CN112534046A

CN112534046A - FC-ε CAR

Info

Publication number: CN112534046A
Application number: CN201980034416.6A
Authority: CN
Inventors: 劳伦·H·布瓦塞尔; 汉斯·G·克林格曼; 班纳吉·丹达帕特; 希玛蒂·钦娜彭
Original assignee: NantKwest Inc
Current assignee: ImmunityBio Inc
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-03-19
Also published as: US11643452B2; KR20210003292A; CA3097904A1; KR20240042263A; WO2019226708A4; WO2019226708A1; EP3797157A1; AU2019272608A1; EP3797157A4; JP2024001096A; AU2023203306A1; IL278857A; US20210347850A1; AU2019272608B2; US20210198342A1; KR102617238B1; JP2021525073A; US20230272042A1; KR20240001720A; IL278857B1

Abstract

重组NK细胞，特别是重组NK‑92细胞表达具有FcεRIγ的细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。值得注意的是，具有FcεRIγ的细胞内结构域的CAR构建体具有显著延长的表达持续时间和随时间显著延长的细胞毒性。CAR可以从RNA和DNA表达，优选作为进一步编码CD16和细胞因子以赋予自分泌生长支持的三顺反子构建体。有利地，此类构建体还能够实现重组蛋白的高水平转染和表达，并提供方便的选择标志物，以促进重组NK/NK‑92细胞的快速生产。

Description

FC-ε CAR

本申请要求2018年5月22日提交的序列号为62/674,936的美国专利申请的优先权。

序列表

名为104077.0004 PCT_ST25、大小为106kb的序列表的ASCII文本文件创建于2019年5月21日，通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其内容通过引用以其整体并入。

技术领域

本发明的领域是重组核酸和包含其的细胞，以产生表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的细胞，尤其是表达具有Fcε受体γ(FcεRIγ)信号传导结构域的CAR的修饰的NK和NK-92细胞。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，构成先天免疫***的重要组成部分。在大多数情况下，NK细胞约占循环淋巴细胞的10％-15％，并结合并杀伤靶细胞，该靶细胞包括病毒感染细胞和许多恶性细胞。NK细胞杀伤对特定抗原没有特异性，可以在没有既往免疫敏化的情况下发生。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白(包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)介导。

自体NK细胞已经用作治疗实体。为此，从全血的外周血淋巴细胞级分中分离出NK细胞，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新输注至受试者中。自体NK细胞至少在某些情况下显示出在离体治疗和体内治疗中具有中等有效性。然而，自体NK细胞的分离和生长需要大量的时间和成本。此外，并非所有NK细胞均具有细胞溶解作用，这进一步限制了自体NK细胞疗法。

这些困难中的至少一些可以通过使用NK-92细胞来克服，NK-92细胞是一种细胞溶解性癌细胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现的，然后在体外无限增殖(Gong等人，Leukemia[白血病]8：652-658(1994))。虽然NK-92细胞是NK细胞的衍生物，但NK-92细胞缺乏正常NK细胞所具有的主要抑制受体，而保留了大部分活化受体。但是，NK-92细胞不会攻击正常细胞，也不会引发人体无法接受的免疫排斥反应。由于这些预期特性，NK-92细胞被详细表征，并被探索用作治疗某些癌症的治疗剂，例如，如WO 1998/049268或US 2002/068044所述。

区分肿瘤细胞和来源于同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达方面的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他细胞表面组分的获得(在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原)。在赘生性细胞或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原或在赘生性细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。此类肿瘤特异性抗原可以用作肿瘤表型的标志物。肿瘤特异性抗原包括癌症/睾丸特异性抗原(例如，MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1)、黑素细胞分化抗原(例如，酪氨酸酶、Melan-A/MART、gp100、TRP-1和TRP-2)、突变或异常表达的抗原(例如，MUM-1、CDK4、β-连环蛋白、gp100-in4、p15和N-乙酰葡萄糖胺基转移酶V)以及在肿瘤中表达水平较高的抗原(例如，CD19和CD20)。

肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种这样的疗法利用在包括T细胞和NK细胞在内的免疫细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)来改善针对癌细胞的细胞毒性。CAR包含连接至至少一个细胞内信号传导结构域的单链可变片段(scFv)。scFv识别并结合靶细胞(例如癌细胞)上的抗原，并触发效应细胞活化。信号传导结构域含有基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)，ITAM对通过受体的细胞内信号传导非常重要。

用于T细胞的第一代CAR包含一个胞质信号传导结构域。例如，T细胞中第一代CAR的一个版本包括来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的信号传导结构域，其包含一个ITAM，而另一个版本包含来自CD3ζ的信号传导结构域，其中CD3ζ包含三个ITAM。体内和体外研究表明，CD3ζCAR T细胞在根除肿瘤方面比FcεRIγ CAR T细胞更有效(例如，Haynes等人，2001，J.Immunology[免疫学杂志]166：182-187；Cartellieri等人，2010，J.Biomed and Biotech[生物医学与生物技术]，Vol.2010，文章ID 956304)。然后进一步的研究表明，此类重组T细胞的完全活化和增殖需要一定的共刺激信号，并且第二代和第三代CAR将多个信号传导结构域结合到单一CAR中，以增强重组CAR T细胞的疗效。由于它们在检测的T细胞中文献报道的效应不太理想，因此第一代CAR和FcεRIγ信号传导结构域被大量放弃，转而使用CD3ζ组合一个或多个另外的信号传导结构域(例如，Hermanson和Kaufman 2015，Frontiers inImmunol.[免疫前沿]，第6卷，文章195)。

最近，选择的CAR也已经在NK细胞中表达。例如，CAR修饰的NK-92细胞已使用仅具有CD3ζ细胞内信号传导结构域的第一代CAR。这些第一代CAR-NK细胞已靶向多种抗原，包括用于B细胞淋巴瘤的CD19和CD20，用于乳腺癌、卵巢癌和鳞状细胞癌的ErbB2，用于神经母细胞瘤的GD2，以及用于多发性骨髓瘤的CD138。还已经针对几种抗原构建了来自NK-92系的第二代CAR-NK细胞，包括用于多种癌的EpCAM，用于EB(Epstein-Barr)病毒的HLA-A2 EBNA3复合体，用于多发性骨髓瘤的CS1，以及用于HER2阳性上皮癌的ErbB2。在第二代NK-92 CAR中，与CD3ζ一起使用的最常见的细胞内共刺激结构域是CD28。然而，由于NK细胞不自然表达CD28，因此尚不清楚CD28结构域的潜在作用。另外的第二代CAR已将4-1BB细胞内信号传导结构域与CD3ζ结合在一起，以改善NK细胞的持久性。其他人则使用与单独CD3ζ融合的ErbB2scFv、CD28和CD3ζ、或4-1BB和CD3ζ比较了不同细胞内结构域对乳腺癌细胞的功能性。他们发现，与第一代CAR相比，两种第二代构建体均具有更好的杀伤力，CD28和CD3ζ具有65％的靶标裂解，4-1BB和CD3ζ裂解了62％，单独CD3ζ杀伤了51％的靶标。在最近的研究中，还使用在NK-92细胞上表达的抗CD19 CAR对4-1BB和CD28细胞内结构域用于B细胞恶性肿瘤进行了比较。还有其他人发现，CD3ζ/4-1BB构建体在细胞杀伤和细胞因子产生方面不如CD3ζ/CD28有效，突出了CD28和4-1BB共刺激结构域的不同作用。

第三代NK-92 CAR由具有CD3ζ、CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域的抗CD5 scFv构建，并已证明对多种T细胞白血病和淋巴瘤细胞系以及原发性肿瘤细胞具有特异性和强效的抗肿瘤活性。此类细胞还能够在T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系和原发性肿瘤细胞的异种移植小鼠模型中抑制疾病进展(Transl Res.[转化医学研究]2017年9月；187：32-43)。在进一步的实例中，WO 2016/201304和WO 2018/076391教导了在NK细胞和NK-92细胞中表达的第三代CD3ζ CAR的用途。

自体NK细胞和NK-92细胞需要外源IL-2作为生存因子和潜在细胞毒性的增强剂。不幸的是，IL-2的全身施用通常与显著的非预期不良副作用和毒性有关。为了克服这些问题，可以在向患者施用前在体外培养和扩增细胞。尽管IL-2将实现生成足够量的NK细胞或NK-92细胞，但在大规模生产NK细胞中使用外源IL-2通常成本高昂。外源IL-2的需求可通过逆转录病毒载体中局限于内质网的IL-2的重组表达来解决(见Exp Hematol[实验血液学].2005Feb；33(2)：159-64)。此类方法消除了对外源IL-2的需求。但是，逆转录病毒的转染效率通常不理想，在待表达多个重组基因的情况下效率甚至更低。

此外，如对NK-92细胞进行工程改造以表达Fc受体的多次失败所证明，NK细胞，尤其是NK-92细胞通常很难进行基因修饰。当NK-92细胞转染多种重组基因或相对较大的重组核酸有效载荷用于异源表达时，这些困难进一步加剧。此外，NK-92细胞在外源蛋白(例如，CD16)重组表达方面也表现出明显缺少可预测性。在功能水平上，大多数(如若非全部)CARNK-92细胞需要相对高效靶比，这可能是由于CAR构建体的表达相对较低。而且，此类CARNK-92细胞的细胞毒性也将随时间迅速下降，从而使此类细胞在临床上不太有吸引力。

因此，尽管在本领域已知有大量的重组NK-92细胞，但所有或几乎所有的重组细胞均遇到各种困难。因此，仍需要表达CAR的NK-92细胞，其表达大量高活性CAR并伴有持续的细胞毒性，并易于以简单有效的方式进行培养。

发明内容

发明人发现，NK-92细胞可以有效地转染重组核酸以表达含FcεRIγ的CAR。出乎意料的是，具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR显著增加CAR的表达水平，并进一步传递细胞毒性随时间延长。设想的编码CAR的重组核酸优选为三顺反子排列，其还包括编码CD16或CD16变体，和/或IL-2或IL-2变体的序列部分。有利地，此类重组核酸不仅提供选择转染细胞的有效方式(因为IL-2不仅提供自分泌生长刺激，而且还充当共表达蛋白的选择标志物)，还可产生具有优异细胞溶解活性的CAR NK细胞(例如，与其他构建体相比，效靶比相对较低)，并且CD16和含FcεRIγ的CAR的表达水平较高。

因此，在本发明主题的一个方面，发明人设想了一种基因修饰的NK细胞，其重组表达细胞因子、CD16和膜结合的嵌合抗原受体(CAR)。CAR的单条多肽链中通常包含(i)细胞外结合结构域、(ii)铰链结构域、(iii)跨膜结构域和(iv)FcεRIγ信号传导结构域(例如，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)。

