CN112526014B - 一种金茵利胆口服液指纹图谱及其建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，具体步骤如下：(1)供试品溶液的制备：采用甲醇对金茵利胆口服液进行超声提取并过滤，得到供试品溶液；(2)指纹图谱的制作：采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测试，由得到的色谱数据生成金茵利胆口服液指纹图谱。本发明还提供相应的金茵利胆口服液指纹图谱。本发明运用指纹图谱分析技术，能体现金茵利胆口服液有效成分群的指纹信息，为提高金茵利胆口服液质量控制提供有效方法。

Description

一种金茵利胆口服液指纹图谱及其建立方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种金茵利胆口服液指纹图谱及其建立方法。
背景技术
金茵利胆口服液是兰州第二人民医院院内制剂，全方由金钱草、茵陈、黄连、虎杖、厚朴等十多味饮片组成，具有清热利湿、疏肝利胆、行气化瘀、理气活血、导滞止痛的功效，临床主要用于慢性胆囊炎、黄疸、胆道结石、胆道感染、胆囊炎等症的预防和治疗。金茵利胆口服液作为纯中药制剂，临床应用二十余年，在甘肃省有着较高的知名度，受到广大患者和医务工作者的好评。但目前尚未建立金茵利胆口服液指纹图谱。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种金茵利胆口服液指纹图谱及其建立方法。本发明通过建立金茵利胆口服液指纹图谱研究方法，最终将其应用于金茵利胆口服液的质量控制，更好的确保了临床用药的一致性，为全面控制其质量提供有效途径，也为同类研究提供参考。
本发明提供一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，所述建立方法的具体步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：采用甲醇对金茵利胆口服液进行超声提取并过滤，得到供试品溶液；
(2)指纹图谱的制作：采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测试，由得到的色谱数据生成金茵利胆口服液指纹图谱；
其中，所述高效液相色谱条件为：菲罗门双子星C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm、月神C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm、迪马二代钻石C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm或Waterssymmetry C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm；检测波长：254nm；进样量5-20μl，柱温：20-35℃，流速：0.9-1.1ml/min；以乙腈为A相，体积百分比0.1％磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱；
作为优选，所述高效液相色谱条件为：迪马二代钻石C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm；检测波长：254nm；进样量10μl，柱温：25℃，流速：1ml/min；以乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱。
作为优选，步骤(1)中，所述金茵利胆口服液的制备方法为：除大黄外，全方混合后加10-12倍重量水，浸泡30-45min，煎煮1小时，过滤，滤渣加大黄，加入8-10倍重量水，继续煎煮30-45min，滤过，合并煎煮液，减压浓缩至每毫升相当于原药材1.0g；
进一步优选，所述金茵利胆口服液的制备方法为：除大黄外，全方混合后加12倍重量水，浸泡30min，煎煮1小时，过滤，滤渣加大黄，加入10倍重量水，继续煎煮30min，滤过，合并煎煮液，减压浓缩至每毫升相当于原药材1.0g。
作为优选，步骤(1)中，所述过滤是采用微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm。
作为优选，步骤(1)中，所述甲醇的体积百分比浓度为50％。
作为优选，步骤(2)中，所述梯度洗脱程序为：
0-50min，流动性A为7％，流动性B为93％；
50-60min，流动性A由7％匀速变为33％，流动性B由93％匀速变为67％；
60-67min，流动性A由33％匀速变为100％，流动性B由67％匀速变为0％；
67min，流动性A为100％，流动性B为0％。
