CN112538438B - 一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，属于生物工程领域。所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ‑9株，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020707。本发明解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ‑9株敲除了油酸去饱和酶，过表达了内源乙酰辅酶A羧化酶、二酰甘油酰基转移酶和脂肪酸延长酶1，并且过表达了异源脂肪酸延长酶2和硬脂酰辅酶A去饱和酶，实验证明该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产油酸，实现了植物来源天然产物油酸在解脂耶氏酵母中的高效合成。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术
油酸(Oleic acid,C18H34O2)，学名：顺式-9-十八碳烯酸，是一种Omega-9型单不饱和脂肪酸，主要存在于甘蓝型油菜(Brassica napus)、山茶(Camellia japonica)等油料作物中。在医药领域，油酸具有调节生理功能的作用，能够选择性地调节人体血液中的高密度和低密度胆固醇，降低患心血管疾病的风险。此外，油酸对癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病有良好的辅助治疗作用。在能源领域，油酸由于其低温流动性和氧化稳定性而成为出色的生物柴油成分。在材料领域，通过多酶协同催化可将油酸转化为不同链长的二元醇、二元酸、二元胺、ω-氨基脂肪酸、ω-羟基脂肪酸等脂肪酸衍生物，它们可以作为单体合成聚酯、聚酰胺等系列聚合物，用于生产塑料、润滑油、表面活性剂、增塑剂、香料、涂料、燃料等产品。
油酸的传统来源是从油料作物，如甘蓝型油菜、山茶中提取而得。但是，植物提取法需要大面积种植且生长周期长，还易受产地、气候等影响。相比植物提取法而言，微生物发酵法生长周期短且可全天候生产、同时产油微生物含油量高且生物量大，因此用产油微生物来生产油酸是一种经济高效的方式。现有技术中，缺乏能够高效生产油酸的微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效合成油酸的重组解脂耶氏酵母菌。
本发明再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产油酸中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020707。
在本发明中，所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株是在解脂耶氏酵母基因组中敲除油酸去饱和酶，***乙酰辅酶A羧化酶表达盒、二酰甘油酰基转移酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、脂肪酸延长酶2表达盒和硬脂酰辅酶A去饱和酶表达盒后得到的。
在本发明中，所述乙酰辅酶A羧化酶、二酰甘油酰基转移酶、脂肪酸延长酶1编码基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；脂肪酸延长酶2编码基因是将来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)的脂肪酸延长酶2编码基因经密码子优化后所得；硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因是将来源于杆锈菌(Puccinia graminis)的硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因经密码子优化后所得。
在本发明中，所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子PTEF、Php4d、PTEFin、PYAT1、PFBA、PFBAin、PPOX2、PPOT1或PGPD中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子Txpr2t、Tmig1t、Tlip2t、Tcyc1t、Tpex3t、Tpex10t或Tpex20t中的任意一种。
在本发明中，所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的A08位点、26s rDNA位点、IntA位点、IntB位点、IntC位点、IntD位点、IntE位点、IntF位点、lip1位点、SCP2位点、或YlSCD位点中的任意一种。
在本发明中，所述硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因序列如SEQ ID No.1所示；所述脂肪酸延长酶2编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将油酸去饱和酶敲除盒、乙酰辅酶A羧化酶表达盒、二酰甘油酰基转移酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、脂肪酸延长酶2表达盒和硬脂酰辅酶A去饱和酶表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。
在本发明中，所述解脂耶氏酵母敲除了ku70基因。
本发明还提供所述重组菌在生产油酸中的应用，包括采用发酵培养基培养所述重组菌，得到发酵产物的步骤。
在本发明中，所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/L，无氨基酵母氮源1.6-1.8g/L，硫酸铵1.2-1.4g/L。
有益效果：本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株，是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株敲除了油酸去饱和酶，过表达了内源乙酰辅酶A羧化酶、二酰甘油酰基转移酶和脂肪酸延长酶1，并且过表达了异源脂肪酸延长酶2和硬脂酰辅酶A去饱和酶，实验证明该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产油酸，实现了植物来源天然产物油酸在解脂耶氏酵母中的高效合成。
附图说明
图1是重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1的结构图，其中IntC-up表示IntC位点上游同源臂，IntC-dm表示IntC位点下游同源臂，hp4d表示启动子Php4d，mig1t表示终止子Tmig1t，TEFin表示启动子PTEFin，lip2t表示终止子Tlip2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)，ACC1为乙酰辅酶A羧化酶编码基因，DGA1为二酰甘油酰基转移酶编码基因。
