乙醇。
先用少量20～50％甲醇或乙醇稀释溶解样品，再加入甲醇或乙醇至一定浓度，既能有效除杂、保护检测设备，又能最大限度保留橘红梨膏的药材成分信息，可同时检出到枇杷叶、化橘红、五味子、苦杏仁的成分特征峰，且方法重复性好。此外，本方法与液液萃取相比，减少了有机试剂的使用，有利于环境保护，同时节省了检测成本。
在其中一个具体的示例中，溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液(溶剂A)的体积分数包括但不限于如下百分比：20％、30％、40％、45％、47％、48％、49％、50％。
在其中一个具体的示例中，溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)。具体地，溶剂A与供试品溶液的体积比包括但不限于1:2、1:3、1:3.5、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.5、1:5。
在其中一个具体的示例中，流动相A为含酸的乙腈；和/或
流动相B为含酸的水；
其中，流动相A和/或流动相B中酸的体积分数为0.01～4％。
专利的发明人尝试在流动相中加入一定比例的酸，发现峰形有明显的改善，流动相中酸体积分数为0.01％～4％均可得到橘红梨膏310～330nm下的UPLC指纹图谱。
在其中一个具体的示例中，流动相A或/和流动相B加入酸，使流动相中酸的体积分数为0.01～0.5％。具体地，流动相中酸的体积分数包括但不限于如下百分比：0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.3％、0.5％。
本专利的发明人通过调节流动相的体积分数，对图谱基线与相关色谱峰进行了进一步的改进，发现最佳酸浓度为0.01％～0.5％。
在其中一个具体的示例中，酸为乙酸或甲酸。
本专利的发明人筛选出加入甲酸或乙酸的流动相，能达到改善峰型、增加分离度的效果。
在其中一个具体的示例中，酸为乙酸。
在其中一个具体的示例中，梯度洗脱方式为：0～24min，流动相A的体积百分数由5％变化至95％。
在其中一个具体的示例中，梯度洗脱方式为：0～11min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；11～24min，流动相A的体积百分数由20％变化至90％。
在其中一个具体的示例中，超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相的流速为0.2～0.4ml/min；柱温为20～45℃；检测波长选择200～220nm、244～264nm或310～330nm。
当流动相的流速为0.1ml/min时，出峰时间非常慢，分离效果不佳，当流速为0.5ml/min时，***压力非常高，容易导致仪器损伤，不利于仪器使用和维护。本专利的发明人研究得到最佳流速为0.2～0.4ml/min。
在其中一个具体的示例中，流速为0.3～0.4ml/min。具体地，流动相的流速包括但不限于0.3ml/min、0.34ml/min、0.35ml/min、0.36ml/min、0.4ml/min。
采用二极管阵列检测器(PDA)进行全波长扫描，比较了190～400nm所得的UPLC图谱，结果在200～220nm、244～264nm与310～330nm波长检测时，其图谱中呈现较多的色谱峰，同时使各色谱峰分离度较好、出峰数目适中、峰形较好。
在其中一个具体的示例中，检测波长为205～215nm、250～260nm或315～325nm。
进一步地，检测波长为210nm、254nm或320nm。
在其中一个具体的示例中，柱温为20℃、30℃、35℃、40℃或45℃。
本专利的发明人考察了不同柱温条件下各色谱峰的分离情况，结果表明不同柱温下的色谱峰略有区别，但均可达到检测效果。
在其中一个具体的示例中，色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱、ACQUIT UPLC HSSC18柱、ACQUIT UPLC CSH C18柱、CORTECS UPLC C18柱或CORTECS UPLC C18+柱。
在其中一个具体的示例中，色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱、CORTECS UPLC C18柱或CORTECS UPLC C18+柱。
ACQUIT UPLC HSS T3柱与、CORTECS UPLC C18柱或CORTECS UPLC C18+柱对各色谱峰分离度较佳，峰形较好。
本发明还提供一种橘红梨膏多成分含量的检测方法，包括如下步骤：
精密称取对照品，加入甲醇溶解，制备对照品溶液；对照品为柚皮苷、野漆树苷与五味子醇甲对照品中的至少一种；