作为优选，还包括配制对照品溶液，所述对照品溶液的配制方法包括：分别取没食子酸对照品、绿原酸对照品、夏佛塔苷对照品、甘草苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草酸铵对照品，精密称定，加纯甲醇分别制成盐酸小檗碱40mg/ml、没食子酸15mg/ml、夏佛塔苷80mg/ml、柚皮苷75mg/ml、新橙皮苷80mg/ml，甘草酸氨70mg/ml、盐酸巴马汀40mg/ml、氯原酸70mg/ml、甘草苷70mg/ml溶液，即得。
本发明还提供一种金茵利胆口服液指纹图谱，以柚皮苷色谱峰为参照峰，所述金茵利胆口服液指纹图谱包括20个共有峰，具体如下：
1号峰相对保留时间为0.22，2号峰相对保留时间为0.33-0.34，3号峰相对保留时间为0.36-0.37，4号峰相对保留时间为0.44-0.45，5号峰相对保留时间为0.48-0.49，6号峰相对保留时间为0.52-0.53，7号峰相对保留时间为0.54-0.55，8号峰相对保留时间为0.62-0.64，9号峰相对保留时间为0.72-0.74，10号峰相对保留时间为0.84-0.86，11号峰相对保留时间为0.88-0.90，12号峰相对保留时间0.91-0.92，13号峰相对保留时间0.93-0.96，14号峰相对保留时间为1.00，15号峰相对保留时间1.02，16号峰相对保留时间为1.04-1.06，17号峰相对保留时间为1.12-1.14，18号峰相对保留时间为1.47，19号峰相对保留时间为1.49，20号峰相对保留时间为1.50-1.51。
作为优选，以柚皮苷色谱峰为参照峰，指纹图谱中的1号峰为没食子酸；16号峰为巴马汀，17号峰为小檗碱；19号峰为甘草酸。
作为优选，以柚皮苷色谱峰为参照峰，指纹图谱中的1号峰来自于枳壳、大黄、虎杖；6号峰主要来自于木香、茵陈；9号峰来自黄连；11号峰来自虎杖；12-17成分群来自黄连和枳壳，18-20成分群来自甘草。
本发明建立了金茵利胆口服液的高效液相指纹图谱，提高了金茵利胆口服液质量控制水平。本发明采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”进行相似度计算，确定了金茵利胆口服液指纹图谱研究方法。结果得到：各批次金茵利胆口服液共获得20个共有峰，超过总面积95％，所得指纹图谱方法学考察结果良好，采用色谱指纹图谱相似度评价软件，对指纹图谱进行相似度计算，其10批样品相似度均大于0.9。本发明运用指纹图谱分析技术，能体现金茵利胆口服液有效成分群的指纹信息，为提高金茵利胆口服液质量控制提供有效方法。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为金茵利胆口服液共有指纹峰及各共有指纹峰归属。
图2为十批金茵利胆口服液指纹图谱。
图3为金茵利胆口服液直接进样的色谱图。
图4为将金茵利胆口服液使用体积百分比为50％甲醇溶液除杂后的色谱图。。
图5为使用乙腈-纯水作为流动相时的色谱图。
图6为使用乙腈-体积百分比0.1％磷酸溶液作为流动相时的色谱图。
图7为使用国产乙腈的色谱图。
图8为使用进口乙腈的色谱图。
图9为使用安捷伦色谱柱的色谱图。
图10为使用岛津柱色谱柱的色谱图。
图11为使用迪马二代钻石C18柱的色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1仪器和试药
岛津20AT高效液相色谱仪；PDA检测器；电子分析天平；色谱柱：迪马二代钻石C18(250mm×4.6mm，5μm)；超声波清洗器，MiliQ超纯水仪。对照品：均购自中国药品生物制品检定研究院，供含量测定用。试剂：Milipore超纯水，进口乙腈(色谱纯)，甲醇、磷酸为国产色谱纯；金茵利胆口服液由兰州市第二人民医院制剂中心生产，批号(20190328,20190411,20190530,20190620,20190704,20190833,20190930,20191024,20191113,20191219)。
其中，金茵利胆口服液中的原料药如下：蒲公英，黄连，枳壳，川楝子，大黄，甘草，广金钱草，厚朴，虎杖，木香，山楂，桃仁，香附，茵陈，牡丹皮，神曲，麦芽，南五味子；矫味剂为单糖浆，防腐剂为苯甲酸钠。
2方法与结果
2.1指纹图谱测定条件建立
2.1.1对照品溶液的制备：分别取没食子酸对照品、绿原酸对照品、夏佛塔苷对照品、甘草苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加纯甲醇分别制成盐酸小檗碱40mg/ml、没食子酸15mg/ml、夏佛塔苷80mg/ml、柚皮苷75mg/ml、新橙皮苷80mg/ml，甘草酸铵70mg/ml、盐酸巴马汀40mg/ml、绿原酸70mg/ml、甘草苷70mg/ml溶液即得。