在许多实施例中，NK细胞是NK-92细胞，和/或重组表达的细胞因子是或包括IL-2或IL-15(其可以进一步包括内质滞留序列)。在其他实施例中，CD16可以是高亲和力CD16变体(例如，CD16_158V)。

优选地，但非必须地，细胞外结合结构域将包含可以与以下项特异性结合的scFv：肿瘤特异性抗原(例如，CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、PD-L1、BCMA或CD33)、肿瘤相关抗原、或患者和肿瘤特异性抗原，或者可以与病毒特异性抗原(例如，HIV病毒、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒的抗原)。

在一些实施例中，细胞因子、CD16和CAR由三顺反子重组核酸表达，而在其他实施例中，细胞因子和/或CD16由整合到NK细胞基因组中的重组核酸表达。

因此，发明人还设想了一种重组核酸，其包括编码细胞因子的第一序列部分、编码CD16的第二序列部分和编码嵌合抗原受体(CAR)的第三序列部分，所述CAR的单条多肽链中包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。最典型地，第一、第二和第三序列部分位于同一核酸上。

尽管在一些实施方式中，该核酸是三顺反子RNA，但是在其他实施方式中，该核酸是三顺反子DNA。

而且，通常优选地，细胞因子是IL-2或IL15(其可以包括或可以不包括内质滞留序列)，CD16是具有158V突变的高亲和力CD16变体，和/或细胞外结合结构域包括scFv。如前所述，细胞外结合结构域可以与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者和肿瘤特异性抗原特异性结合，或者细胞外结合结构域可以与病毒特异性抗原特异性结合。

在进一步设想的方面，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含CD8铰链结构域和/或CD28跨膜结构域，而该FcεRIγ信号传导结构域可以具有SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

在本发明主题的其他方面，发明人还设想了一种重组细胞，其包含如上和本文所述的重组核酸。在制备和/或扩增核酸的情况下，重组细胞可以是细菌细胞。另一方面，在待表达重组核酸的情况下，细胞通常是自体NK细胞或NK细胞(也可以是任选地经基因修饰的NK-92细胞)。

因此，发明人还设想了一种治疗有需要的患者的癌症的方法。在此类方法中，向患者施用治疗有效量的任一种基因修饰的NK细胞，从而治疗癌症。此外，以及在预期的情况下，设想的方法可以包括施用至少一种另外的治疗实体的进一步步骤，该另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。

在其他癌症中，设想的癌症包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

同样，发明人还设想了一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法。在此类方法中，向患者施用治疗有效量的任一种基因修饰的NK细胞，从而治疗病毒感染。在预期或有需要的情况下，还可以施用抗病毒药。

无论治疗类型如何，通常设想向患者施用约1x10⁸至约1x10¹¹个细胞/m2患者体表面积。从不同的角度来看，设想了如本文所述的基因修饰的NK细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。

通过以下优选的实施例的详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1是示例性检测的CD19-CAR的示意图。所有CD19-CAR变体均包含细胞外结构域，其包含抗CD19 scFv区(αCD19-scFv)、来自CD8的铰链区(CD8铰链)和来自CD28的跨膜结构域(CD28 TM)。CD19CAR的细胞内结构域如所示变化。

图2A是使用标记有eF660的抗scFv抗体通过流式细胞术确定的，转染CD19-CARmRNA后表达图1的CD19-CAR的NK-92细胞的示例性百分比结果。

图2B是使用标记有eF660的抗scFv抗体标记的表达CD19-CAR的NK-92细胞的荧光强度(MFI)中位值减去背景的示例性结果。

图3A示出了以5∶1至0.3∶1的效靶比，被表达CD19CAR的NK-92细胞(效应子)杀伤的NK-92细胞敏感性靶癌细胞(K562)的百分比示例性结果。

图3B示出了以5∶1至0.3∶1的效靶比，被表达CD19CAR的NK-92细胞(效应子)杀伤的NK-92细胞耐受的CD19阳性靶癌细胞(SUP-B15)的百分比示例性结果。

图4示出了以2∶1至0.25∶1的效靶比，在使用SUP-B15靶细胞的脱粒测定中标记有抗CD107a抗体的表达CD19-CAR的NK-92(效应子)的MFI示例性结果。

图5示出了在不同时间点在用CD19 CAR mRNA构建体转染的haNK细胞上CD19 CAR表面表达的示例性结果。在具有最长表达持续时间的CD19/CD28-Fc-ε-CAR使用的条件下，所有检测的CAR构建体显示可检测的表达长达72h。

图6示出了CD19.taNK对SUPB15 CD19+细胞(aNK抗性细胞系)的细胞毒性的示例性结果。检测的所有CAR构建体在24h时均显示出相当的(最大)细胞毒性。然而，在48h，CD19/CD3-ζ显示出明显的细胞毒性下降，而基于Fc-ε的CAR在电穿孔后48小时仅显示出极小下降。

图7是重组三顺反子DNA构建体和相应蛋白产物的示例性示意图。

图8示出了图8所示质粒的示例性线性化形式。

图9A示出了体外数据的示例性结果，显示CD33阳性(CD33+)的THP-1细胞对通过对照NK-92(aNK)细胞的细胞毒性(特异性裂解)相对地具有抗性，而当THP-1细胞与表达特异性结合CD33的CAR的NK-92细胞(CD33-CAR/NK-92细胞)一起培养时存在高百分比的特异性裂解。

图9B示出了体外数据的示例性结果，其显示对照aNK细胞和CD33-CAR/NK-92细胞均可杀死K562细胞。

图10示出了HER2.CAR-t-haNK细胞对BT-474细胞的细胞毒性的示例性结果。

图11示出了CD33.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的细胞毒性的示例性结果。

图12示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15.PD-L1⁺细胞的细胞毒性的示例性结果。

图13示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对U251细胞的细胞毒性的示例性结果。

图14示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞对A-549细胞的细胞毒性的示例性结果。

图15示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的细胞毒性的示例性结果。

图16示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15细胞的细胞毒性的示例性结果。

图17示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对SKBr3细胞的ADCC的示例性结果。

图18示出了IGF1R.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性的示例性结果。

图19示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对多种癌细胞的细胞毒性的示例性结果。

图20示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性的示例性比较结果。

图21示出了CD16和CD19.CAR表达的示例性结果。

图22示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图23示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图24示出了CD19.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图25示出了CD16和CD20.CAR表达的示例性比较结果。

图26示出了CD20.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图27示出了CD16和CD33.CAR表达的示例性结果。

图28示出了CD33.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图29示出了CD33.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图30示出了CD33.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图31示出了CD16和EGFR.CAR表达的示例性结果。

图32示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图33示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞对A549细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图34示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞对HCT116细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图35示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图36示出了CD16和HER2.CAR表达的示例性结果。

图37示出了HER2.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图38示出了HER2.CAR-t-haNK细胞对SKBR-3细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图39示出了HER2.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图40示出了CD16和PD-L1.CAR表达的示例性结果。

图41示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图42示出了CAR介导的PD-L1.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图43示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图44示出了CAR介导的CD123.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图45示出了CD123.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图46示出了CD16和CD30.CAR表达的示例性结果。

图47示出了CD30.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图48示出了CD30.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图49示出了CD30.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图50示出了CD16和BCMA.CAR表达的示例性结果。

图51示出了CAR介导的BCMA.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图52示出了BCMA.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图53示出了CD16和gp120.CAR表达的示例性结果。

图54示出了gp120.CAR-t-haNK细胞的GP120结合的示例性结果。

图55示出了gp120.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的天然细胞毒性的示例性结果。

图56示出了gp120.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图57示出了CD16和FAP.CAR表达的示例性结果。

图58示出了CAR介导的FAP.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图59示出了CSPG4.CAR-t-haNK细胞中CSPG4表达的示例性结果。

图60示出了CSPG4.CAR-t-haNK细胞对SK-MEL-28细胞的CAR介导的细胞毒性的示例性结果。

图61描述了编码IGF1R-CAR、CD16和IL-2^ER的示例性三顺反子构建体。

具体实施方式

发明人出乎意料地发现，在重组CAR包括FcεRIγ信号传导结构域的情况下，重组NK细胞(例如，NK-92细胞)中CAR介导的细胞毒性和CAR表达明显增加，如下文更详细描述。具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR在NK细胞中具有优越特性的发现尤其出乎意料，因为与具有CD3ζ、4-1BB或CD28信号传导结构域以及第二代和第三代CAR中常见的其他信号传导结构域的CAR相比，此类T细胞中的CAR表现相对较差。

因此，在一些实施例中，设想了重组核酸，其编码具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR，优选但非必须地，在三顺反子序列中，其还包括编码CD16或CD16变体，和/或IL-2或IL-2变体的序列部分。在本发明主题的还一有利方面，此类重组核酸不仅将提供选择转染细胞的有效方式(因为IL-2不仅提供自分泌生长刺激)，而且还充当共表达蛋白的选择标志物。

因此，本发明的主题涉及在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的NK细胞、NK-92细胞及其衍生物，其中该CAR优选包含来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的细胞内信号传导结构域。例如，FcεRIγ的胞质结构域可以具有与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或者包含具有SEQ ID NO：1所示序列的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，FcεRIγ的胞质结构域由与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的核酸编码。设想的重组细胞可以进一步表达各种其他蛋白，包括一种或多种细胞因子和CD16。如将容易理解的，CAR和/或其他蛋白可以由重组细胞瞬时表达或稳定表达。

在一些实施例中，CAR包含CD8的铰链区和/或在一些实施例中，CAR包含CD28的跨膜结构域，该CD28具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列(由如SEQ ID NO：7所示的核酸编码)。CD28的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。在进一步的实施例中，重组细胞经具有SEQ ID NO：9所述的序列的核酸基因修饰，该核酸编码具有SEQ ID NO：8所示的序列的杂合蛋白，该杂合蛋白包含与偶联至FcεRIγ信号传导结构域的CD28跨膜结构域偶联的CD8铰链区。应当理解，将结合结构域添加至铰链区将形成功能性CAR。例如，结合结构域靶标或特异性地可以结合肿瘤相关抗原，并且合适的抗原包括CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、PD-L1、BCMA和CD33。

在一些实施例中，核酸构建体进一步包含促进核酸序列转录的(诱导型)启动子。优选但非必须地，核酸构建体是包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)的多顺反子载体或RNA，以实现从核酸序列转录的mRNA内部区域起始翻译。替代性地，或另外地，核酸构建体包含编码2A肽，诸如T2A、P2A、E2A或F2A肽的序列，以产生由相同mRNA编码的等摩尔水平的多肽。在一些实施例中，核酸构建体进一步包含编码抗原结合蛋白(ABP)的核酸序列。在一些实施例中，ABP是scFv或密码子优化的scFv。在一些实施例中，ABP特异性结合肿瘤细胞表达的抗原。在一些实施例中，ABP是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在进一步的实施例中，构建体包含编码可以靶向内质网的细胞因子诸如IL-2或IL-15的核酸。在一些实施例中，还对NK-92细胞或细胞系进行基因修饰以在细胞表面表达CD16。在一个实施例中，对NK-92细胞或细胞系进行基因修饰以在细胞表面表达高亲和力CD16(F158V)。