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取对照品溶液和供试品溶液，进行超高效液相色谱测定；
其中，超高效液相色谱测定采用的流动相A为乙腈，流动相B为水；采用梯度洗脱方式；
在其中一个具体的示例中，加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)；
溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液或体积分数为20～50％的乙醇水溶液；
溶剂B为甲醇或乙醇。
在其中一个具体的示例中，溶剂A为体积分数为20～50％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液(溶剂A)的体积分数包括但不限于如下百分比：20％、30％、40％、45％、47％、48％、49％、50％。
在其中一个具体的示例中，溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2～5)。具体地，溶剂A与供试品溶液的体积比包括但不限于1:2、1:3、1:3.5、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.5、1:5。
在其中一个具体的示例中，流动相A为含酸的乙腈；和/或
流动相B为含酸的水；
其中，流动相A和/或流动相B中酸的体积分数为0.01～4％。
在其中一个具体的示例中，流动相A和/或流动相B中酸的体积分数为0.01～0.5％。具体地，流动相中酸的体积分数包括但不限于如下百分比：0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.3％、0.5％。
在其中一个具体的示例中，酸为乙酸或甲酸。
在其中一个具体的示例中，酸为乙酸。
在其中一个具体的示例中，梯度洗脱方式为：0～24min，流动相A的体积百分数由5％变化至90％。
在其中一个具体的示例中，梯度洗脱方式为：0～11min，流动相A的体积百分数由5％变化至20％；11～24min，流动相A的体积百分数由20％变化至90％。
在其中一个具体的示例中，超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相的流速为0.2～0.4ml/min；柱温为20～45℃；检测波长为244～264nm或310～330nm。
在其中一个具体的示例中，流速为0.3～0.4ml/min。具体地，流动相的流速包括但不限于0.3ml/min、0.34ml/min、0.35ml/min、0.36ml/min、0.4ml/min。
在其中一个具体的示例中，检测波长为250～260nm或315～325nm。
在其中一个具体的示例中，检测波长为254nm或320nm。
在其中一个具体的示例中，色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱、ACQUIT UPLC HSSC18柱、ACQUIT UPLC CSH C18柱、CORTECS UPLC C18柱或CORTECS UPLC C18+柱。
在其中一个具体的示例中，色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱、CORTECS UPLC C18柱或CORTECS UPLC C18+柱。
以下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的原料均为市售产品。
实施例1橘红梨膏的UPLC指纹图谱的检测方法
本实施例提供一种橘红梨膏的UPLC指纹图谱的检测方法。
1仪器与试剂
1.1仪器
超高效液相色谱仪为Waters Acquity H-Class UPLC***，色谱柱为C18(2.1mm×100mm，1.8μm)柱。
1.2试剂
乙腈、甲醇、甲酸与乙酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。
1.3试药
10批橘红梨膏由广州市香雪制药股份有限公司旗下化州中药厂生产。
2方法与结果
2.1供试品溶液的制备
精密称取橘红梨膏2.5g，加入50％甲醇2.5ml，振摇，使橘红梨膏充分溶解，逐渐加入甲醇，定容至10ml，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
2.2测定方法
精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，得到橘红梨膏的UPLC指纹图谱；