图2是重组质粒pUC-HUH-Fad2的结构图，其中Fad2-up表示Fad2位点上游同源臂，Fad2-dm表示Fad2位点下游同源臂，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)。
图3是重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD的结构图,其中YlSCD-up表示YlSCD位点上游同源臂，YlSCD-dm表示YlSCD位点下游同源臂，cyc1t表示终止子Tcyc1t，TEFin表示启动子PTEFin，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)，PgSCD为硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因。
图4是重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD的结构图，其中lip1-up表示lip1位点上游同源臂，lip1-dm表示lip1位点下游同源臂，cyc1t表示终止子Tcyc1t，YAT1表示启动子PYAT1，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)，PgSCD为硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因。
图5是重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1的结构图，其中SCP2-up表示SCP2位点上游同源臂，SCP2-dm表示SCP2位点下游同源臂，GPD表示启动子PGPD，pex20t表示终止子Tpex20t，FBA表示启动子PFBA，pex10t表示终止子Tpex10t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)，MaELO2为脂肪酸延长酶2编码基因，YlELO1为脂肪酸延长酶1编码基因。
图6显示Yarrowia lipolytica XJ-9株(重组菌5)生产油酸的GC检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f，购于美国菌种保藏中心，编号为ATCCMYA-2613。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1fΔku70(MatA,Δku70::hisG,leu2-270,ura3-302,xpr2-322,axp1-2)，缩写为Yarrowia lipolytica Po1fΔku70。Yarrowialipolytica Po1fΔku70由解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f敲除了负责非同源重组的编码基因ku70后构建得到(公开于Kretzschmar A,et al.,Current Genetics,2013,59(1-2):63-72)。
IntC位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体C上IntC位点起始密码子上游大小为1402bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1396bp的序列(下游同源臂)***pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在IntC位点上、下游同源臂之间。
Fad2位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体B上Fad2位点起始密码子上游大小为1539bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1503bp的序列(下游同源臂)***pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在Fad2位点上、下游同源臂之间。
YlSCD位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体C上YlSCD位点起始密码子上游大小为1529bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1496bp的序列(下游同源臂)***pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在YlSCD位点上、下游同源臂之间。
lip1位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体E上的lip1位点起始密码子上游大小为1458bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1438bp的序列(下游同源臂)***pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在lip1位点上、下游同源臂之间。
SCP2位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体E上的SCP2位点起始密码子上游大小为1523bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1524bp的序列(下游同源臂)***pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在SCP2位点上、下游同源臂之间。
实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
根据NCBI上提供的来自杆锈菌(Puccinia graminis)的硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因(GenBank登录号：NW_003526568.1)的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因PgSCD(SEQ ID No:1)，并***质粒pUC57中，得到质粒pUC57-PgSCD。