2.1.2金茵利胆口服液的生产制备：全方饮片，除大黄外，加12倍量水，浸泡30min，煎煮1小时，过滤，滤渣加大黄饮片，加入10倍量水，继续煎煮30min，滤过，合并煎煮液，减压浓缩至每毫升相当于原药材1.0g。
2.1.3供试品溶液的制备：
取不同批次金茵利胆口服液各5ml，分别置10ml容量瓶中，加体积百分比为50％的甲醇适量，超声处理15min，静置1h，用体积百分比为50％的甲醇定容至刻度，摇匀0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.4色谱条件安捷伦1260高效液相色谱仪联合PDA检测器，迪马二代钻石C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相：乙腈-体积百分比0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长：254nm；进样量10μl，柱温：25℃，流速：1ml/min。梯度洗脱程序见表1。
表1 HPLC流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002789165720000051
2.2HPLC指纹图谱分析
2.2.1共有特征峰及共有特征峰归属的确定取10批次金茵利胆口服液供试品溶液，同时取金茵利胆口服液各单味药材制成对照溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进行HPLC分析，确定各色谱峰来源，通过对照分析，有20个峰为10份供试液所共有，因此确定这20个峰为共有指纹峰(图1)。
通过与对照品溶液的特征峰进行比较，结果表明：1号峰来自于枳壳、大黄、虎杖；为没食子酸，2号峰主要来自于广金钱草、茵陈；3号峰主要来自于枳壳、茵陈；4号峰主要来自于厚朴、虎杖、木香；5号峰主要来自于牡丹皮、蒲公英；6号峰主要来自于木香、茵陈；7号峰主要来自于黄连、大黄、茵陈；8号峰主要来自于蒲公英、茵陈；9号峰来自黄连；10号峰来自大黄；11号峰来自虎杖；12、13、16、17号峰来自黄连，16号峰为巴马汀，17号峰为小檗碱；14号峰来自枳壳，为柚皮苷；15号峰来自枳壳、木香、茵陈；18、19、20号峰来自甘草。另外，12-17成分群来自黄连和枳壳，18-20成分群来自甘草，19号峰为甘草酸，与1、6、9、11共有峰组成金茵利胆口服液特征识别图谱。
图1为金茵利胆口服液共有指纹峰及各共有指纹峰归属。其中，S1金茵利胆口服液(S1为10批次金茵利胆口服液指纹图谱在相似度软件中生成的对照图谱)，S2蒲公英，S3黄连，S4枳壳，S5川楝子，S6大黄，S7甘草，S8广金钱草，S9厚朴，S10虎杖，S11木香，S12山楂，S13桃仁，S14香附，S15茵陈，S16牡丹皮，S17空白溶剂。
2.2.2指纹图谱相似度分析通过对10批金茵利胆口服液供试品溶液的HPLC指纹图谱进行分析(图2)，共标示出20个共有峰，在指纹图谱中14号峰为成分柚皮苷，其出峰位置较为居中，吸收相对较强，分离度较理想，因此以14号峰柚皮苷为参照峰，计算10批样品共有峰相对保留时间和相对峰面积(表2和表3)，相对保留时间RSD范围小于3％，符合指纹图谱的要求。20个共有指纹峰的保留时间分别为：1号峰保留时间为8.270min，2号峰保留时间为12.698min，3号峰保留时间为13.876min，4号峰保留时间为16.668min，5号峰保留时间为18.191min，6号峰保留时间为19.748min，7号峰保留时间为20.490min，8号峰保留时间为23.674min，9号峰保留时间为27.257min，10号峰保留时间为31.880min，11号峰保留时间为33.030min，12号峰保留时间34.234min，13号峰保留时间34.953min，14号峰保留时间为37.459min，15号峰保留时间38.229min，16号峰保留时间为39.205min，17号峰保留时间为42.073min，18号峰保留时间为54.937min，19号峰保留时间为55.659min，20号峰保留时间为56.081min。
运用中药指纹图谱相似度计算软件进行计算，相似度计算结果显示，10批金茵利胆口服液指纹图谱相似度均大于0.90(表4)，说明金茵利胆口服液制备工艺稳定。
图2为十批金茵利胆口服液指纹图谱。
表2十批金茵利胆口服液指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002789165720000061
Figure BDA0002789165720000071
表3十批金茵利胆口服液指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002789165720000072
表4十批金茵利胆口服液指纹图谱相似度数据
