CN112521522A - 西伯利亚白刺多糖有效部位的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及西伯利亚白刺多糖有效部位的制备方法及其应用，该方法将西伯利亚白刺果实烘干、粉碎、石油醚脱脂、氯仿‑甲醇脱色、乙醇回流，再通过热水提取法、超声辅助提取法、纤维素酶提取法、果胶酶提取法及果胶酶+超声辅助提取法等进行提取，提取液经离心、大孔吸附树脂纯化、浓缩、无水乙醇沉淀、离心，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出西伯利亚白刺多糖有效部位。该方法所得的白刺多糖有效部位经验证具有较强的抗氧化活性及促进益生菌生长活性。研究开发多糖类天然抗氧化剂及肠道菌群调节剂从而改善机体免疫功能具有重要的现实意义。本发明可为西伯利亚白刺多糖有效部位在食品、医药及化妆品领域中的应用及创制具有特定功能活性的健康食品，实现技术成果的产业化应用提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及西伯利亚白多糖有效部位的制备方法及其应用。
背景技术
白刺属(Nitrariaceae)灌木，全世界共有11个种，广泛分布于亚洲、欧洲、及非洲等。我国的西北地区新疆、青海、甘肃、宁夏和内蒙古等地区都有分布。白刺属植物的果实和叶子均可入药。西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall.)是蒺藜科的一种植物，在我国新疆各地区都有分布，是一种药食同源的野生植物，其果实是沙漠中罕见的野生浆果。
在传统中药中西伯利亚白刺被用于治疗多种疾病，包括高血压、脾胃弱及***等症。同时，现代药理学研究证明，白刺果实具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗炎、抗氧化、抗疲劳及改善机体免疫等多种功效。西伯利亚白刺果实富含、多糖、蛋白质、氨基酸、生物碱、黄酮及酚类等多种生物活性物质。纵观国内外研究报道，白刺属植物中有关唐古特白刺的化学成分研究较多，但对西伯利亚白刺的化学成分及生物活性方面的研究报道较少，有关研究主要集中其中色素、生物碱、黄酮等化合物。目前，有关西伯利亚白刺多糖生物大分子类化合物的提取分离、结构鉴定及其相关的生物活性筛选等研究处于初始阶段。因此，研究西伯利亚白刺具有广泛生物活性的多糖类成分进行研究具有重要的意义，为西伯利亚白刺资源的综合利用提供技术支撑，为以西伯利亚白刺作为原料开发改善机体免疫功能的保健品提供物质基础参考。
多糖类化合物是指多个单糖残基通过糖苷键结合而成的结构复杂的天然高分子聚合物，广泛存在于动植物、微生物及藻类等。不同的植物多糖因其不同的结构表现出丰富多彩的药理作用。多数研究报道显示多糖类化合物具有多种生物活性，包括抗氧化、抑菌、降血糖、抗肿瘤、免疫调节、改善肠道菌群等多种功能。多糖类以其广泛的治疗作用和极低的细胞毒性，广泛应用于医药行业。同时，多糖类化合物由于其较好的功能特性，包括持水性、持油性、乳化性、乳化稳定性等广泛应用于食品行业用来做乳化剂、食品添加剂等。除此，多糖类化合物在化妆品和环境治理等领域具有广阔的应用前景。
抗氧化活性为多糖类化合物最广泛的生物活性之一。活性氧是正常氧代谢的的副产物，且在细胞信号转导和保持机体正常功能上发挥重要作用。然而，超过机体清除能力范围的过度的活性氧将严重影响机体身体健康，研究表明氧化应激引起细胞损伤，导致衰老、DNA突变等多种问题，从而导致严重的健康问题。因此，需要科学合理的补充适当的抗氧化剂。抗氧化剂通过自身被氧化来减缓或防止氧化作用来去除自由基，抑制进一步氧化反应的发生。然而，目前在市场上现有的大部分抗氧化剂都是通过合成而来的，可能引起衰老、肝损伤、致癌等。因此，从自然界天然动植物中筛选出能够清除体内自由基用来维持机体的健康的天然抗氧化剂具有重要的实际意义。
近年来，人们的健康意识不断提高，健康与饮食的关系越来越受到重视，刺激了人们对功能性和有益健康食品的需求。益生元是一种不易消化的食品成分，通过选择性地刺激胃肠道菌群的生长和代谢活动对促进宿主健康起着至关重要的作用。肠道菌群能够抑制外来细菌的生长，形成生物屏障，从而影响机体免疫功能。研究表明碳水化合物可能通过调节宿主肠道菌群来维持或改善人类健康，多糖不能被消化道内的酶降解，能够通过厌氧代谢被肠道细菌作为碳源。同时，最终产生的乳酸等短链脂肪酸使肠道内处于酸性环境，抑制病原体的生长，从而改变肠道菌群的组成，改善宿主的健康状况。
发明内容
本发明目的在于，提供一种西伯利亚白刺果实多糖有效部位的制备方法及其应用，该方法将西伯利亚白刺果实烘干，粉碎，石油醚脱脂，氯仿-甲醇脱色，乙醇回流脱色后，通过热水提法进行提取，经离心，大孔吸附树脂纯化，浓缩，无水乙醇沉淀，离心，真空冷冻干燥，即得西伯利亚白刺多糖有效部位。通过本发明所述方法获得的西伯利亚白刺果实多糖有效部位经验证表明：具有较强的抗氧化活性及促进益生菌生长活性；研究开发多糖类天然抗氧化剂及肠道菌群调节剂从而改善机体免疫功能具有重要的现实意义。所得西伯利亚白刺多糖有效部位在食品、医药及化妆品领域中的应用及创制具有特定功能活性的健康食品，实现技术成果的产业化应用提供基础。
本发明所述的一种西伯利亚白刺多糖有效部位的制备方法，该方法以西伯利亚白刺果实为原料，采用热水提取、超声辅助提取、纤维素酶辅助提取、果胶酶辅助提取或超声+果胶酶提取，具体操作按下列步骤进行：