根据NCBI上提供的来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的脂肪酸延长酶2编码基因(GenBank登录号：AB468587.1)的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的脂肪酸延长酶2编码基因MaELO2(SEQ ID No：2)，并***质粒pUC57中，得到质粒pUC57-MaELO2。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因ura的核苷酸序列(GenBank登录号：AJ306421.1)和hisG标签(GenBank登录号：AF324729.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，将两个hisG标签编码基因序列***质粒pUC57中，在两个hisG标签编码基因序列之间***乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(由Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因ura和终止子Txpr2t组成)，以便实现ura标记回收，得到质粒pUC57-hisG-ura-hisG。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC::ACC1-F和IntC::ACC1-R为引物扩增乙酰辅酶A羧化酶编码基因ACC1(GenBank登录号：YALI0C11407g)。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC::DGA1-F和IntC::DGA1-R为引物扩增二酰甘油酰基转移酶编码基因DGA1(GenBank登录号：YALI0E32769g)。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以SCP2::YlELO1-F和SCP2::YlELO1-R为引物扩增脂肪酸延长酶1编码基因YlELO1(GenBank登录号：YALI0F06754g)。
Yarrowia lipolytica内源的启动子Php4d的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；Yarrowialipolytica内源的启动子PYAT1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；Yarrowia lipolytica内源的启动子PFBA的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；Yarrowia lipolytica内源的启动子PGPD的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；Yarrowia lipolytica内源的终止子Tmig1t的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；Yarrowia lipolytica内源的终止子Tlip2t的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示；Yarrowia lipolytica内源的终止子Tcyc1t的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；Yarrowia lipolytica内源的终止子Tpex10t的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；Yarrowialipolytica内源的终止子Tpex20t核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；Yarrowia lipolytica内源的终止子Txpr2t核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
(二)重组质粒的构建
重组质粒的结构见表1和图1-5；构建重组质粒所用引物见表2。
1、重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1的构建
重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，***了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中IntC位点起始密码子上游同源臂IntC-up和终止密码子下游同源臂IntC-dm，在该上下游同源臂之间还***了ACC1基因表达盒(Php4d-ACC1-Tmig1t)和DGA1基因表达盒(PTEFin-DGA1-Tlip2t)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间，具体结构见图1。
以IntC::Php4d-F和IntC::Php4d-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ACC1表达盒启动子Php4d。以IntC::Tmig1t-F和IntC::Tmig1t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ACC1表达盒终止子Tmig1t。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC::ACC1-F和IntC::ACC1-R为引物，扩增两端分别带有启动子Php4d和终止子Tmig1t同源臂的ACC1基因。
以IntC::PTEFin-F和IntC::PTEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1f Δku70基因组DNA为模板，扩增DGA1表达盒启动子PTEFin。以IntC::Tlip2t-F和IntC::Tlip2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1f Δku70基因组DNA为模板，扩增DGA1表达盒终止子Tlip2t。
以Yarrowia lipolytica Po1f Δku70基因组DNA为模板，以IntC::DGA1-F和IntC::DGA1-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Tlip2t同源臂的DGA1基因。
上述PCR扩增体系如下：
| 组分 | 体积 |
| PrimerSTAR Max Premix | 25ul |
| 模板 | 1ul |
| 引物1 | 2ul |
| 引物2 | 2ul |
| 蒸馏水 | 20ul |
其中，PrimerSTAR Max Premix购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
上述PCR的程序如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复30个循环。
用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(购自上海百赛生物技术股份有限公司)纯化回收各片段。
将IntC位点整合质粒通过用NEB公司的限制性内切酶PacⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化的IntC位点整合质粒。
将线性化IntC位点整合质粒和本实施例标题1构建的ACC1基因表达盒中的各元件(启动子Php4d、基因ACC1和终止子Tmig1t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，将ACC1基因表达盒***到IntC位点整合质粒的上下游同源臂之间，且两个hisG标签编码基因处于ACC1基因表达盒的同一侧。反应体系见下表。将反应体系在37℃孵育30min后，得到环状的重组载体。
一步克隆的体系如下表：