色谱条件为：色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：乙腈为流动相A，体积分数为0.05％的乙酸水溶液为流动相B，根据表1洗脱方式进行洗脱，流速为0.35ml/min；检测波长为210nm、254nm或320nm；柱温为30℃。
表1流动相梯度洗脱方式
Figure BDA0002845397820000111
注：指纹图谱已于0～24min全部出峰，24～26min的目的是将流动相回归至初始比例，方便下一个样品进样。
另外，本实施例对实验条件进行了筛选：
(1)供试品溶液制备方法优化
因橘红梨膏含糖量高、样品非常粘稠，其目标成分可溶于有机溶剂，但橘红梨膏样品不溶于有机溶剂，如果直接用有机溶剂提取，样品会粘附瓶壁，出现溶解不完全、实验重复性差的问题。如果用水或低浓度有机溶剂溶解，可解决实验重复性差的问题，但又会导致供试品净化不足，污染仪器设备和色谱柱，影响仪器和色谱柱使用寿命。
另一方面，橘红梨膏中枇杷叶、化橘红、五味子、苦杏仁等药材所含成分差异较大，如果样品处理不当，会导致成分损失，无法被检出。
本专利发明人通过大量试验，研究考察了有机溶剂萃取法(乙酸乙酯、三氯甲烷、水饱和正丁醇)、大孔树脂吸附法、有机溶剂溶解法(甲醇、乙醇)等多种不同供试品制备方法，不同方法制备得到的供试品溶液UPLC谱图如图1所示。结果发现先用少量20～50％甲醇或乙醇稀释溶解样品，再加入甲醇或乙醇至一定浓度，既能有效除杂、保护检测设备，又能最大限度保留橘红梨膏的药材成分信息，可同时检出到枇杷叶、化橘红、五味子、苦杏仁的成分特征峰，且方法重复性好。
进一步地，甲醇溶解得到的橘红梨膏供试品成分信息最丰富，且各成分不受溶剂干扰。
(2)流动相的选择
首先考察了甲醇-水、乙腈-水***对成分分离的影响，乙腈-水***出峰时间较甲醇-水***短，同时能保留较多峰信息，因此选择乙腈-水***进行进一步的条件优化。
为了改善峰形、增加分离度，本专利的发明人尝试在水相中加入一定比例的酸，发现峰形有明显的改善。如图2所示，酸的种类和加入量对320nm下的UPLC指纹图谱影响较小，流动相酸加入量为体积分数0.01％～4％时，均可得到橘红梨膏320nm下的UPLC指纹图谱；酸的加入量对254nm下图谱基线稍有影响，如图3所示，当酸加入量大于0.5％，图谱基线不稳定，但可达到检测效果；酸加入量对210nm下图谱有影响，如图4所示，当酸加入量大于0.5％时，210nm下基线噪音较大，检测效果不佳。因此最佳酸浓度为0.01％～0.5％。经筛选，甲酸与乙酸在0.01～0.5％范围内，均可达到改善分离的效果。
(3)洗脱梯度的选择
对UPLC洗脱梯度进行摸索，得到最佳分离梯度，使橘红梨膏UPLC色谱图峰信息丰富、各峰分离度、峰形良好。
(4)流速的选择
在UPLC研究中发现，当流速为0.1ml/min时，出峰时间非常慢，分离效果不佳，当流速为0.5ml/min时，***压力非常高，容易导致仪器损伤，不利于仪器使用和维护。因此，最佳流速为0.2～0.4ml/min。
(5)检测波长的选择
采用二极管阵列检测器(PDA)进行全波长扫描，比较了190～400nm所得的UPLC图谱，结果在210nm、254nm或320nm波长检测时，其图谱中呈现较多的色谱峰，同时使各色谱峰分离度较好、出峰数目适中、峰形较好，故确定210nm、254nm或320nm处波长为指纹图谱检测波长。
(6)色谱柱的考察
考察了ACQUIT UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)、ACQUIT UPLC HSS C18(2.1mm×100mm，1.8μm)、ACQUIT UPLC CSH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)、CORTECS UPLC C18(2.1mm×100mm，1.6μm)、CORTECS UPLC C18+(2.1mm×100mm，1.6μm)这5种不同型号的色谱柱，其中ACQUIT UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)、CORTECS UPLC C18(2.1mm×100mm，1.6μm)和CORTECS UPLC C18+(2.1mm×100mm，1.6μm)柱对各色谱峰分离度较佳，峰形较好。
(7)柱温的选择
实验中考察了20℃、30℃、35℃、40℃、45℃柱温条件下，各色谱峰的分离情况，结果表明，不同柱温下图谱差别不大，出峰时间略有区别，但均可达到检测效果。
采用上述方法建立UPLC指纹图谱，将10批橘红梨膏的指纹图谱测定数据导入国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，用平均数的方法生成指纹图谱共有模式，并以此共有模式为橘红梨膏标准指纹图谱。