Figure BDA0002789165720000073
Figure BDA0002789165720000081
2.3方法学考察
2.3.1精密度实验：取金茵利胆口服液供试品溶液，按2.1.4中的色谱条件连续进样6次，进样量10μl，结果20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明仪器精密度良好。
表5精密度实验相对保留时间
Figure BDA0002789165720000082
表6精密度实验相对峰面积
Figure BDA0002789165720000083
Figure BDA0002789165720000091
2.3.2稳定性实验：取金茵利胆口服液同一供试品溶液，按2.1.4中的色谱条件，分别在0，8，12，24，48，96h进样，每次10μl。结果20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明24h内金茵利胆口服液供试品溶液稳定性较好。
表7稳定性实验相对保留时间
Figure BDA0002789165720000092
表8稳定性实验相对峰面积
Figure BDA0002789165720000093
Figure BDA0002789165720000101
2.3.3重复性试验：取同一批次的金茵利胆口服液药材各6份，按供试品溶液制备方法制备，取供试品溶液各10μl，分别用高效液相色谱仪依次进样分析，结果20个共有峰的相对保留时间的RSD均小于3％，相对峰面积的RSD均小于5％，表明该方法重复性较好。
表9重复性实验相对保留时间
Figure BDA0002789165720000102
表10重复性实验相对峰面积
Figure BDA0002789165720000103
Figure BDA0002789165720000111
本发明方法的优化试验：
1、提取溶剂的选择：金茵利胆口服液成品浓缩程度高，较为粘稠，本申请人采用一定比例甲醇提取的方式，进行适当的除杂，发现与成品原液直接进样比较，体积百分比为50％甲醇溶液能够较好的保留成品中各部分化学信息，且峰形有显著改善，因此采用体积百分比为50％甲醇进行除杂和提取。
图3为金茵利胆口服液直接进样的色谱图。
由图3可以看出，金茵利胆口服液中杂质太多造成峰形漂移且峰形不好。
图4为将金茵利胆口服液使用体积百分比为50％甲醇溶液除杂后的色谱图。。
由图4可以看出，使用体积百分比为50％甲醇溶液除杂后，峰形、峰数量(成分的种类)均较好。
2、通过对液相条件的摸索，发现以乙腈-体积百分比0.1％磷酸溶液作为水相能够明显改善峰形，而避免药典方法检测小檗碱等成分测定时使用缓冲盐溶液的方式(缓冲盐洗脱方式最大的弊端在于极易造成流路反复堵塞)。
图5为使用乙腈-纯水作为流动相时的色谱图。
由图5可以看出，使用乙腈-纯水作为流动相时，峰形稍差，缝宽稍宽。
图6为使用乙腈-体积百分比0.1％磷酸溶液作为流动相时的色谱图。
由图6可以看出，使用乙腈-体积百分比0.1％磷酸溶液作为流动相能够明显改善峰形。
3、甲醇作为有机相不能实现本品复杂成分的分离，国产乙腈在色谱图47.5分钟时出现顽固的鬼峰，严重影响分离，因此采用进口乙腈进行分析。
图7为使用国产乙腈的色谱图。
由图7可以看出，使用国产乙腈在色谱图47.5分钟时出现顽固的鬼峰。
图8为使用进口乙腈的色谱图。
由图8可以看出，使用进口乙腈可以较好地解决鬼峰问题。
4、色谱柱考察了菲罗门双子星C18柱(5μm，4.6×250mm)、月神C18柱(5μm，4.6×250mm)、迪马二代钻石C18柱(5μm，4.6×250mm)、Waters symmetry C18柱(5μm，4.6×250mm)、岛津C18柱(5μm，4.6×250mm)、安捷伦Eclipse plus C18柱(5μm，4.6×250mm)，发现安捷伦、岛津柱无法达到预期分离效果，其他色谱柱通过对液相条件的调整，均可达到满意的分离效果。从性价比的角度采用了迪马二代钻石C18柱。
图9为使用安捷伦色谱柱的色谱图。
由图9可以看出，安捷伦色谱柱对本品分离效果峰形尚可，40分钟左右分离度较差。
图10为使用岛津柱色谱柱的色谱图。
由图10可以看出，岛津色谱柱对本品难以分离，所得成分较少。
图11为使用迪马二代钻石C18柱的色谱图。
由图11可以看出，迪马二代钻石C18柱能达到较好的分离效果。
3讨论
个别成分的转归：金茵利胆口服液中A峰(见图1)并不直接由各饮片中溶出成分转移而来，其来源及转化关系需要进一步研究。桃仁饮片中B峰(见图1)，在生产金茵利胆口服液成品过程中几乎消失殆尽，现已初步证明其转化关系与成品中A峰无关，B峰所代表成分的转归仍需进一步研究。