热水提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，于温度90℃热水回流提取，提取时间2小时，提取2次，合并提取液，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔吸附树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
超声辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，超声功率500W，时间50min，温度50℃进行提取，提取1次，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
纤维素酶辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，加入重量比为0.5％的纤维素酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
果胶酶辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，加入重量比为0.5％的果胶酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
超声+果胶酶提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，超声功率为500W，加入重量比为0.5％的纤维素酶，温度50℃进行提取，时间50min，提取1次，提取完成后置于沸水浴中进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化药物中的用途。
所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备益生菌生长药物中的用途。
所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备促进益生菌生长食品或保健品中的用途。
所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化食品或保健品中的用途。
所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化的化妆品中的用途。
通过本发明所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位，经验证表明：具有抗氧化活性，有较强的总还原能力，对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及羟自由基具有一定的清除能力，同时能够促进青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及粪肠球菌的生长。目前，从天然植物中寻找新抗氧化剂及益生菌生长促进剂是现代医药和食品行业发展的新方向。本研究可为西伯利亚白刺多糖有效部位在食品、医药及化妆品领域中的应用及创制具有特定功能活性的健康食品，实现技术成果的产业化应用提供基础。
附图说明
图1为本发明红外光谱；
图2为本发明刚果红复合物的最大吸收光谱；
图3为本发明扫描电子显微镜图；其中A为热水提取多糖；
图4为本发明扫描电子显微镜图；其中B为超声提取多糖；
图5为本发明扫描电子显微镜图；其中C为纤维素酶提取多糖；
图6为本发明扫描电子显微镜图；其中D为果胶酶提取多糖；
图7为本发明扫描电子显微镜图；其中E为超声+果胶酶提取多糖；
图8为本发明西伯利亚白刺多糖表面元素分析图；
图9为本发明西伯利亚白刺多糖对DPPH自由基的清除能力图；
图10为本发明西伯利亚白刺多糖对羟自由基的清除能力图；
图11为本发明西伯利亚白刺多糖总还原能力图。
具体实施方式
实施例1
热水提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，于温度90℃热水回流提取，提取时间2小时，提取2次，合并提取液，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔吸附树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
实施例2
超声提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，超声功率500W，时间50min，温度50℃进行提取，提取1次，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
实施例3
纤维素酶提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，加入重量比为0.5％的纤维素酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
实施例4
果胶酶提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，反复至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，加入重量比为0.5％的果胶酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
实施例5