橘红梨膏指纹图谱采用三个波长，其中320nm下有8个共有特征峰(如图5所示)，254nm下有8个共有特征峰(如图6所示)，210nm下有6个特征峰(如图7所示)。
在320nm下标定8个共有峰，非共有峰面积与总面积比小于10％，具体如表2所示：
表2橘红梨膏指纹图谱320nm下共有峰
编号 出峰时间相对保留值
1 0.375
2 0.398
3 0.433
4 0.611
5(柚皮苷) 1.000
6(野漆树苷) 1.026
7 1.198
8 1.612
在254nm下标定8个共有峰，非共有峰面积与总面积比小于10％，具体如表3所示，由于10.8min和18.0min两个色谱峰为防腐剂辅料峰，不纳入总峰面积。
表3橘红梨膏指纹图谱254nm下共有峰
Figure BDA0002845397820000141
Figure BDA0002845397820000151
在210nm下标定6个共有峰，非共有峰面积与总面积比小于10％，具体如表4所示，由于10.8min和18.0min两个色谱峰为防腐剂辅料峰，不纳入总峰面积。
表4橘红梨膏指纹图谱210nm下共有峰
编号 出峰时间相对保留值
1 0.463
2 0.471
3(柚皮苷) 1.000
4(野漆树苷) 1.026
5 1.198
6 1.263
2.3指纹图谱的方法验证
对指纹图谱检测方法的精密度、稳定性、重复性进行考察，结果证明，精密度、稳定性、重复性良好，满足指纹图谱的要求。
(1)精密度试验
取同一供试品溶液，连续进样6次，得到指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2012年版》进行评价，结果如表5所示，供试品溶液在320nm、254nm和210nm下相似度等于1.000，仪器精密度良好。
表5指纹图谱精密度试验结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 对照指纹图谱
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
(2)稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0h，3h，6h，12h，24h，48h进样，得到指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2012年版》进行评价，结果如表6所示，供试品溶液在320nm、254nm和210nm下相似度等于1.000，供试品溶液在放置48h内稳定性良好。
表6指纹图谱稳定性试验结果
Figure BDA0002845397820000161
Figure BDA0002845397820000171
(3)重复性试验
取同一批号样品，按照供试品的制备方法，制得6份供试品并进行检测，得到指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2012年版》进行评价，结果如表7所示，供试品溶液在320nm、254nm和210nm下相似度等于1.000，方法重复性良好。
表7指纹图谱重复性试验结果
Figure BDA0002845397820000172
实施例2橘红梨膏多成分含量检测方法
本实施例提供一种橘红梨膏多成分含量检测方法，具体如下：
1仪器与试剂
1.1仪器
超高效液相色谱仪为Waters Acquity H-Class UPLC***，色谱柱为C18(2.1mm×100mm，1.8μm)柱。
1.2试剂
乙腈、甲醇、甲酸、乙酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。
1.3试药
对照品：柚皮苷、野漆树苷、五味子醇甲对照品购自中国食品药品检定研究院。
样品：10批橘红梨膏由广州市香雪制药股份有限公司旗下化州中药厂生产。
2方法与结果
2.1对照品溶液制备
精密称取柚皮苷、野漆树苷、五味子醇甲对照品，加甲醇溶解，制备对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
精密称取橘红梨膏2.5g，加入50％甲醇2.5ml，振摇，使橘红梨膏充分溶解，逐渐加入甲醇，定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3测定方法
精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定；
色谱条件为：色谱柱为ACQUIT UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：体积分数为0.05％的乙酸乙腈为流动相A，体积分数为0.05％的乙酸水溶液为流动相B，根据表1洗脱方式进行洗脱，流速为0.35ml/min；检测波长为254nm和320nm；柱温为30℃。