关于合适的NK细胞，应当注意，所有NK细胞均被认为适用于本发明，因此包括原代NK细胞(保存、扩增和/或新鲜的细胞)、已永生化的继代NK细胞、自体或异种NK细胞(原液、保存的、新鲜的等)和修饰的NK细胞，如以下更详细所述。在一些实施例中，优选地，该NK细胞是NK-92细胞。NK-92细胞系是独特的细胞系，发现其在白介素2(IL-2)的存在下增殖(参见，例如，Gong等人，Leukemia[白血病]8：652-658(1994))。NK-92细胞是癌性NK细胞，在合适的培养基中扩增后具有广泛的抗肿瘤细胞毒性和可预测的产量。有利地，NK-92细胞对多种癌症具有高细胞溶解活性。

原始NK-92细胞系表达CD56bright、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45和CD54表面标志物，但未展示CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23和CD34标志物。此类NK-92细胞在培养物中的生长取决于白介素2(例如，rIL-2)的存在，低至1IU/mL的剂量足以维持增殖。IL-7和IL-12不支持长期生长，其他多种细胞因子尚未检测，包括IL-1α、IL-6、肿瘤坏死因子α、干扰素α和干扰素γ。与原代NK细胞相比，NK-92即使在相对较低的效靶(E∶T)比(例如，1∶1)下也通常具有较高的细胞毒性。代表性NK-92细胞于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，命名为CRL-2407。

因此，合适的NK细胞可以具有一个或多个修饰的KIR，该修饰的KIR被突变以减少或消除与MHC I类分子的相互作用。当然，应当注意，还可以使一个或多个KIR缺失或抑制其表达(例如，经由miRNA、siRNA等)。最典型地，多于一个KIR将被突变、缺失或沉默，并且特别预期的KIR包括具有两个或三个结构域、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，经修饰的、沉默的或缺失的KIR将包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、和KIR3DS1。可以使用本领域熟知的方案制备此类经修饰的细胞。可替代地，此类细胞还可以作为aNK细胞(‘活化的自然杀伤细胞)从南特圭斯特公司(NantKwest)(参见URLwww.nantkwest.com)商购获得。然后可以这些细胞经另外的基因修饰为CAR，如下文更详细描述。

在本发明主题的另一方面，基因工程改造的NK细胞也可以是经修饰以表达高亲和力Fcγ受体(CD16)的NK-92衍生物。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的(参见，例如，Blood[血液]2009 113：3716-3725)，并且认为所有产生和表达的方式均适用于本文。此类受体的表达被认为使用对患者的肿瘤细胞(例如，新表位)、具体的肿瘤类型(例如，her2neu、PSA、PSMA等)具有特异性的抗体，或与癌症相关的抗体(例如，CEA-CAM)实现特异性靶向肿瘤细胞。有利地，此类抗体可商购获得并可以与细胞连同使用(例如，与Fcγ受体结合)。替代性地，此类细胞还可以以haNK细胞从南特圭斯特公司商购获得。然后可以这些细胞经另外的基因修饰为CAR，如下文更详细描述。

本文设想的NK细胞的基因修饰可以以多种方式进行，并且所有已知方式均被认为适用于此。而且，应该认识到NK细胞可以转染DNA或RNA，并且转染的具体选择将至少部分取决于预期的重组细胞的类型和转染效率。例如，在预期稳定转染NK细胞的情况下，可以将线性化的DNA引入细胞中以整合到基因组中。另一方面，在预期瞬时转染的情况下，可以使用环状DNA或线性RNA(例如，具有polyA+尾的mRNA)。

例如，在NK细胞是自体NK细胞或NK-92细胞的情况下，设想该重组核酸将包括编码CAR的片段，该CAR包括FcεRIγ信号传导结构域，并且优选地还包括编码细胞因子以提供自分泌生长刺激的片段(例如，IL-2、经ER滞留序列修饰的IL-2、IL-15或经ER滞留序列修饰的IL-15)和/或编码CD16或高亲和力CD16^158V的片段。如将容易理解的，包括提供自分泌生长刺激的细胞因子将使修饰的重组体非依赖于外源细胞因子的添加，这将使此类细胞的大规模生产在经济上可行。同样，在修饰的重组体还表达CD16或高亲和力CD16^158V的情况下，此类细胞将具有进一步增强的ADCC特性，并具有进一步改善的靶向细胞毒性。

当然，应认识到，编码细胞因子和/或CD16或高亲和力CD16^158V的重组核酸可以整合到NK细胞的基因组中，或者可以作为染色体外单元(其可以是病毒递送的或经化学、机械或电转染的线性或环状DNA或者线性RNA)。例如，表达IL-2ER和CD16158V的重组NK-92细胞被称为haNK细胞(Oncotarget[肿瘤靶向]2016 Dec 27；7(52)：86359-86373)，并可以经重组核酸转染，该重组核酸包括编码包括FcεRIγ信号传导结构域的CAR的片段。再一次，此类重组核酸可以进一步包含可以编码另外的免疫治疗蛋白的片段，诸如N-803、TxM型化合物、IL-8trap、TGF-βtrap等。同样，NK-92细胞可能已转染编码IL-2的cDNA(例如NK-92MI，ATCCCRL-2408)。然后可以用重组核酸进一步转染此类细胞，该重组核酸包括编码包括FcεRIγ信号传导结构域的CAR的片段以及编码CD16或高亲和力CD16^158V的片段。

另一方面，(自体、新鲜、培养或先前冷冻的)NK细胞或NK-92细胞还可以转染重组核酸，该重组核酸包括编码具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的片段、编码细胞因子以提供自分泌生长刺激的片段(例如，IL-2、经ER滞留序列修饰的IL-2、IL-15或经ER滞留序列修饰的IL-15)和编码CD16(SEQ ID NO：34)或高亲和力CD16^158V(SEQ ID NO：35，由SEQ ID NO：36编码)的片段。最典型地，此类重组核酸将被配置为三顺反子构建体。如前所述，此类构建体可以是染色体外环状质粒、线性DNA(其可以整合到NK细胞的基因组中)或线性RNA。此类核酸通常将以本领域熟知的方式(例如，电穿孔、脂转染、弹道基因转移等)转染进入细胞。类似地，可以通过重组病毒将核酸递送至细胞。因此，适用于本文的NK细胞包括NK-92细胞(其可以转染编码CAR、CD16或其变体、细胞因子或其变体的三顺反子构建体)、表达CD16或其变体或者细胞因子或其变异体的基因修饰的NK细胞或NK-92细胞(其可以转染编码CAR和CD16或其变异体或细胞因子或其变异体的核酸)、和表达CD16或其变体和细胞因子或其变体的基因修饰的NK细胞或NK-92细胞(其可以转染编码CAR的核酸)。

因此，在优选的实施例中，应注意，基因修饰的NK细胞(特别是表达CAR和CD16或其变异体的细胞)将表现出三种不同的细胞杀伤模式：由活化受体(例如，NKG2D受体)介导的一般细胞毒性、由与靶细胞结合的抗体介导的ADCC和CAR介导的细胞毒性。

因此，应当理解，转染的方式将至少部分取决于所用核酸的类型。因此，病毒转染、化学转染、机械转染方法均被认为适用于本文。例如，在一个实施例中，本文所述的载体是瞬时表达载体。使用这类载体引入的外源转基因没有整合到细胞的核基因组中；因此，在没有载体复制的情况下，外源转基因将随着时间而降解或稀释。

在另一实施例中，本文所述的载体允许细胞的稳定转染。在一个实施例中，载体允许将一个或多个转基因并入细胞的基因组中。优选地，此类载体具有阳性选择标志物，并且合适的阳性选择标志物包括允许细胞在会杀伤不表达该基因的细胞的条件下生长的任何基因。非限制性实例包括抗生素抗性，例如，遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。

替代性地，或另外地，该载体是质粒载体。在一个实施例中，载体是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，可以使用任何合适的载体，并且合适的载体是本领域熟知的。

在还其他实施例中，细胞转染编码目的蛋白(例如，CAR)的mRNA。mRNA的转染导致蛋白质的瞬时表达。在一个实施例中，在施用细胞之前立即将mRNA转染至NK-92细胞中。在一个实施例中，即将施用细胞“之前”是指施用之前约15分钟与约48小时之间。优选地，在施用前约5小时至约24小时进行mRNA转染。在下文更详细描述的至少一些实施例中，转染mRNA的NK细胞导致在高比例的转染细胞上CAR出乎意料地一致和强表达。而且，此类转染细胞在效靶细胞比相当低的情况下也表现出高特异性细胞毒性。

关于设想的CAR，注意到NK或NK-92细胞将经基因修饰以将CAR表达为膜结合蛋白，从而在细胞表面上暴露一部分CAR，同时在细胞内空间中保持信号传导结构域。最典型的是，CAR将至少包括以下元件(按顺序)：细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

在优选的实施例中，CAR的胞浆结构域包含FcεRIγ的信号传导结构域或由其组成。值得注意的是，并且如下文更详细所述，FcεRIγ信号传导结构域提供了CAR的表达水平显著增加以及细胞毒性随时间显著延长。例如，FcεRIγ信号传导结构域包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，FcεRIγ胞质结构域是唯一的信号传导结构域。然而，应当理解，还可以包括另外的元件，诸如其他信号传导结构域(例如，CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域等)。这些另外的信号传导结构域可以位于FcεRIγ胞浆结构域的下游和/或FcεRIγ胞浆结构域的上游。

在一些实施例中，FcεRIγ信号传导结构域包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

在可选的实施例中，CAR的胞质结构域还可以包含CD3 zeta(CD3ζ)的信号传导结构域。在一个实施例中，CAR的胞浆结构域由CD3ζ的信号传导结构域组成。在一个实施例中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，CD3ζ信号传导结构域包含与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

该CAR可以包含任何合适的跨膜结构域。在一方面，该CAR包含CD28的跨膜结构域。在一个实施例中，该CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO：7所示的核酸编码)或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，该CD28跨膜结构域包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在其他实施例中，跨膜结构域还可以是4-1BB跨膜结构域。

该CAR可以包括任何合适的铰链区。在一方面，该CAR包含CD8的铰链区。在一个实施例中，该CD8铰链区包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一个实施例中，该CD8铰链区包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。此类区域可以由具有SEQ ID NO：5所示的序列的核酸编码。