超声+果胶酶提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90％的乙醇，回流加热3小时，提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，超声功率为500W，加入重量比为0.5％的纤维素酶，温度50℃进行提取，时间50min，提取1次，提取完成后置于沸水浴中进行灭酶，保持15min，7000rpm，离心10min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12h，7000rpm，离心10min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
实施例6
西伯利亚白刺多糖的红外光谱：
将实施例1-5得到的西伯利亚白刺多糖有效部位样品经红外光谱图分析结果显示(附图1)，不同方法所制备的多糖在3400cm-1附近处有强吸收峰，该吸收峰是因多糖羟基伸缩振动引起的；在2900cm-1附近的吸收峰是由C-H伸缩振动引起的；约1600cm-1附近的强吸收峰因多糖类化合物水合振动峰引起的，西伯利亚白刺多糖在4000-500cm-1范围内均显出了典型的多糖吸收峰。
实施例7
西伯利亚白刺多糖的构象分析：
将实施例1-5得到的西伯利亚白刺多糖有效部位样品经刚果红实验进行构象分析，如图2所示，在氢氧化钠浓度为0-0.5mol/L范围时，与对照组(刚果红)的最大吸收波长相比，西伯利亚白刺多糖的最大吸收波长均发生了明显的红移，说明不同方法提取的西伯利亚白刺多糖有效部位中均存在三螺旋结构。
实施例8
西伯利亚白刺多糖的扫描电子显微镜及能谱分析：
将实施例1-5得到西伯利亚白刺多糖有效部位的扫描电子显微镜-能谱分析(SEM-EDX)图如附图3、4所示，与热水提取法相比，经超声或酶解处理后多糖表面结构及颗粒形状、大小等均发生变化，西伯利亚白刺多糖中除了碳和氧等主要元素外，同时含有Na、Mg、P、S、K、Ca等对人体有益的常微量元素。
实施例9
西伯利亚白刺多糖有效部位的抗氧化活性试验：
(1)DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力的测定：
将100μL各浓度的(0.1-2mg/mL)实施例1-5西伯利亚白刺多糖有效部位溶液与0.2mmol/L DPPH-甲醇溶液100μL于96孔板中，室温避光反应30min，在517nm下测吸光度，计算清除率；
(2)羟自由基清除能力的测定：
将50μL各浓度的(0.1-2mg/mL)将实施例1-5所得西伯利亚白刺多糖有效部位溶液与50μL，6mmol/L的硫酸亚铁溶液、50μL，6mmol/L的水杨酸-乙醇溶液及50μL，0.1％过氧化氢水溶液于96孔板中，室温避光反应30min，在510nm下测吸光度，计算清除率；
(3)西伯利亚白刺多糖有效部位总还原能力的测定：
将200μL各浓度的(0.1-2mg/mL)将实施例1-5所得西伯利亚白刺多糖有效部位溶液与100μL磷酸缓冲溶液、200μL，1％铁***溶液、及100μL10％三氯乙酸溶液混合，于温度50℃反应20min，加400μL蒸馏水及100μL三氯化铁溶液，室温放置10min，于700nm处测定吸光度，计算清除率。
本发明涉及的西伯利亚白刺多糖有效部位体外抗氧化活性分析表明：所制备的西伯利亚白刺多糖有效部位均具有总还原能力，及清除DPPH、羟自由基的能力，结果如附图5-7所示，其表明提取方法对多糖抗氧化活性的影响较大；热水提取、超声提取、纤维素酶提取、果胶酶提取及超声+果胶酶提取所得多糖有效部位对DPPH自由基的清除率半抑制浓度分别为1.171,0.209,0.209,0.356,1.740mg/mL，其中通过超声辅助提取及纤维素酶辅助提取所得的多糖对DPPH自由基的清除能力显著强于其余三种方法所得多糖；然而，五种方法制备的多糖对羟自由基清除率半抑制浓度分别为0.815,0.168,0.149,0.725,0.138mg/mL，其中超声+果胶酶辅助提取所得的多糖对羟自由基的清除能力显著强于其余四种方法所得多糖。与热水提取法相比，超声波辅助提取及酶解提取在更温和的条件下对多糖进行提取，显出更好的抗氧化活性。西伯利亚白刺多糖因其较强的抗氧化活性，可能成为一个潜在的抗氧化剂和抗衰老剂，广泛应用于食品、医药及保健品等领域。
实施例10
西伯利亚白刺多糖的促进益生菌生长活性：
将德氏乳杆菌保加利亚亚种、青春双歧杆菌、粪链球菌菌液分别接种至对应的培养基中，分别添加不同浓度的样本于基础培养基中培养16-18小时后，用细胞计数仪检测细菌数，每个样品重复3次；
本发明涉及的西伯利亚白刺多糖有效部位体外促益生菌生长活性结果表明：所制备的西伯利亚白刺多糖有效部位均对青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及粪链球菌显出明显的促进生长活性，结果见表1-3所示：
表1
表2
表3
研究结果表明：采用热水提取、超声辅助提取、纤维素酶辅助提取、果胶酶辅助提取或超声+果胶酶提取不同方法对西伯利亚多糖有效部位促进益生菌生长活性的影响较大，其中热水提取所得的多糖对双歧杆菌促生长作用最强，纤维素酶辅助提取制备的多糖对德氏乳杆菌保加利亚亚种促生长活性最强，而果胶酶辅助提取的多糖对粪肠球菌的促生长作用最强。因不同提取方法对多糖含量、单糖组成、分子量及糖链结构等的影响导致其具有不同的生物活性。
通过本发明所制备的西伯利亚多糖有效部位经验证表明：具有较强的抗氧化活性及促进益生菌生长活性。研究开发多糖类天然抗氧化剂及肠道菌群调节剂从而改善机体免疫功能具有重要的现实意义，为西伯利亚白刺多糖有效部位在食品、医药及化妆品领域中的应用及创制具有特定功能活性的健康食品，实现技术成果的产业化应用提供基础。
Claims (6)
1.一种西伯利亚白刺多糖有效部位的制备方法，其特征在于该方法以西伯利亚白刺果实为原料，采用热水提取、超声辅助提取、纤维素酶辅助提取、果胶酶辅助提取或超声+果胶酶提取，具体操作按下列步骤进行：