2.4含量测定的方法学验证
对该含量测定检测方法进行方法学验证，结果证明，方法的准确度、重复性、中间精密度、专属性、耐用性、线性良好，满足含量测定的要求。
(1)准确度试验
精密称取同一批已知含量的橘红梨膏，平行6份，分别精密加入一定量的混合对照品溶液，按“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的加样回收率及RSD，结果如表8所示，柚皮苷、野漆树苷、五味子醇甲的加样回收率均在95.0～105.0％，RSD均小于1.0％，表明方法准确度良好。
表8含量测定准确度试验结果
Figure BDA0002845397820000191
(2)重复性试验
取同一批号样品，按照供试品的制备方法，制得6份供试品，按检测方法进行测定，记录各峰的保留时间和峰面积，结果如表9所示，各峰保留时间及含量RSD值均小于2.0％，该方法重复性良好。
表9含量测定重复性试验结果
Figure BDA0002845397820000201
(3)中间精密度试验
对不同分析时间、不同分析人员、不同分析仪器的中间精密度进行考察，结果显示该方法中间精密度良好。
取同一批号样品，选择三个不同分析时间，按照供试品溶液制备方法，制得供试品溶液，按检测方法进行测定，记录各峰的保留时间和峰面积，结果如表10所示，不同时间下，各峰保留时间及含量RSD值均小于2.0％。
表10含量测定的不同分析时间中间精密度试验结果
Figure BDA0002845397820000202
Figure BDA0002845397820000211
取同一批号样品，由三个分析人员，按照供试品溶液制备方法，制得供试品溶液，按检测方法进行测定，记录各峰的保留时间和峰面积，结果如表11所示，不同分析人员制得的供试品各峰保留时间及含量RSD值均小于2.0％。
表11含量测定的不同人员中间精密度试验结果
Figure BDA0002845397820000212
取同一批号样品，按照供试品制备方法制得供试品，在三台不同仪器设备，按检测方法进行测定，记录各峰的保留时间和峰面积，结果如表12所示，不同设备中，各峰保留时间及含量RSD值均小于2.0％。
表12含量测定的不同仪器中间精密度试验结果
Figure BDA0002845397820000213
(4)专属性试验
分别取缺化橘红阴性样品、缺五味子阴性样品按供试品制备方法制得对应阴性对照溶液，取橘红梨膏供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，得到液相图谱，结果表明，橘红梨膏供试品溶液在野漆树苷、柚皮苷、五味子醇甲的相应位置有相应色谱峰且阴性无干扰。
(5)线性及范围
精密吸取各混标溶液1μl，注入超高效液相色谱仪，以浓度对峰面积进行处理，得到标准曲线见表13，各对照品浓度范围内线性关系良好。
表13含量测定的线性与范围试验结果
物质 曲线 r<sup>2</sup>值 范围(μg/ml)
柚皮苷 y＝954.29x+1403.5 1.0000 29.872～1493.610
野漆树苷 y＝5967x+3.812 1.0000 1.006～50.300
五味子醇甲 y＝5925.8x+1192.4 0.9999 1.022～51.086
(6)稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0h，3h，6h，12h，24h，48h按检测方法进行测定，记录各峰的保留时间和峰面积，结果如表14所示，各峰保留时间及含量RSD值均小于2.0％，该方法稳定性良好。
表14含量测定的溶液稳定性(耐用性)试验结果
Figure BDA0002845397820000221
Figure BDA0002845397820000231
2.5多批次测定结果
取10批橘红梨膏，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按检测方法进行测定，用外标法计算样品中多种成分的含量，10批橘红梨膏平均含量如表15所示。
表15多批次橘红梨膏测定结果
Figure BDA0002845397820000232
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取所述供试品溶液，进行超高效液相色谱测定，获得所述橘红梨膏UPLC指纹图谱；