| 组分 | 体积 |
| 5×CE MultiS Buffer | 4ul |
| Exnase MultiS | 2ul |
| 线性化载体 | xng |
| ***片段 | yng |
| 蒸馏水 | 补足体积至10ul |
其中，线性化载体(x)、***片段(y)的使用量可由下面公式计算获得：每片段或线性化载体的最适使用量＝[0.02×片段或线性化载体的碱基对数]ng。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1。
用NEB公司的限制性内切酶KpnⅠ对质粒pUC-HUH-IntC-ACC1进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-IntC-ACC1质粒。
将线性化pUC-HUH-IntC-ACC1质粒和本实施例标题1构建的DGA1基因表达盒中的各元件(启动子PTEFin、基因DGA1和终止子Tlip2t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1。
2、重组质粒pUC-HUH-Fad2的构建
重组质粒pUC-HUH-Fad2是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，***了Yarrowialipolytica Po1f Δku70中Fad2位点起始密码子上游大小为1539bp的同源臂(Fad2-up)和终止密码子下游大小为1503bp的同源臂(Fad2-dm)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间，具体结构见图2。
以Fad2-up-F和Fad2-up-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1f Δku70基因组DNA为模板，扩增Fad2位点起始密码子上游同源臂Fad2-up。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pUC57-hisG-ura-hisG进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒。
将线性化pUC57-hisG-ura-hisG质粒和本实施例标题2构建的Fad2位点起始密码子上游同源臂Fad2-up(两端带有pUC57-hisG-ura-hisG同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的
II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到环状的重组载体。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pUC-HUH-Fad2-up。
以Fad2-dm-F和Fad2-dm-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增Fad2位点终止密码子下游同源臂Fad2-dm。
用NEB公司的限制性内切酶HindⅢ对质粒pUC-HUH-Fad2-up进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-Fad2-up质粒。
将线性化pUC-HUH-Fad2-up质粒和本实施例标题2构建的Fad2位点终止密码子下游同源臂Fad2-dm(两端带有pUC-HUH-Fad2-up同源臂序列)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的
II One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-Fad2。
3、重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD的构建
重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，***了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中YlSCD位点起始密码子上游同源臂YlSCD-up和终止密码子下游同源臂YlSCD-dm，在该上下游同源臂之间还***了PgSCD基因表达盒(PTEFin-PgSCD-Tcyc1t)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间，具体结构见图3。
以YlSCD::PTEFin-F和YlSCD::PTEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增PgSCD表达盒启动子PTEFin。以YlSCD::Tcyc1t-F和YlSCD::Tcyc1t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增PgSCD表达盒终止子Tcyc1t。
以质粒pUC57-PgSCD为模板，以YlSCD::PgSCD-F和YlSCD::PgSCD-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Tcyc1t同源臂的PgSCD基因。
用NEB公司的限制性内切酶HindIII对YlSCD位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化YlSCD位点整合质粒。
将线性化YlSCD位点整合质粒和本实施例标题3构建的PgSCD基因表达盒中的各元件(启动子PTEFin、基因PgSCD和终止子Tcyc1t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD。
4、重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD的构建
重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，***了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中lip1位点起始密码子上游同源臂lip1-up和终止密码子下游同源臂lip1-dm，在该上下游同源臂之间还***了PgSCD基因表达盒(PYAT1-PgSCD-Tcyc1t)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间，具体结构见图4。
以lip1::PYAT1-F和lip1::PYAT1-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增PgSCD表达盒启动子PYAT1。以lip1::Tcyc1t-F和lip1::Tcyc1t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增PgSCD表达盒终止子Tcyc1t。
以质粒pUC57-PgSCD为模板，以lip1::PgSCD-F和lip1::PgSCD-R为引物，扩增两端分别带有启动子PYAT1和终止子Tcyc1t同源臂的PgSCD基因。