因此，设想的CAR将包括与铰链结构域偶联的预期抗原结合结构域的一般结构，该铰链结构域与跨膜结构域偶联，该跨膜结构域与信号传导结构域偶联。从另一角度，设想的CAR可以具有预期的结合结构域，然后将其偶联至杂合蛋白，该杂合蛋白包含铰链结构域或由其组成或基本上由其组成，该铰链结构域与跨膜结构域偶联，该跨膜结构域与信号传导结构域偶联。例如，此类杂合蛋白可以具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列(由SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码)。

最典型但非必要地，CAR的细胞外结合结构域将是特异性结合目的抗原的scFv或其他自然或合成结合部分。特别合适的结合部分包括具有单个、双重或多个靶标特异性的小抗体片段，β桶状结构域结合子，噬菌体展示融合蛋白等。在其他合适的细胞外结合结构域中，优选的结构域将与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。肿瘤特异性抗原包括但不限于NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B和CD33。表1中列出了其他非限制性肿瘤相关抗原，以及与之相关的恶性肿瘤。作为非限制性实例，在US2013/0189268；WO 1999024566A1；US 7098008；和WO 2000020460中描述了还进一步的肿瘤特异性抗原，其各自通过援引以其全文并入本文。同样，其他优选的结构域将与(致病性)病毒特异性抗原(诸如HIV病毒(例如，gp120)、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV的抗原)特异性结合。

表1

例如，CAR可以包含抗CD19细胞外结构域。在一个实施例中，抗CD19细胞外结构域包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，抗CD19细胞外结构域包含与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

因此，设想的CAR将靶向与特定癌症类型相关的抗原。例如，靶向的癌症包括白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括髓细胞性、早幼髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

因此，设想的CAR通常将具有与铰链结构域(直接)偶联的细胞外结合结构域的结构，该铰链结构域与跨膜结构域(直接)偶联，该跨膜结构域又与FcεRIγ信号传导结构域(直接)偶联。在还进一步的设想方面，除了或替换FcεRIγ信号传导结构域之外，设想的CAR还可以包括一个或多个信号传导结构域，并且特别地，设想的信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域和CD28信号传导结构域。例如，设想的CAR因此可以包括与铰链结构域(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的CD8铰链，其由SEQ ID NO：5编码)偶联的任何结合结构域(例如，具有SEQ ID NO：11)，该结合结构域依次与跨膜结构域(例如，SEQ ID NO：6所示的CD28 TM，其由SEQ ID NO：7编码)偶联，该跨膜结构域与信号传导结构域(例如，SEQ ID NO：1所示的FcεRIγ信号传导结构域，其由SEQ ID NO：1编码，或SEQ ID NO：13所示的CD28信号传导结构域，或SEQ ID NO：14所示的4-1BB信号传导结构域，或SEQ ID NO：15所示的CD3ζ信号传导结构域)偶联。

关于设想的CAR的构建，应该认识到，CAR可以以下所述的多种方式进行工程改造，例如，WO 2014/039523；US 2014/0242701；US 2014/0274909；US 2013/0280285和WO 2014/099671，其各自通过援引以其全文并入本文。

在还进一步设想的方面，和如上所示，NK细胞可以进一步经基因修饰以表达一种或多种细胞因子，从而提供选择标志物，其中细胞因子和CAR以相同的重组核酸编码和/或使重组细胞不依赖于外源IL-2。因此，在本发明主题的一些方面，NK-92细胞经修饰以表达至少一种细胞因子。特别地，至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在优选的实施例中，该细胞因子是IL-2或其变体，并且特别优选的变体包括内质滞留信号(例如，SEQ ID NO：21所示的人IL-2，或具有SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33所示的ER滞留信号)。例如，克隆IL-2基因并用将IL-2引导至内质网的信号序列表达。这使IL-2的表达足以进行自分泌活化，但不会在细胞外释放IL-2(例如，Exp Hematol.[实验血液学]2005Feb；33(2)：159-64)。替代性地，细胞因子(且特别是IL-15)的表达还可以使得细胞因子的表达量足以提供自分泌生长信号至重组细胞，但也允许至少一些表达的IL-15从细胞中释放，从而提供免疫刺激信号。例如，可以使用同时包含信号肽和内质滞留序列的人IL-15序列来实现此类表达。内质滞留的IL-15的示例性DNA和蛋白序列分别如SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：50所示。

如预期，设想的细胞还可以表达***基因。术语“***基因”是指允许对表达***基因的细胞进行负选择的转基因。***基因被用作安全***，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀灭。如果重组基因引起导致不受控的细胞生长的突变，或者细胞本身能够进行此类生长，则这是符合预期的。已经鉴定出许多***基因***，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因。典型地，***基因编码的蛋白质对细胞没有不良影响，但是在存在特定化合物的情况下会杀灭细胞。因此，***基因典型地是***的一部分。

在一个实施例中，该***基因在NK-92细胞中有活性。在一个实施例中，***基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如，tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦杀灭表达TK蛋白的细胞。在另一个实施例中，***基因是胞嘧啶脱氨酶，其在5-氟胞嘧啶存在下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等人“Cytosine deaminase adenoviralvector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells：a potential purging method forautologous transplantation.[胞嘧啶脱氨酶腺病毒载体和5-氟胞嘧啶在污染造血细胞时选择性地减少乳腺癌细胞100万倍：自体移植的潜在清除方法]”Blood.[血液]1998年7月15日；92(2)：672-82。在进一步的实施例中，该***基因是细胞色素P450，其在异环磷酰胺或环磷酰胺存在下有毒。参见，例如，Touati等人“A suicide gene therapy combiningthe improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development ofan anti-tumor immune response.[***基因疗法联合环磷酰胺肿瘤细胞毒性的改善和抗肿瘤免疫应答的进展]”Curr Gene Ther.[当前基因疗法]2014；14(3)：236-46。在又另一实施例中，该***基因是iCasp9。Di Stasi，(2011)“Inducible apoptosis as a safetyswitch for adoptive cell therapy.[诱导性凋亡作为过继细胞治疗的安全开关]”NEngl J Med[新英格兰医学杂志]365：1673-1683。另参见Morgan，“Live and Let Die：ANew Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic[生或死：一种新***基因疗法进入临床]”Molecular Therapy[分子疗法](2012)；20：11-13。iCasp9在小分子AP1903的存在下诱导凋亡。AP1903是生物学惰性的小分子，在临床研究中已显示出良好的耐受性，并已用于过继细胞疗法背景中。

当然，应当注意，所有重组蛋白均可以从单个重组序列表达。然而，通常优选在表达多个重组序列(例如，CAR、CD16、细胞因子)的情况下，编码区可以排列在具有至少两个或至少三个编码重组蛋白的编码区的多顺反子单元中。例如，可以将三顺反子DNA或RNA构建体(例如，用FcεRIγ信号传导结构域、CD16^158V和IL-2^ER或IL15^ER编码CAR)转染进入NK或NK-92细胞。因此，可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因工程转化为表达载体。在将多个转基因***细胞中的情况下，可以将转基因工程改造进入相同的表达载体或不同的表达载体中。在一些实施例中，用编码待表达的转基因蛋白的mRNA转染细胞。在一些实施例中，细胞转染编码待表达的转基因蛋白的DNA。可以使用本领域已知的任何转染方法将转基因、mRNA和DNA引入NK-92细胞，包括但不限于感染、病毒载体、电穿孔、脂转染、核转染或“基因枪”。

显而易见的是，设想的基因修饰的细胞可用于治疗各种疾病，并且是其中患病细胞呈现疾病特异性或疾病相关抗原的多种癌症和病毒感染。因此，诸位发明人设想了使用本文所述的修饰的NK或NK-92细胞治疗患者的方法。在一实施例中，该患者患有癌症(例如，肿瘤)，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对来自癌症或肿瘤的细胞表面表达的抗原具有特异性的CAR。在一个实施例中，该患者患有病毒感染，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对已被所述病毒感染的细胞表面上表达的抗原具有特异性的CAR。在一个实施例中，患者患有细菌感染，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对引起感染的细菌细胞表面上表达的抗原具有特异性的CAR。

可以按绝对数量的细胞将设想的修饰的NK或NK-92细胞施用于个体。例如，可以施用于个体约1000个细胞/注射至高达约100亿个细胞/注射，诸如每次注射约、至少约、或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³(等)个修饰的NK-92细胞，或任何两个数值之间的任何范围(含端点)。在其他实施例中，修饰的NK-92细胞可以按相对数量的细胞施用于个体，例如，可以施用于所述个体每千克个体约1000个细胞至高达约100亿个细胞，诸如每千克个体约、至少约、或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³(等)个修饰的NK-92细胞，或任何两个数值之间的任何范围(含端点)。在其他实施例中，总剂量可以按m²的身体表面积进行计算，包括每m²约1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷，或任何两个数值之间的任何范围(含端点)。人平均为约1.6至约1.8m²。在优选的实施例中，向患者施用约10亿至约30亿的NK-92细胞。

修饰的NK-92细胞，和任选的其他抗癌或抗病毒剂可以施用于患有癌症或感染病毒的患者一次，或者可以施用多次，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或任何两个数值之间的任何范围(含端点)。

在一个实施例中，在修饰的NK-92细胞表达***基因的情况下，向患者施用引发修饰的NK-92细胞死亡的药剂。在一个实施例中，在施用足以使NK-92细胞杀伤靶细胞的修饰的NK-92细胞之后的时间点施用药剂。

在一个实施例中，在向患者施用前，对修饰的NK-92细胞进行辐照。NK-92细胞的辐照，例如，如美国专利号8,034,332所述，其通过援引以其全文并入本文。在一个实施例中，辐照尚未经工程改造以表达***基因的修饰的NK-92细胞。

此外，应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。

实例

以下实例仅用于说明目的，不应解释为对本发明要求权益的限制。本领域技术人员可以使用多种替代技术和程序，它们将类似地允许人们成功地执行预期的发明。

实例1：CAR mRNA制备

用计算机方法设计编码图1中示意性描绘的CD19CAR每种变体的DNA序列，从头合成，然后亚克隆至mRNA表达载体pXT7(GeneArt，生命技术公司)中。通过经SalI限制酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))消化将10微克(μg)质粒线性化，并根据生产商的说明使用QIAgen凝胶纯化试剂盒(QIAgen公司)进行纯化。

根据生产商的说明，使用T7 mMessage mMachine Ultra转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，将线性化的DNA用作体外合成mRNA的模板。该试剂盒包括聚腺苷酸化延伸步骤，该步骤可增加mRNA的polyA尾的长度，从而增强其体内稳定性。