其中，所述超高效液相色谱测定采用的流动相A为含酸的乙腈，流动相B为含酸的水；所述流动相A中所述酸的体积分数为0.01~0.5%；所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01~0.5%；所述酸为乙酸或甲酸；采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0~8min，流动相A的体积百分数从95%变化至83%；8~11min，流动相A的体积百分数从83%变化至80%；11~13min，流动相A的体积百分数从80%变化至79.6%；13~16min，流动相A的体积百分数从79.6%变化至73.6%；16~19min，流动相A的体积百分数从73.6%变化至61.6%；19~23.5min，流动相A的体积百分数从61.6%变化至10%；23.5~24min，流动相A的体积百分数保持为10%；24~26min，流动相A的体积百分数从10%变化至95%；
所述超高效液相色谱测定采用的色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.2~0.4ml/min；
所述加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2~5)；
所述溶剂A为体积分数为20~50%的甲醇水溶液或体积分数为20~50%的乙醇水溶液；
所述溶剂B为甲醇或乙醇。
2.根据权利要求1所述的橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱测定的条件为：柱温为20~45℃；检测波长选择200~220nm、244~264nm或310~330nm。
3.根据权利要求1所述的橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述流动相A中所述酸的体积分数为0.01~0.3%。
4.根据权利要求1所述的橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01~0.3%。
5.根据权利要求1所述的橘红梨膏UPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2~4)。
6.一种橘红梨膏多成分含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
精密称取对照品，加入甲醇溶解，制备对照品溶液；所述对照品为柚皮苷、野漆树苷与五味子醇甲对照品；
精密称取橘红梨膏，加入有机溶剂，过滤，取续滤液，制备供试品溶液；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液，进行超高效液相色谱测定；
其中，所述超高效液相色谱测定采用的流动相A为含酸的乙腈，流动相B为含酸的水；所述流动相A中所述酸的体积分数为0.01~0.5%；所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01~0.5%；所述酸为乙酸或甲酸；采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0~8min，流动相A的体积百分数从95%变化至83%；8~11min，流动相A的体积百分数从83%变化至80%；11~13min，流动相A的体积百分数从80%变化至79.6%；13~16min，流动相A的体积百分数从79.6%变化至73.6%；16~19min，流动相A的体积百分数从73.6%变化至61.6%；19~23.5min，流动相A的体积百分数从61.6%变化至10%；23.5~24min，流动相A的体积百分数保持为10%；24~26min，流动相A的体积百分数从10%变化至95%；
所述超高效液相色谱测定采用的色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为0.2~0.4ml/min；
所述加入有机溶剂包括如下步骤：先加入溶剂A，再加入溶剂B；
所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2~5)；
所述溶剂A为体积分数为20~50%的甲醇水溶液或体积分数为20~50%的乙醇水溶液；
所述溶剂B为甲醇或乙醇。
7.根据权利要求6所述的橘红梨膏多成分含量的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱测定的条件为：柱温为20~45℃；检测波长为244~264nm或310~330nm。
8.根据权利要求6所述的橘红梨膏多成分含量的检测方法，其特征在于，所述流动相A中所述酸的体积分数为0.01~0.3%。
9.根据权利要求6所述的橘红梨膏多成分含量的检测方法，其特征在于，所述流动相B中所述酸的体积分数为0.01~0.3%。
10.根据权利要求6所述的橘红梨膏多成分含量的检测方法，其特征在于，所述溶剂A与供试品溶液的体积比为1:(2~4)。
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