用NEB公司的限制性内切酶PacⅠ对lip1位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化lip1位点整合质粒。
将线性化lip1位点整合质粒和本实施例标题4构建的PgSCD基因表达盒中的各元件(启动子PYAT1、基因PgSCD和终止子Tcyc1t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD。
5、重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1的构建
重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，***了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中SCP2位点起始密码子上游同源臂SCP2-up和终止密码子下游同源臂SCP2-dm，在该上下游同源臂之间***了MaELO2基因表达盒(PFBA-MaELO2-Tpex10t)和YlELO1基因表达盒(PGPD-YlELO1-Tpex20t)，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(包含Yarrowia lipolytica内源的启动子PTEFin、终止子Txpr2t)也在上下游同源臂之间，具体结构见图5。
以SCP2::PFBA-F和SCP2::PFBA-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增MaELO2表达盒启动子PFBA。以SCP2::Tpex10t-F和SCP2::Tpex10t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增MaELO2表达盒终止子Tpex10t。
以质粒pUC57-MaELO2为模板，以SCP2::MaELO2-F和SCP2::MaELO2-R为引物，扩增两端分别带有启动子PFBA和终止子Tpex10t同源臂的MaELO2基因。
以SCP2::PGPD-F和SCP2::PGPD-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增YlELO1表达盒启动子PGPD。以SCP2::Tpex20t-F和SCP2::Tpex20t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增YlELO1表达盒终止子Tpex20t。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以SCP2::YlELO1-F和SCP2::YlELO1-R为引物，扩增两端分别带有启动子PGPD和终止子Tpex20t同源臂的YlELO1基因。
用NEB公司的限制性内切酶HindIII对SCP2位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化SCP2位点整合质粒。
将线性化SCP2位点整合质粒和本实施例标题5构建的MaELO2基因表达盒中的各元件(启动子PFBA、基因MaELO2和终止子Tpex10t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2。
用NEB公司的限制性内切酶HindIII对重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化pUC-HUH-SCP2-MaELO2重组质粒。
将线性化pUC-HUH-SCP2-MaELO2重组质粒和本实施例标题5构建的YlELO1基因表达盒中的各元件(启动子PGPD、基因YlELO1和终止子Tpex20t)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1。
表1各重组质粒中***序列
表2引物序列
实施例2、重组解脂耶氏酵母菌的构建(一)重组菌1的构建
将含有ACC1和DGA1基因表达盒的质粒pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1导入Yarrowialipolytica Po1fΔku70中，ACC1和DGA1表达盒整合到基因组IntC位点处，然后在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，得到重组菌1。
具体方法如下：
①Yarrowia lipolytica Po1fΔku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将pUC-HUH-IntC-ACC1-DGA1转化Yarrowia lipolytica Po1fΔku70感受态细胞，进行同源重组。
③采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酵母氮源，购自BBI Life Sciences)6.7g/L，CSM-Ura(完全补充混合物除去尿嘧啶，购自MP Biomedicals)0.67g/L，琼脂粉23g/L。
④将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板(含有：5-氟乳清酸1g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂粉23g/L)，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落，命名为重组菌1。
(二)重组菌2的构建
将重组质粒pUC-HUH-Fad2导入重组菌1，hisG-ura-hisG片段通过同源重组整合至基因组Fad2位点处，从而敲除油酸去饱和酶基因，然后在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，得到重组菌2。
具体方法如下：
①将重组菌1于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将重组质粒pUC-HUH-Fad2转化入重组菌1中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，CSM-Ura 0.67g/L，琼脂粉23g/L，溶剂为水。
②将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板(同重组菌1构建过程中)，取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上的能生长而SD-Ura平板上未能生长的单菌落，命名为重组菌2。
(三)重组菌3的构建
将重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD导入重组菌2，PgSCD表达盒通过同源重组整合至基因组YlSCD位点，然后在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，得到重组菌3。
具体方法如下：