制备六个CD19CAR变体的mRNA，并制备绿色荧光蛋白(GFP)mRNA作为阴性对照。所有CD19CAR多肽变体均包含细胞外结构域，其包含抗CD19 scFv区(αCD19-scFv)(SEQ IDNO：11)、来自CD8的铰链区(SEQ ID NO：3或NO：4)和来自CD28的跨膜结构域(SEQ ID NO：6，由SEQ ID NO：7编码)。CD19CAR的胞内结构域如下，并如图1示意性显示：CAR 3z包含CD3ζ信号传导结构域；CAR FcRe含有FcεRIγ信号传导结构域(SEQ ID NO：1)；CAR 28_3z包含与CD3ζ信号传导结构域融合的CD28信号传导结构域；CAR BB_3z包含与CD3ζ信号传导结构域融合的4-1BB信号传导结构域；CAR 28_BB_3z包含与4-1BB信号传导结构域融合的CD28信号传导结构域，该4-1BB信号传导结构域与CD3ζ信号传导结构域融合；CAR BB_3z_28包含与CD3ζ信号传导结构域融合的4-1BB信号传导结构域，该CD3ζ信号传导结构域与CD28信号传导结构域融合。

更特别地，图1的具有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR具有SEQ ID NO：16(人)所示的核酸序列。具有FcεRIγ信号传导结构域核酸的第一代CAR具有SEQ ID NO：12所示的核酸序列和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。具有CD28/CD3ζ信号传导结构域的第二代CAR具有SEQ ID NO：17所示的核酸序列，并且具有4-1BB/CD3ζ信号传导结构域的第二代CAR具有SEQ ID NO：18所示的核酸序列。具有CD28/4-1BB/CD3ζ信号传导结构域的第三代CAR的核酸序列具有SEQ ID NO：19所示的核酸序列，并且具有4-1BB/CD3ζ/CD28信号传导结构域的第三代CAR具有SEQ ID NO：20所示的核酸序列。具有FcεRIγ信号传导结构域核酸的进一步第一代CAR具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。

实例2：CD19CAR mRNA进行NK-92细胞电穿孔

NK-92细胞在补充5％人AB血清(Valley生物医药公司，弗吉尼亚州温彻斯特)和500IU/mL IL-2(Prospec公司，以色列雷霍沃特)的X-Vivo10培养基(龙沙公司，瑞士巴塞尔)中生长。使用Neon^TM电穿孔装置(生命技术公司，加利福利亚州卡尔斯巴德)，按照生产商的NK-92细胞参数(1250V，10ms，3脉冲)，并按100μl体积中每10⁶个细胞5μg mRNA对细胞进行mRNA电穿孔。将电穿孔的细胞在培养基(与上述相同)中维持20小时(h)。

使用标记eF660(eBioscience公司，加利福尼亚州圣地亚哥)的抗scFv抗体，通过流式细胞术确定NK-92细胞表面的CD19CAR表达。图2A示出了所示的CD19CAR在NK-92细胞群中的表达％。图2B示出了用所示的CD19CAR电穿孔的细胞的荧光强度中位值(MFI，减去背景)。从图2A和2B可以看出，CAR FcRe出乎意料地具有最高百分比的在细胞表面表达CD19CAR的细胞(75.2％)，以及最高MFI(重组细胞上表达的CAR量)，其次是28_3z(61.7％)。

实例3：表达CD19CAR的NK-92细胞对癌细胞系的细胞毒性

使用基于流式的体外细胞毒性测定，在电穿孔后20小时检测表达CAR的NK-92细胞在体外靶向癌细胞的功效。将效应细胞(表达CD19CAR或GFP的NK-92)与PKHGL67标记的(西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)靶细胞(K562；或SUPB15、B-ALL、CD19⁺)在96孔板中以不同的效靶比(5∶1到0.3∶1)混合，并于37℃下孵育4h。将碘化丙啶(PI)(西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)添加到细胞中，并使用Attune流式细胞仪(生命技术公司，加利福利亚州卡尔斯巴德)在2小时内分析样本。细胞毒性由PKH阳性靶细胞群中PI阳性细胞的％确定。

图3A和3B中提供了示例性结果。如图3A所示，无论CD19CAR表达如何，NK-92细胞均有效杀伤K562细胞。因此，应注意重组细胞未失去细胞毒性。相反，表达GFP的NK-92细胞在杀伤癌细胞系SUP-B15方面效率低下。SUP-B15是CD19阳性并对NK-92介导的细胞毒性具有抗性的急性淋巴细胞白血病细胞系。与对照(表达GFP的NK-92细胞)相比，检测的任何CD19CAR的表达提供了对SUP-B15细胞系的细胞毒性活性增加，这可以很容易地从图3B中获得。出乎意料地，具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR表现出与第二代和第三代CAR相似或甚至更好的细胞毒性。由于FcεRIγ信号传导结构域仅作为单一单元而不与其他信号传导结构域结合，因此这种发现特别出乎意料。当用于CAR T细胞中时，此类排列不能提供预期的靶向细胞毒性。

脱粒是从NK-92细胞中的分泌性颗粒中释放裂解蛋白(例如，穿孔素和颗粒酶)所需的关键步骤。通过NK-92识别靶细胞以启动脱粒。为了检测构建体中的脱颗粒作用，将效应细胞(NK-92)与未标记的靶细胞(SUP-B15)在96孔板中以不同的效靶比(5∶1至0.3∶1)混合，并进行将抗CD107a(FITC-缀合，BD Pharmingen公司，加利福尼亚州圣何塞)添加到每个孔中。将培养板于37℃下在CO₂培养箱中温育，并在1小时后将莫能菌素(高尔基-终止(Golgi-stop))添加至孔中。将培养板于37℃下再温育3h，并通过流式细胞仪(Attune，生命技术公司，加利福利亚州卡尔斯巴德)分析样本。通过将效应子+靶标样本中的单独CD107a阳性％减去在NK-92细胞中CD107a阳性％来确定脱颗粒百分比，图4提供了示例性结果。

实例4.表达CD19CAR的NK-92细胞的表面表达和对癌细胞系的细胞毒性。

发明人定量多种CAR构建体的表达水平以研究表达随时间的持久性。从图5的结果可以看出，用不同的CD19 CAR构建体转染的NK-92细胞在细胞表面上表达可检测水平的各CAR长达72小时。出乎意料的是，并且如从图5中容易看出，包含Fc-ε胞质信号传导结构域的CAR构建体具有显著更高的表达持续时间。值得注意的是，还观察到除FcεRIγ信号传导结构域之外还添加一个或多个信号传导结构域(例如，在本文呈现的实例中为CD28信号传导结构域)未不利地影响表达的持续时间。实际上，在具有FcεRIγ信号传导结构域和CD28信号传导结构域的CAR中，表达持续时间甚至随时间进一步增加，而具有CD3-ζ信号传导结构域的CAR构建体在72小时甚至更早时表达显著降低。

而且，从图5的结果还可以看出，具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR构建体的表达量最初也显著高于具有CD3-ζ信号传导结构域的相应构建体。

然后，发明人开始检测具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR构建体的延长和更强的表达是否还将转化为更高的细胞毒性率。图6中描绘了在24小时和48小时时对SUPB15 CD19⁺细胞进行检测的示例性结果。从结果可以看出，所有检测的CAR构建体在24小时时均显示出相当的(最大)细胞毒性。但是，在48小时时，CD19/CD3-ζ显示出明显的细胞毒性下降。值得注意的是，基于Fc-ε的CAR在电穿孔后48小时仅显示出极小的细胞毒活性下降，这与图5的延长表达结果相似。因此，应当认识到，具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR构建体表现出细胞毒性延长，这被认为具有实质性的临床获益。

有利地，三顺反子mRNA构建体能够产生大量具有优异功能活性的预期CAR。此类构建体在CAR表达应该是瞬时的情况下特别有益。相反地，以下针对靶向CAR构建体和相关功能数据的实例来自线性化DNA载体构建体，它们允许转染细胞以将线性化DNA整合到基因组中，从而为特定CAR的非瞬时表达提供了途径。

实例5.三顺反子表达盒示意图。

图7意性地示出了由代表性的三顺反子表达盒产生的DNA和蛋白产物。图8示出了具有表达盒的质粒的线性化形式。

SEQ ID NO：28是pNEUKv1-CD19CAR_CD16(158V)_ERIL-2载体的一部分的示例性核酸序列，其是类似于图8的构建体。SEQ ID NO：29是代表CD19CAR_P2A_CD16(158V)蛋白的示例性三顺反子蛋白(类似于图7)。类似地，SEQ ID NO：31是密码子优化的CD33ScfV-P2A-CD16-IRES-erIL2三顺反子序列的示例性核酸序列，而SEQ ID NO：32示出了CD33CAR-P2A-CD16肽。

制备的包括SEQ ID NO：24的还进一步构建体是CD19K_跨膜和信号传导结构域的示例性氨基酸序列，而SEQ ID NO：26是15AD23HC_1805843_CD19K_Eps(879-1319)的示例性核酸序列，且SEQ ID NO：27是15AD23HC_1805843_CD19K_Eps的示例性核酸序列，其不包括CD28跨膜结构域。

实例6.表达CD33-CAR的NK-92细胞对癌细胞系的细胞毒性

提供以下实例证明对通过对照(未修饰的)NK-92细胞的特异性裂解(细胞毒性)具有抗性的细胞可以被表达CAR的NK-92细胞有效地杀死。在该实例中，细胞是表达CD33的THP-1细胞。修饰NK-92细胞以表达具有与CD33特异性结合的胞外结合结构域以及FcεRIγ信号传导结构域的CAR，如图8和9所示。

图9A提供了体外数据，显示CD33阳性(CD33+)的THP-1细胞对通过对照NK-92(aNK)细胞的细胞毒性(特异性裂解)相对地具有抗性，而当THP-1细胞与表达特异性结合CD33的CAR的NK-92细胞(CD33-CAR/NK-92细胞)一起培养时存在高百分比的特异性裂解。而且，应该指出的是，表达CAR的修饰的NK-92细胞在相对较低的效靶比下表现出杀伤作用。图9B提供了体外数据，其显示对照aNK细胞和CD33-CAR/NK-92细胞均有效杀死K562细胞。

实例7：具有FcεRIγ信号传导结构域的HER2-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗HER2scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的HER2-CAR具有SEQ IDNO：37所示的核酸序列。

使用标准的基于CalceinAM的细胞毒性测定法检测如此构建的HER2.CAR-t-haNK细胞对BT-474细胞的功能，示例性结果如图10所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的HER2.CAR-t-haNK细胞表现出对BT-474靶细胞具有显著细胞毒性。

在进一步的实验中，本发明人证明了HER2.CAR在HER2.CAR-t-haNK细胞中的表达，如图36所示。HER2.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性如图37所示，而CAR介导的细胞毒性结果如图38所示。图39的图示出了HER2.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性数据。

实例8：具有FcεRIγ信号传导结构域的CD30-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CD30 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD30-CAR具有SEQID NO：38所示的核酸序列。