金茵利胆口服液组方药材中六神曲、麦芽、川楝子等饮片对成品口服液化学成分的贡献，未能在HPLC联合PDA检测器图谱中有所体现，但这并不意味着该几味药不发挥作用，说明其药效成分不适合在文中所用的测试条件下进行检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述建立方法的具体步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：采用体积百分比浓度为50％的甲醇溶液对金茵利胆口服液进行超声提取并过滤，得到供试品溶液；
(2)指纹图谱的制作：采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测试，由得到的色谱数据生成金茵利胆口服液指纹图谱；
其中，所述高效液相色谱法中的色谱条件为：菲罗门双子星C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm、月神C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm、迪马二代钻石C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm或Waters symmetry C18柱，规格为：5μm，4.6×250mm；检测波长：254nm；进样量5-20μl，柱温：20-35℃，流速：0.9-1.1ml/min；
以乙腈为A相，体积百分比0.1％磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0-50min，流动相A为7％，流动相B为93％；
50-60min，流动相A由7％匀速变为33％，流动相B由93％匀速变为67％；
60-67min，流动相A由33％匀速变为100％，流动相B由67％匀速变为0％；
67min，流动相A为100％，流动相B为0％。
2.根据权利要求1所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述高效液相色谱法中的色谱条件为：迪马二代钻石C18柱，规格为：
5μm，4.6×250mm；检测波长：254nm；进样量10μl，柱温：25℃，流速：1ml/min；以乙腈为A相，体积百分比0.1％磷酸水溶液为B相进行梯度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中，所述金茵利胆口服液的制备方法为：除大黄外，全方混合后加10-12倍重量水，浸泡30-45min，煎煮1小时，过滤，滤渣加大黄，加入8-10倍重量水，继续煎煮30-45min，滤过，合并煎煮液，减压浓缩至每毫升相当于原药材1.0g。
4.根据权利要求1或2所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中，所述过滤是采用微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm。
5.根据权利要求3所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中，所述过滤是采用微孔滤膜进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm。
6.根据权利要求1或2所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：还包括配制对照品溶液，所述对照品溶液的配制方法包括：分别取没食子酸对照品、绿原酸对照品、夏佛塔苷对照品、甘草苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草酸铵对照品，精密称定，加纯甲醇分别制成盐酸小檗碱40mg/ml、没食子酸15mg/ml、夏佛塔苷80mg/ml、柚皮苷75mg/ml、新橙皮苷80mg/ml，甘草酸氨70mg/ml、盐酸巴马汀40mg/ml、氯原酸70mg/ml、甘草苷70mg/ml溶液，即得。
7.根据权利要求3所述的一种金茵利胆口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于：还包括配制对照品溶液，所述对照品溶液的配制方法包括：分别取没食子酸对照品、绿原酸对照品、夏佛塔苷对照品、甘草苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品、甘草酸铵对照品，精密称定，加纯甲醇分别制成盐酸小檗碱40mg/ml、没食子酸15mg/ml、夏佛塔苷80mg/ml、柚皮苷75mg/ml、新橙皮苷80mg/ml，甘草酸氨70mg/ml、盐酸巴马汀40mg/ml、氯原酸70mg/ml、甘草苷70mg/ml溶液，即得。
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