①将重组菌2于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将重组质粒pUC-HUH-YlSCD-PgSCD转化入重组菌2中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，然后PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Ura 0.67g/L，琼脂粉23g/L，溶剂为水。
②将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上的能生长而SD-Ura平板上未能生长的单菌落，命名为重组菌3。
(四)重组菌4的构建
将重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD导入重组菌3，PgSCD表达盒整合至基因组lip1位点，然后在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，得到重组菌4。
具体方法如下：
①将重组菌3于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将重组质粒pUC-HUH-lip1-PgSCD转化入重组菌3中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，进行PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Ura 0.67g/L，琼脂粉23g/L，溶剂为水。
②将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上未能生长的单菌落，命名为重组菌4。
(五)重组菌5的构建
将重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1导入重组菌4，MaELO2和YlELO1表达盒整合至基因组SCP2位点，然后在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记后，得到重组菌5。
具体方法如下：
①将重组菌4于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将重组质粒pUC-HUH-SCP2-MaELO2-YlELO1转化入重组菌4中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，并进行PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，CSM-Ura 0.67g/L，琼脂粉23g/L，溶剂为水。
②将PCR鉴定正确的阳性克隆涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上未能生长的单菌落，得到重组菌5。将重组菌5命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株。
以上共构建了5株重组菌，其中，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-9株已于2020年11月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名为：解脂耶氏酵母XJ-9或Yarrowia lipolytica XJ-9，保藏编号：CCTCC NO:M2020707。
实施例3、重组解脂耶氏酵母菌在生产油酸中的应用(一)工程菌的培养及产物提取
分别采用初始菌解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f Δku70、实施例2中重组菌2和5生产油酸。具体方法如下：活化菌株，于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，溶剂为水)中30℃、220rpm条件下培养16h，得到种子液。将种子液以1％的接种量接种于50ml发酵培养基中，在30℃、220rpm震荡培养5天。发酵结束后，将发酵液转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，去上清，置于烘箱(75℃)中烘干至恒重。
其中发酵培养基配方为：葡萄糖60g/L，无氨基酵母氮源(YNB)1.7g/L，硫酸铵1.3g/L，溶剂为水。
(二)油酸的定性定量分析
1、脂肪酸甲酯化
称量1.5g左右干菌体，并在其中添加10ml 4M盐酸，反应20min；移至沸水浴中加热10min；-80℃冷冻放置15min；加入10mL氯仿和5mL甲醇，在200rpm震荡30min；取下层脂溶层于10ml离心管中，在通风橱中用氮气吹干；真空干燥2h得到油脂。于2ml离心管中称取0.1g油脂，加入1ml正己烷和0.1ml氢氧化钾/甲醇溶液，快速震摇1min,，使其混合完全。将该反应液置于室温下静置15min进行甲酯化反应。静置完毕，设置离心条件5000rpm离心5min，取上清液200μl置于2ml离心管中，待气相分析。
2、油酸检测
检测条件：FID检测器，进样口温度250℃，进样体积1μl，分流比：50:1，色谱柱：DB-23(60m*0.25μm*0.15μm)。色谱条件：初始温度为100℃，按照25℃/min的速度上升到196℃，然后2℃/min上升到220℃，保持2min左右。用Sigma-Aldrich公司的脂肪酸混合标准品进行定性定量。
发酵5天后，重组菌5的油酸产量最高(图6和表3)，达到了25.85g/L，即每升发酵液产25.85g的油酸，显著高于初始菌和重组菌2。
表3初始菌、重组菌2和重组菌5的油酸产量
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
<130> 20201211
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1524
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 优化后的硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因PgSCD
<400> 1
atgtccaagc cctctccctc cactcccgcc actgcccctc atttaagaca gcgacaacga 60
aaaaacctcc ccgattacga ccccgactcc gatttatctg aatctgaagg tctcggtggt 120
ctccgatccc aagttggcaa cacttgggag gacgacgagg agaccgccgt ggacgacgac 180
tcctacgtgc aacgaactct gcgaaaggag aagcccctcc cccccatcac ttggtgcaac 240
ttctaccgag agatcaacat gatttccacc ctcgctttaa ccgtggtccc catcctcgct 300
atttacggtg ccttcaccac ccctttatac agatctaccc tcgcttggtc cattctctac 360
tactacttta ctggcctcgg catcactgcc ggctaccacc gactctgggc ccatcgatct 420