图46的结果证明了CD30-CAR的表达，而图47示出了重组细胞的自然细胞毒性结果。图48的结果证明了CAR介导的细胞毒性，而图49的数据中示出了ADCC的示例性结果。

实例9：具有FcεRIγ信号传导结构域的EGFR-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗EGFR scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的EGFR-CAR具有SEQID NO：39所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的EGFR.CAR-t-haNK细胞对A-549细胞的功能，示例性结果如图14所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的EGFR.CAR-t-haNK细胞表现出对A-549靶细胞具有显著细胞毒性。图31示出了EGFR-CAR在EGFR.CAR-t-haNK细胞中的表达，而自然细胞毒性结果如图32所示。CAR介导的EGFR.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果如图33和图34所示，而EGFR.CAR-t-haNK细胞的ADCC的结果如图35所示。

实例10：具有FcεRIγ信号传导结构域的IGF1R-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗IGF1R scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的IGF1R-CAR具有SEQID NO：40所示的核酸序列，并且编码IGF1R-CAR、CD16和IL-2^ER的三顺反子构建体具有SEQID NO：53所示的核酸序列，其也在图61中示例性示出。

与第二代CAR(CD28/CD3z)相比，使用标准细胞毒性测定法尖刺如此构建的IGF1R.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的功能，示例性结果如图18所示。从数据中可以很容易地看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的IGF1R.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231靶细胞表现出显著的靶特异性细胞毒性，这与第二代CAR的细胞毒性相当。

实例11：具有FcεRIγ信号传导结构域的CD123-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CD123 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD123-CAR具有SEQID NO：41所示的核酸序列。图44示出了表达CD123-CAR的重组NK细胞的CAR介导的细胞毒性数据，图45示出了表达CD123-CAR的重组NK细胞的ADCC的示例性数据。

实例12：具有FcεRIγ信号传导结构域的PD-L1-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗PD-L1 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的PD-L1-CAR具有SEQID NO：42所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的PD-L1.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15.PD-L1⁺细胞的功能，示例性结果如图12所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的PD-L1.CAR-t-haNK细胞表现出对SUP-B15.PD-L1⁺靶细胞具有显著细胞毒性。

还使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的PD-L1.CAR-t-haNK细胞对U251细胞的功能，示例性结果与未转染的haNK细胞一起如图13所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的PD-L1.CAR-t-haNK细胞表现出对U251靶细胞具有靶标特异性和显著性的细胞毒性，而haNK对照细胞对相同的U251细胞基本上没有细胞毒性。

在对PD-L1的靶细胞特异性的进一步实验中，诸位发明人使用PD-L1.CAR-t-haNK细胞以及haNK细胞作为一般细胞毒性的对照，检测了几种PD-L1阳性肿瘤细胞系。从图19可以很容易地看出，PD-L1.CAR-t-haNK细胞对多种肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌、泌尿生殖***肿瘤细胞以及头颈部小细胞癌、脊索瘤)。值得注意的是，PD-L1.CAR-t-haNK细胞杀伤大多数(＞85％)细胞所需的时间少于4小时，而对照haNK细胞则需要12小时以上。

图20进一步说明了与各种其他对照细胞(如所示的haNK细胞)相比，PD-L1.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。从数据中可以看出，在5∶1的E∶T比下，西妥昔单抗改善PD-L1.thaNK对MDA-MB-231的溶解，并且通过加入西妥昔单抗和a-PD-L1可改善haNK活性。与haNK和haNK+西妥昔单抗相比，普通PD-L1.thank具有更好的细胞毒性活性，并且普通PD-L1.thank的杀伤与haNK+PD-L1抗体相当，但PD-L1.thank+西妥昔单抗的表现优于haNK+西妥昔单抗和haNK+PD-L1。在1∶1的E∶T比下，使用或未使用西妥昔单抗的PD-L1.thaNK活性相同，并且PD-L1.thaNK明显优于通过hank的内在和ADCC介导的杀伤。通过加入西妥昔单抗和a-PD-L1改善hank.haNK活性。

在进一步的实验中，诸位发明人证明PD-L1.CAR在PD-L1.CAR-t-haNK细胞中的表达，如图40所示。PD-L1.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性如图41的结果所示，而CAR介导的细胞毒性的结果如图42所示。PD-L1.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性数据如图43所示。

实例13：具有FcεRIγ信号传导结构域的CD33-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗HER2 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD33-CAR具有SEQID NO：43所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的CD33.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的功能，示例性结果如图11所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD33.CAR-t-haNK细胞表现出对THP-1靶细胞具有显著细胞毒性。描述CD33CAR在NK-92细胞中强表达的进一步数据如图27所示。图28示出了CD33.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的自然细胞毒性，图29描述了CAR介导的对THP-1细胞的细胞毒性结果。图30进一步示出了CD33.CAR-t-haNK细胞联合利妥昔单抗对SUP-B15CD19^KO/CD20⁺的ADCC的结果。

实例14：具有FcεRIγ信号传导结构域的gp120-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗gp120 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的gp120-CAR具有SEQID NO：44所示的核酸序列。

诸位发明人进一步证明，如此产生的细胞表达大量的CD16和gp120CAR，如图53所示。GP120与gp120CAR的结合如图54所示，相对于非重组aNK细胞作为阴性对照。如此产生的细胞的自然细胞毒性如图55所示，而相应的ADCC数据如图56所示。

实例15：具有FcεRIγ信号传导结构域的B7-H4-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗B7-H4 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的B7-H4-CAR具有SEQID NO：45所示的核酸序列。

实例16：具有FcεRIγ信号传导结构域的BCMA-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗BCMA scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的BCMA-CAR具有SEQID NO：46所示的核酸序列。

如图50的示例性结果所示，证实了BCMA表达，并且如图51所示，证明了CAR介导的对靶细胞的细胞毒性。相似地，从图52的结果可以看出，使用利妥昔单抗作为针对靶细胞的抗体，重组细胞具有显著的ADCC。

实例17：具有FcεRIγ信号传导结构域的GD2-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗GD2scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的GD2-CAR具有SEQ IDNO：47所示的核酸序列。

实例18：具有FcεRIγ信号传导结构域的FAP-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗FAP scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的FAP-CAR具有SEQ IDNO：48所示的核酸序列。FAP-CAR的表达如图57的数据所示，并且FAP.CAR对靶细胞的细胞毒性在图58的结果中证明。

实例19：具有FcεRIγ信号传导结构域的CSPG-4-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CSPG-4 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CSPG-4-CAR具有SEQ ID NO：52所示的核酸序列。通过FACS分析确认了CSPG-4-CAR的表达，并且示例性结果如图59所示。因此，构建的细胞也表现出显著的细胞毒性，如图60的示例性数据所示。

实例20：具有FcεRIγ信号传导结构域的CD20-CAR

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CD20 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD20-CAR具有SEQID NO：51所示的核酸序列。

CD20 CAR在NK-92细胞中的表达如图25的结果所示。可以很容易地看出，CD20.CAR在绝大多数重组细胞中强表达(如上所述，连同线性化DNA中的CD16)。图26描述了CD20.CARNK细胞对CD20⁺靶细胞的细胞毒性的示例性结果。

实例21：具有FcεRIγ信号传导结构域的CD19-CAR

在该实例中，诸位发明人使用了如上所述的具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CD19 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜域偶联，该CD28跨膜域与FcεRIγ信号传导偶联，以及将NK-92细胞转染线性化DNA进行功能检测。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的CD19.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的功能，以确定一般细胞毒性，示例性结果如图15所示。可以容易地看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD19.CAR-t-haNK细胞表现出对K562靶细胞具有显著细胞毒性。在另一组实验中，与aNK细胞作为对照相比，使用SUP-B15细胞确定了靶标特异性细胞毒性，示例性结果如图16所示。再次，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD19.CAR-t-haNK细胞表现出显著的靶特异性细胞毒性。在另一组实验中，使用赫赛汀和利妥昔单抗作为抗体，使用SKBr3细胞测定靶标特异性ADCC，结果如图17所示。同样，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD19.CAR-t-haNK细胞表现出显著的抗体和靶标特异性ADCC。

图21示例性地示出了在NK-92细胞中相对于对照，来自线性化DNA(其包括编码CD16和IL-2^ER的片段)的CD19.CAR表达。从图25可以看出，在绝大多数细胞中表达非常强。CD19.CAR t-haNK细胞对K562细胞的自然细胞毒性和对SUP-B15细胞的靶向细胞毒性的其他结果如图22和图23所示。CD19.CAR t-haNK细胞对SUP-B15CD19^KO/CD20⁺细胞的ADCC的示例性其他结果如图24所示。

实例22：NSG小鼠异种移植模型中靶向PD-L1的t-haNK细胞的抗肿瘤活性

将MDA-MB-231和HCC827用作PDL1阳性的经验证的异种移植模型，并评价PDL1 t-haNK细胞在不同制剂、给药水平和给药途径(IV和IT)中的功效。

动物：动物类型：NSG小鼠(JAX)，雌性，9-10周龄；MDA-MB-231模型的动物数：24(新鲜细胞)，并用于HCC827模型：24(新鲜细胞)+6(冷冻保存的细胞)。肿瘤模型使用以下细胞系：MDA-MB-231(人乳腺腺癌)和HCC827(人肺腺癌)，接种途径为皮下接种至双侧腋下，MDA-MB-231的平均肿瘤负载约为100mm3，HCC827约为75-80mm3。

处理品：新鲜配制的抗PD-L1 t-haNK，经辐照，其浓度为：5E7个细胞/mL或2E7个细胞/mL；溶媒对照品是X-VIVO^TM10培养基；如前所述，施用方法是所述的IV和IT。IV NK给药的剂量为200μL(新鲜制备的细胞)中1E7个细胞/剂量，200μL(冷冻保存的细胞)中4E6个细胞/剂量；对于IT NK给药(仅新鲜细胞)的剂量为50μL中2.5E6个细胞/肿瘤。连续4周每周两次给药频率(M/Th或T/F)，给药的第一天定义为第1天。

MDA-MB-231的研究设计在下表3中(该研究在第27天结束，当时A、C和D组中的一些动物的肿瘤总体积＞2000mm3)

表2

HCC827的研究设计在下表4中(该研究在第29天结束，当时将存活的动物重新计划并转移到另一研究中)。

表3

结果：新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞(1E7个细胞/剂量)在MDA-MB-231和HCC827模型中均导致明显且持久的肿瘤生长抑制

MDA-MB-231：肿瘤停滞：第16天的TGI：84％(峰值)；第26天的TGI：79％(末次测量)。

HCC827：肿瘤消退：第16天的TGI：120％(峰值)；第29天的TGI：84％(研究结束)。

与X-VIVO^TM10培养基相比，冷冻保存的PDL1 t-haNK细胞(4E6个细胞/剂量)在抑制肿瘤生长方面也显示出统计学显著的功效：第26天的TGI：60％(峰值)，第29天的TGI：40％(研究结束)。