热水提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90%的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20g/mL，加水，于温度90℃热水回流提取，提取时间2小时，提取2次，合并提取液， 7000 rpm，离心1 0 min，AB-8型大孔吸附树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12 h，7000 rpm，离心10 min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
超声辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90%的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20 g/mL，加水，超声功率500 W，时间50 min，温度50℃进行提取，提取1次， 7000 rpm，离心10 min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12 h，7000 rpm，离心10 min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
或纤维素酶辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90%的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20 g/mL，加水，加入重量比为0.5%的纤维素酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15 min，7000 rpm，离心10 min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12 h，7000 rpm，离心10 min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
果胶酶辅助提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90%的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20 g/mL，加水，加入重量比为0.5%的果胶酶，温度50℃回流提取，提取时间6小时，提取完成后温度升至95℃进行灭酶，保持15 min，7000 rpm，离心10 min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12 h，7000 rpm，离心10 min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位；
超声+果胶酶提取：
a、采集西伯利亚白刺成熟果实，温度40℃烘干，机械粉碎，过40目筛得到西伯利亚白刺果实粉末；
b、将步骤a得到的粉末按料液比为1:8g/mL加入石油醚，搅拌2小时，提取至石油醚层无色为止，抽滤，粉末风干至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂的西伯利亚白刺果实粉末；
c、将步骤b中得到的脱脂西伯利亚白刺粉末按料液比为1:5g/mL加入体积比4:1的氯仿-甲醇混合溶液，室温搅拌2小时，提取3-4次，抽滤，自然风干，再加入料液重量比为1:10g/mL的浓度90%的乙醇，回流加热3小时，反复提取至乙醇层溶液颜色较淡为止，抽滤，自然风干，得到脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末；
d、将步骤c中得到的脱脂脱色的西伯利亚白刺果实粉末，按料液比1:20 g/mL，加水，超声功率为500 W，加入重量比为0.5%的纤维素酶，温度50℃进行提取，时间50 min，提取1次，提取完成后置于沸水浴中进行灭酶，保持15 min，7000 rpm，离心10 min，AB-8型大孔树脂纯化，浓缩，得到多糖浓缩液；
e、按体积比1:5将步骤d得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，于温度4℃放置12 h，7000 rpm，离心10 min，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，即得到西伯利亚白刺多糖有效部位。
2.一种如权利要求1所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化药物中的用途。
3.一种如权利要求1所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备益生菌生长药物中的用途。
4.一种如权利要求1所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备促进益生菌生长食品或保健品中的用途。
5.一种如权利要求1所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化食品或保健品中的用途。
6.一种如权利要求1所述方法获得的西伯利亚白刺多糖有效部位在制备抗氧化的化妆品中的用途。
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