tacaacgctt ctttacctct gcagtacttt ctcgctttag gcggttctgg cgccgtggag 480
ggttctatcc gatggtgggc ccgaggccac cgagcccacc acagatatac cgacaccgat 540
ctcgacccct actccgccca taaaggcctc ctctggtccc atgtgggttg gatgattgtg 600
aagccccgaa gaaagcccgg tgtggccgat gtgtctgatt tatcccgaaa ccaagttgtc 660
cgatggcagc accgatggta tttacctctg atcttcggca tgggtttctt tttccccacc 720
ctcgtggctg gtctcggttg gggtgattgg cgaggcggtt ttttctacgc tggtgctgct 780
cgactcctct ttgtgcacca ctccaccttc tgtgtgaact ctctcgctca ctggctcggt 840
gaggctccct tcgacgacaa gcataccccc cgagaccaca ttattaccgc tttcgtcacc 900
atcggtgagg gttaccataa cttccaccac gagttccccc aagatttcag aaacgccatc 960
cgatggtacc agtatgaccc cactaagtgg tttattgccg tggctgcctt cctcggttta 1020
gcttccgagc tcaagacctt ccccgataac gaggtgcgaa agggccagta ctccatgaaa 1080
ctcaaggagc tgcagcgaga tttccgagac gtcaagtggc ccaagtcctc caacgatctg 1140
cccattgtca cttgggagca attcgtggag gaagccgaca agaagaacgg ccgagacctc 1200
attgtcgtcg gtggtttcat tcacgacgtg accgagttta tcgacgagca ccccggtggt 1260
cgagctttaa tcaagaccag actgggcaag gatgctacca ccgcctttca cggtggcgtg 1320
tacgaccact ctaacgctgc tcacaattta ctcgctatgc tgcgagtcgg tgtcatcgag 1380
ggcggttacg aggtcgagca tttaaagaag aaggtgggcg tcttcagaaa ggagcagcag 1440
atccctatct gcggccctaa gtctctgggc accatctcta cccccgaatc tcccgtggtc 1500
gaggtcaagc ccatctacac ttaa 1524
<210> 2
<211> 828
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 优化后的脂肪酸延长酶2编码基因MaELO2
<400> 2
atggagtctg gccccatgcc cgccggaatt cccttccccg agtactacga cttcttcatg 60
gactggaaga cccctttagc cattgccgcc acttacaccg ctgccgtcgg tttattcaac 120
cctaaggtgg gcaaggtctc ccgagtggtg gccaagtctg ccaacgccaa gcccgccgag 180
agaactcagt ctggcgctgc catgaccgcc ttcgtgtttg tgcacaattt aatcctctgc 240
gtctactccg gcatcacctt ctactacatg ttccccgcca tggtgaagaa cttccgaacc 300
cacactttac acgaggccta ctgcgacacc gaccagtctt tatggaacaa cgctttaggc 360
tactggggtt atttattcta tttatccaag ttctacgagg tcatcgatac catcatcatt 420
attctgaagg gacgacgatc ctctttactg cagacctacc accacgctgg cgccatgatc 480
accatgtggt ctggcatcaa ctaccaagct acccccatct ggattttcgt ggtctttaac 540
tccttcattc acaccattat gtactgctac tatgccttca cctccatcgg cttccatccc 600
cccggtaaga agtatttaac ctctatgcag attacccagt ttttagtcgg catcaccatt 660
gccgtgtctt atttattcgt ccccggatgc atcagaaccc ccggcgctca gatggccgtg 720
tggatcaacg tgggctatct gttccctctg acctacttat tcgtggactt cgccaagcga 780
acctattcca agcgatccgc catcgccgcc cagaagaagg cccagtaa 828
<210> 3
<211> 545
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 3
gtgcatgctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt 60
gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggcatgctga 120
ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac 180
gtacattatc gagaccgttg ttcccgccca cctcgatccg gcatgctgag gtgtctcaca 240
agtgccgtgc agtcccgccc ccacttgctt ctctttgtgt gtagtgtacg tacattatcg 300
agaccgttgt tcccgcccac ctcgatccgg catgctgagg tgtctcacaa gtgccgtgca 360
gtcccgcccc cacttgcttc tctttgtgtg tagtgtacgt acattatcga gaccgttgtt 420
cccgcccacc tcgatccggc atgcactgat cacgggcaaa agtgcgtata tatacaagag 480
cgtttgccag ccacagattt tcactccaca caccacatca cacatacaac cacacacatc 540
cacgt 545
<210> 4
<211> 531
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 4
agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420
aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480
acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca g 531
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<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
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acatggtttt tagggggtac tgtacatata tatctgtggt ggtcctgatt ttcgccaaac 60
catgttcttc gtgttccttt tcaccctcac tcacatgtcg tccacttgtt agcgtcatct 120
ttcttggcaa tagctactat tcaacattga aggaacagcc gtcccgaaag tcacttgtcg 180
gagtactccg tcccgcgacg catgcaaccg ctatgaacta acccgtgtca gtgaagtcgg 240
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tcacacatcg atcgacaagc gaggctatta tttaaaaact gtcttagtga gttaccctgc 360
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tattccccca ttaacgataa tatccgcatt aattattatg ctgcacggaa ctgacatcaa 480
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<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
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ccaggccgcc tagatgacaa attcaacaac tcacagctga ctttctgcca ttgccactag 120
gggggggcct ttttatatgg ccaagccaag ctctccacgt cggttgggct gcacccaaca 180
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acggggctca atggcacaaa taagaacgaa tactgccatt aagactcgtg atccagcgac 300
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a 841
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<212> DNA
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tcttattttc catacatatg caagtgagat gcccgtgtc 519
Claims (8)
1. 一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母菌为解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ-9株，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2020707。
2. 根据权利要求1所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ-9株是在解脂耶氏酵母基因组中敲除油酸去饱和酶，***乙酰辅酶A羧化酶表达盒、二酰甘油酰基转移酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、脂肪酸延长酶2表达盒和硬脂酰辅酶A去饱和酶表达盒后得到的。
3. 根据权利要求2所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述乙酰辅酶A羧化酶、二酰甘油酰基转移酶、脂肪酸延长酶1编码基因来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）；脂肪酸延长酶2编码基因是将来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）的脂肪酸延长酶2编码基因经密码子优化后所得；硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因是将来源于杆锈菌（Puccinia graminis）的硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因经密码子优化后所得。
4.根据权利要求3所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述乙酰辅酶A羧化酶1和二酰甘油酰基转移酶1表达盒的整合位点为IntC位点，筛选标记hisG-ura-hisG整合位点为Fad2位点，硬脂酰辅酶A去饱和酶表达盒的整合位点为lip1位点或YlSCD位点，脂肪酸延长酶1与脂肪酸延长酶2表达盒的整合位点为SCP2位点。
5. 根据权利要求4所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述硬脂酰辅酶A去饱和酶编码基因序列如SEQ ID No. 1所示；所述脂肪酸延长酶2编码基因序列如SEQ IDNo.2所示。
6. 权利要求1所述高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于包括将油酸去饱和酶敲除盒、乙酰辅酶A羧化酶表达盒、二酰甘油酰基转移酶表达盒、脂肪酸延长酶1表达盒、脂肪酸延长酶2表达盒和硬脂酰辅酶A去饱和酶表达盒通过质粒形式导入敲除了ku70基因的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Po1f Δku70，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。
7.权利要求1-5中任一所述重组解脂耶氏酵母菌在生产油酸中的应用，其特征在于包括采用发酵培养基培养权利要求1-5中任一所述重组菌，得到发酵产物的步骤。
8.根据权利要求7所述重组解脂耶氏酵母菌在生产油酸中的应用，其特征在于所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/L，无氨基酵母氮源1.6-1.8g/L，硫酸铵1.2-1.4g/L。
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