新鲜制备的PDL1 t-haNK细胞(1E7个细胞/剂量)还导致MDA-MB-231模型中转移性疾病负担显著降低，如下表5所示。

表4

溶媒组中肝中可见结节数为：29±9，PD-L1 t-haNK组：0(通过非配对双尾t检验，P＝0.0116)。

根据进行的实验，以1E7个细胞/剂量的水平进行新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞进IV给药，每周两次，连续4周，在两种检测的皮下异种移植模型中均显示出显著的抗肿瘤功效：该治疗使MDA-MB-231荷瘤小鼠的肿瘤停滞，其中在第16天的峰值TGI为84％，并且研究结束的TGI为79％(对于两个时间点，通过双因素方差分析(2-way ANOVA)，随后通过Tukey检验进行多重比较，P＜0.0001)，并且在HCC827模型中引起肿瘤消退，其中在第16天的峰值TGI为120％，并且研究结束的TGI为84％(P＜0.0001)。以4E6个细胞/剂量的给药水平每周两次静脉内(IV)给予冷冻保存的PD-L1 t-haNK细胞持续4周，在HCC827肿瘤模型中也显示出显著的治疗功效，达到60％的峰值TGI(P＜0.0001)，并且研究结束的TGI为40％(P＜0.01)。以2.5E6个细胞/剂量/肿瘤的给药水平每周两次鞘内(IT)给予新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞持续4周，有效抑制了HCC827肿瘤的生长，使得第20天的峰值TGI为70％，并且研究结束的TGI为49％(P＜0.001)。

观察到接受IV施用新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞(1E7细胞/剂量)的动物发生显著的不良反应。与新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞相反，冷冻保存的细胞(以较低的4E6个细胞/剂量水平给药)IV施用后对动物具有安全性。PD-L1 t-haNK细胞在两种皮下肿瘤模型中显示出显著的功效。冷冻保存的细胞以较低的4E6个细胞/剂量水平给药，在抑制肿瘤生长方面也显示出显著的功效，并被证明对动物具有安全性。

当然，应该认识到，对于本文提供的所有核酸序列，相应编码的蛋白也在本文明确的设想范围内。同样，对于所有氨基酸序列，相应的核酸序列也在本文设想的范围内(使用任何密码子)。

本说明书中引用的所有专利申请、出版物、参考文献和序列登录号均通过援引以其全文并入本文。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，并不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“一种(a)”、“一个(a)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。

应当理解，本文所述的所有数值(例如，pH、温度、时间、浓度、数量和分子量，包括范围)包括本领域普通技术人员遇到的测量值的正常变化。因此，描述的数值包括+/-0.1％至10％的变化，例如，+/-0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。应当理解，尽管并非总是明确地陈述，但是所有数字指称前均可以有术语“约”。因此，术语约包括+/-0.1％至10％的变化，例如，+/-0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，披露的所有范围包括该范围的端点，并且包括该范围的端点之间的所有值。本文披露的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围均可以容易被认为充分描述，并且可以将同一范围分解为至少相等的一半、三分之二、四分之一、五分之一、十分之几等。作为非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“最多”、“至少”等，包括所列举的数值，并且指的是可以随后细分为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员所理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包括其中事件或情况发生的例子以及其中事件或情况不发生的例子。

术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除未实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖性特征的其他要素。“由......组成”是指排除多于痕量的其他成分和所列举的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例在本披露内容的范围内。

如本文所用，“免疫疗法”是指单独或组合使用经修饰或未修饰的、自然存在的或经修饰的NK细胞或T细胞的NK-92细胞，无论其是单独使用还是组合使用，并能够在与靶细胞接触时诱导细胞毒性。

如本文所用，“自然杀伤(NK)细胞”是免疫***的细胞，其在没有特定抗原刺激的情况下杀伤靶细胞，并且根据主要组织相容性复合物(MHC)类别没有限制。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。NK细胞的特征在于存在CD56和不存在CD3表面标志物。

术语“内源性NK细胞”用于指源自供体(或患者)的NK细胞，与NK-92细胞系不同。内源性NK细胞通常是其中NK细胞已被富集的异质细胞群。内源性NK细胞可用于患者的自体或异体治疗。

术语“NK-92”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有(下文为“NK-92^TM细胞”)。永生化的NK细胞系最初获自患有非霍奇金淋巴瘤的患者。除非另有说明，否则术语“NK-92^TM”是指原始的NK-92细胞系以及已经修饰(例如，通过引入外源基因)的NK-92细胞系。NK-92^TM细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817；8,034,332；8,313,943；9,181,322；9,150,636；和公开的美国申请号10/008,955中，这些专利均通过全文引用的方式并入本文中，并且包括野生型NK-92^TM、NK-92^TM-CD16、NK-92^TM-CD16-γ、NK-92^TM-CD16-ζ、NK-92^TM-CD16(F176V)、NK-92^TMMI和NK-92^TMCI。NK-92细胞是本领域普通技术人员已知的，可从南特圭斯特公司容易获得此类细胞。

术语“aNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的未经修饰的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有(下文为“aNK^TM细胞”)。术语“haNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的未经修饰的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有，其经修饰以在细胞表面表达CD16(下文为“CD16+NK-92^TM细胞”或“

细胞”)。在一些实施例中，CD16+NK-92^TM细胞在细胞表面包含高亲和力CD16受体。术语“taNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的未经修饰的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有，其经修饰以表达嵌合抗原受体(下文为“CAR修饰的NK-92^TM细胞”或“

细胞”)。术语“t-haNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的未经修饰的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有，其经修饰以在细胞表面表达CD16并表达嵌合抗原受体(下文为“CAR修饰的CD16+NK-92^TM细胞”或“t-haNK^TM细胞”)。在一些实施例中，t-haNK^TM细胞在细胞表面表达高亲和力CD16受体。

“修饰的NK-92细胞”是指表达外源基因或蛋白，诸如Fc受体、CAR、细胞因子(诸如IL-2或IL-15)和/或***基因的NK-92细胞。在一些实施例中，修饰的NK-92细胞包含编码转基因的载体，诸如Fc受体、CAR、细胞因子(诸如IL-2或IL-15)和/或***基因。在一实施例中，修饰的NK-92细胞表达至少一种转基因蛋白。

如本文所用，“未辐照的NK-92细胞”是尚未进行辐照的NK-92细胞。辐照使细胞不能生长和增殖。可以预想，NK-92细胞将在治疗设备或患者治疗之前的其他时间点进行辐照，因为辐照和输注之间的时间应不超过四个小时，以保持最佳活性。替代性地，可以通过另一机制防止NK-92细胞增殖。

如本文所用，NK-92细胞的“失活”使它们不能生长。失活还可能与NK-92细胞的死亡有关。可以预想，NK-92细胞在治疗性应用中已有效清除与病理学有关的细胞的离体样本后，或在哺乳动物体内停留了足够长的时间以有效杀伤体内的许多或所有靶细胞，可能失活。作为非限制性实例，可以通过施用NK-92细胞对其敏感的失活剂来诱导灭活。

如本文所用，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞(诸如NK-92细胞)的活性时，旨在同义。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。不希望受理论的约束，认为NK-92细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。

针对细胞/细胞群的术语“杀灭”旨在包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操纵。

术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与称为Fc区的抗体的一部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。FcR根据其识别的抗体类型进行分类。例如，Fc-γ受体(FCγR)与IgG类抗体结合。FCγRIII-A(也称为CD16；SEQ ID NO：34)是与IgG抗体结合并活化ADCC的低亲和力Fc受体。FCγRIII-A通常在NK细胞上发现。NK-92细胞不表达FCγRIII-A。Fc-ε受体(FcεR)与IgE抗体的Fc区结合。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，将表达CAR的NK-92细胞靶向在细胞表面上表达某些抗原的细胞。可以对scFv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原和病毒特异性抗原。例如，CD19CAR识别CD19，CD19是某些癌症表达的细胞表面标志物。

如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。

如本文所用，术语“病毒特异性抗原”是指存在于病毒感染的细胞上但不能在与该病毒感染的细胞相同的组织或谱系衍生的正常细胞上检测到的抗原。在一个实施例中，病毒特异性抗原是在被感染细胞表面上表达的病毒蛋白。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，为胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，该位置可以为了比较的目的而被比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置数目的函数。

如本文所用，“同一性百分比”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中的位置来确定同一性百分比，该位置可以出于比较的目的进行比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置具有同一性。同源核苷酸序列包括编码本文所述核苷酸序列的自然等位基因变体和突变的序列。同源核苷酸序列包括编码除人以外的哺乳动物物种的蛋白的核苷酸序列。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换以及多肽具有相同结合和/或活性的氨基酸序列。在一些实施例中，同源氨基酸序列具有不超过15个、不超过10个、不超过5个或不超过3个保守氨基酸置换。在一些实施例中，核苷酸或氨基酸序列与本文描述的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少80％或至少85％或更大的同一性。在一些实施例中，核苷酸或氨基酸序列与本文描述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。可以通过使用默认设置的Gap程序(威Wisconsin序列分析软件包，用于UNIX的第8版，基因计算机集团，大学研究园，麦迪逊分校)来确定百分比同一性，该默认设置使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.[高等应用数学]，1981，2，482-489)。适用于确定序列同一性百分比的算法包括BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法分别如Altschul等人(Nuc.Acids Res.[核酸研究]25：3389-402，1977)，和Altschul等人(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-10，1990)所述。可通过国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件(参见ncbi.nlm.nih.gov网址)。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学学院学报]89：10915，1989)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4。

在一些实施例中，为在特定物种中表达而对核酸序列进行密码子优化，例如，可以为在人中表达而对小鼠序列进行密码子优化(由密码子优化的核酸序列编码的蛋白的表达)。因此，在一些实施例中，密码子优化的核酸序列与本文所述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少80％或至少85％或更大的同一性。在一些实施例中，密码子优化的核酸序列酸序列与本文所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

术语“表达”是指基因产物(例如，蛋白)的产生。当涉及表达时，术语“瞬时”是指多核苷酸未掺入细胞的基因组中。术语“稳定”在表示表达时是指将多核苷酸掺入细胞的基因组中，或使用阳性选择标志物(即由细胞表达的在某些生长条件下具有益处的外源基因)来维持表达转基因。

术语“细胞因子(cytokine或cytokines)”是指影响免疫***细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在优选的实施例中，细胞因子是IL-2。

如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当置于允许的细胞内时，例如通过转化过程，可以复制载体。载体可以在一种细胞类型(诸如细菌)中复制，但是在另一种细胞(诸如哺乳动物细胞)中复制的能力有限或没有。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与阳离子脂质复合的DNA，单独或与阳离子聚合物组合；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质复合物和颗粒，包含与阳离子聚合物缩合的DNA，诸如异质聚赖氨酸、定义长度的寡肽和聚乙烯亚胺，在某些情况下包含在脂质体中；以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的用途。在一个实施例中，该载体是病毒载体，例如，腺病毒。病毒载体是本领域熟知的。

如本文所用，术语“靶向的”在涉及蛋白表达时旨在包括但不限于将蛋白或多肽引导至细胞内或其外部的适当目的地。通常通过信号肽或靶向肽来实现靶向，该信号肽或靶向肽是多肽链中的氨基酸残基的一段。这些信号肽可以位于多肽序列内的任何位置，但通常位于N端。多肽也可以经工程改造为在C端具有信号肽。信号肽可以指导多肽进行细胞外切割，定位到质膜、高尔基体、内体、内质网和其他细胞区室。例如，在其C端具有特定氨基酸序列的多肽(例如，KDEL)被滞留在ER管腔中或转运回ER管腔。

如本文所用，术语“靶向”在指肿瘤的靶时是指NK-92细胞识别和杀伤肿瘤细胞(即靶细胞)的能力。在本文中，术语“靶向的”是指例如由NK-92细胞表达的CAR识别并结合由肿瘤表达的细胞表面抗原的能力。

如本文所用，术语“转染”是指核酸***细胞中。可以使用允许核酸进入细胞的任何方式进行转染。DNA和/或mRNA可以被转染进入细胞中。优选地，转染的细胞表达由核酸编码的基因产物(即蛋白)。

术语“***基因”是指允许阴性选择表达该转基因的细胞的转基因。***基因被用作安全***，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀伤。已识别多种***基因***，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E.coli)Deo基因(另见，例如，Yazawa K，Fisher W E，Brunicardi F C：Current progress in suicidegene therapy for cancer.[***基因治疗癌症的最新进展]World J.Surg.[世界手术杂志]2002年7月；26(7)：783-9)。在一个实施例中，***基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如，tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦杀灭表达TK蛋白的细胞。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞包含：

重组表达的细胞因子；

重组表达的CD16；以及

膜结合的重组表达的嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FcεRIγ信号传导结构域。

2.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该NK细胞是NK-92细胞。

3.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子是IL-2。

4.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子包含内质滞留序列。

5.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16是高亲和力CD16变体，该CD16变体与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并具有158V突变。

6.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该CAR包含细胞外结合结构域，该细胞外结合结构域包含scFv。

7.如权利要求6所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。

8.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD19。

9.如权利要求6所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。

10.如权利要求9所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒的抗原。

11.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

12.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该基因修饰的NK细胞包含三顺反子核酸序列，该三顺反子核酸序列包含编码该重组表达的细胞因子的序列、编码该重组表达的CD16的序列和编码该重组表达的CAR的序列。

13.如权利要求12所述的基因修饰的NK细胞，其中，该三顺反子核酸序列被整合至该NK细胞的基因组中。

14.一种重组核酸，该重组核酸包含：

编码细胞因子的第一序列部分；

编码CD16的第二序列部分；

编码CAR的第三序列部分，其中，该CAR包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的FcεRIγ信号传导结构域；并且其中，第一、第二和第三序列部分位于同一核酸上。

15.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该核酸是三顺反子RNA。

16.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该核酸是三顺反子DNA。

17.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该细胞因子是IL-2。

18.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该细胞因子包含内质滞留序列。

19.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该CD16是高亲和力CD16变体，该CD16变体与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并具有158V突变。

20.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该CAR包含细胞外结合结构域，该细胞外结合结构域包含scFv。

21.如权利要求20所述的重组核酸，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。

22.如权利要求20所述的重组核酸，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。

23.如权利要求14所述的重组核酸，其中，CAR包含CD8铰链结构域和/或其中，该CAR包含CD28跨膜结构域。

24.如权利要求14所述的重组核酸，其中，该FcεRIγ信号传导结构域与SEQ ID NO：1具有至少85％序列同一性。

25.一种重组细胞，该重组细胞包含如权利要求14-24中任一项所述的重组核酸。

26.如权利要求25所述的重组细胞，其中，该细胞是细菌细胞。

27.如权利要求25所述的重组细胞，其中，该细胞是自体NK细胞。

28.如权利要求27所述的重组细胞，其中，该NK细胞是任选地经基因修饰的NK-92细胞。

29.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如权利要求1-13所述的基因修饰的NK细胞中的任一种，从而治疗该癌症。

30.如权利要求29所述的方法，该方法进一步包括施用至少一种另外的治疗实体的步骤，该另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中，该癌症选自白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

32.一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如权利要求1-6或9-12所述的基因修饰的NK细胞中的任一种，从而治疗该病毒感染。

33.如权利要求32所述的方法，该方法进一步包括施用抗病毒药物的步骤。

34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中，向该患者施用约1 x 10⁸至约1 x10¹¹个细胞/m²患者体表面积。

35.权利要求1-13中任一项的基因修饰的NK细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。

36.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

37.如权利要求36所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域与SEQID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

38.如权利要求37所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域包含SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

39.如权利要求6所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

40.如权利要求39所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

41.如权利要求40所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

42.如权利要求41所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

43.如权利要求42所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19scFv，该抗CD19 scFv具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。

44.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该CAR进一步包含铰链结构域。

45.如权利要求44所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

46.如权利要求45所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

47.如权利要求46所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

48.如权利要求47所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

49.如权利要求48所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

50.如权利要求44所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

51.如权利要求50所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

52.如权利要求51所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

53.如权利要求52所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

54.如权利要求53所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

55.如权利要求1所述的基因修饰的NK细胞，其中，该CAR进一步包含跨膜结构域。

56.如权利要求55所述的基因修饰的NK细胞，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

57.如权利要求56所述的基因修饰的NK细胞，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

58.如权利要求57所述的基因修饰的NK细胞，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

59.如权利要求58所述的基因修饰的NK细胞，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

60.如权利要求59所述的基因修饰的NK细胞，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

61.如权利要求0所述的基因修饰的NK细胞，其中，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

62.如权利要求61所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域具有SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列，该铰链结构域具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，该跨膜结构域具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

63.如权利要求3所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子是IL-15。

64.如权利要求5所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

65.如权利要求64所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

66.如权利要求65所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

67.如权利要求66所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。

68.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD20。

69.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是NKG2D配体。

70.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CS1。

71.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是GD2。

72.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD138。

73.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是EpCAM。

74.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是HER-2。

75.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是EBNA3C。

76.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是GPA7。

77.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD244。

78.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CA-125。

79.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是MUC-1。

80.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是B7-H4。

81.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是ETA。

82.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是MAGE。

83.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CEA。

84.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD52。

85.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD30。

86.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是MUC5AC。

87.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是c-Met。

88.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是EGFR。

89.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是FAP。

90.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是WT-1。

91.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是PSMA。

92.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是NY-ESO1。

93.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CSPG-4。

94.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是IGF1-R。

95.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是Flt-3。

96.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD276。

97.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD123。

98.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是PD-L1。

99.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是BCMA。

100.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD33。

101.如权利要求14所述的核酸，其中，该FcεRIγ信号传导结构域与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

102.如权利要求101所述的核酸，其中，该FcεRIγ信号传导结构域与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

103.如权利要求102所述的核酸，其中，该FcεRIγ信号传导结构域包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

104.如权利要求14所述的核酸，其中，该CAR进一步包含细胞外结合结构域。

105.如权利要求104所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含单链可变片段(scFv)。

106.如权利要求105所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19 scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

107.如权利要求106所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19 scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

108.如权利要求107所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19 scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

109.如权利要求108所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19 scFv，该抗CD19 scFv与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

110.如权利要求109所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域包含抗CD19 scFv，该抗CD19 scFv具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。

111.如权利要求14所述的核酸，其中，该CAR进一步包含铰链结构域。

112.如权利要求111所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

113.如权利要求112所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

114.如权利要求113所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

115.如权利要求114所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

116.如权利要求115所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽具有SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列。

117.如权利要求111所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

118.如权利要求117所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

119.如权利要求118所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

120.如权利要求119所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

121.如权利要求120所述的核酸，其中，该铰链结构域包含多肽，该多肽具有SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。

122.如权利要求14所述的核酸，其中，该CAR进一步包含跨膜结构域。

123.如权利要求122所述的核酸，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

124.如权利要求123所述的核酸，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

125.如权利要求124所述的核酸，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

126.如权利要求125所述的核酸，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

127.如权利要求126所述的核酸，其中，该跨膜结构域包含多肽，该多肽具有SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列。

128.如权利要求14所述的核酸，其中，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

129.如权利要求128所述的核酸，其中，该细胞外结合结构域具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，该铰链结构域具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，该跨膜结构域具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并且该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

130.如权利要求17所述的核酸，其中，该重组表达的细胞因子是IL-15。

131.如权利要求19所述的核酸，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

132.如权利要求131所述的核酸，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

133.如权利要求132所述的核酸，其中，该重组表达的CD16与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

134.如权利要求133所述的核酸，其中，该重组表达的CD16具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。

Claims

1.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞包含：

重组表达的细胞因子；

重组表达的CD16；以及

膜结合重组表达的嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

3.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子包含IL-2或IL-15。

5.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的CD16是具有158V突变的高亲和力CD16变体。

6.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含scFv。

7.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。

8.如权利要求7所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD19、CD20、NKG2D配体、CS1、GD2、CD138、EpCAM、HER-2、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、MUC-1、B7-H4、ETA、MAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAP、WT-1、PSMA、NY-ESO1、CSPG-4、IGF1-R、Flt-3、CD276、CD123、PD-L1、BCMA或CD33。

9.如权利要求1-6中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。

11.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

12.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子、重组表达的CD16和重组表达的CAR由三顺反子重组核酸表达。

13.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组表达的细胞因子和/或重组表达的CD16由整合到NK细胞基因组中的重组核酸表达。

14.一种重组核酸，该重组核酸包含：

编码细胞因子的第一序列部分；

编码CD16的第二序列部分；

编码嵌合抗原受体(CAR)的第三序列部分，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域；并且

其中，该第一、第二和第三序列部分位于同一核酸上。

17.如权利要求14-16中任一项所述的重组核酸，其中，该细胞因子是IL-2或IL15。

18.如权利要求14-17中任一项所述的重组核酸，其中，该细胞因子包含内质滞留序列。

19.如权利要求14-18中任一项所述的重组核酸，其中，该CD16是具有158V突变的高亲和力CD16变体。

20.如权利要求14-19中任一项所述的重组核酸，其中，该细胞外结合结构域包含scFv。

23.如权利要求14-22中任一项所述的重组核酸，其中，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含CD8铰链结构域和/或CD28跨膜结构域。

24.如权利要求14-23中任一项所述的重组核酸，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

35.如权利要求1-13中任一项所述的基因修饰的NK细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。