CN112521373B

CN112521373B - 一种多模态探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112521373B
Application number: CN201910885138.7A
Authority: CN
Inventors: 叶德举; 张艳; 王宇琦; 翁剑辉
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN112521373A

Abstract

本发明公开了一种基于生物相容反应的“一锅三步”串联反应方法，用来快速构建多功能、多模态探针，以及由所述方法制得的分子影像探针。该反应方法以具有近红外荧光的IR780衍生物为骨架，经过连续的点击反应、取代反应以及点击反应，可以高收率的实现多功能近红外荧光探针的构建。

Description

一种多模态探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子探针领域，涉及一种多模态探针及其制备方法和应用。

背景技术

多模态分子影像探针通过整合不同模态成像技术的优势，在活体上同时进行高灵敏度，高分辨率，高组织深度的成像分析，将有助于获取更全面、更精准的信息，从而促进疾病的早期诊断。然而，构建多模态分子影像探针需要在同一个分子中同时引入具有不同功能及不同成像模态的基团，这就使得该分子的结构变得复杂，导致探针的合成过程繁琐、产率低。因此，开发简单、灵活、高效的合成方法对于构建多功能、多模态分子影像探针将具有重要意义。

近年来，生物相容反应由于其温和的反应条件和高特异性的反应特点，被广泛应用于分子影像探针的构建中。这些反应包括铜催化的叠氮和炔烃的环加成反应(CuAAC)，环张力促进的叠氮和炔烃的环加成反应(SPAAC)，半胱氨酸与氰基苯并噻唑的环化反应等等。尽管已有许多利用生物相容反应构建的分子影像探针报道，但在一个分子内引入三个甚至更多的功能基团并不容易。目前已报道的通过串联的生物相容反应构建多功能分子探针的策略一般可分为三类：(1) 在一个分子骨架上引入不同生物相容反应的底物，利用修饰的相应官能团进行多个生物相容反应的串联；例如，Jones课题组报道了一种通过串联使用SPAAC， CuAAC以及巯基与马来酰亚胺的生物相容反应用于三功能探针的快速合成；(2) 在一个分子骨架上引入多个带保护的生物相容官能团(如炔基)，然后通过分步脱保护来逐步引入功能基团；例如，Aucagne课题组报道了一种通过端炔选择性脱保护策略实现的串联反应方法，可以在5步内实现三功能分子的构建；(3) 通过生物相容反应的不同底物反应特性不同来实现串联反应。例如，Hosoya课题组最近报道了一种构建三官能团探针的策略，他们首先构建了含有芳基叠氮、苄基叠氮和2,6-二异丙基苯基叠氮分子骨架，利用这三种叠氮与不同底物的选择性环加成反应构建三功能分子。这些方法都需要通过多步的化学合成在一个分子骨架上引入多个生物相容反应官能团，此外，这些探针中的分子骨架只是作为承载成像基团的平台，这可能会增加多模态探针的体积进而影响其在生物体系中的检测效果。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种多模态探针的制备方法，包含如下步骤：步骤1：寻找或合成能够进行第一步点击反应-第二步取代反应-第三步点击反应的基本骨架；步骤2：通过第一步点击反应-第二步取代反应-第三步点击反应在所述基本骨架上构建一或多个功能基团，从而制得多模态探针。

所述基本骨架包括但不限于带有炔基的IR780衍生物。

IR780是一种近红外荧光染料，相对临床上广泛使用的ICG具有更好的光稳定性，被广泛的应用于近红外荧光探针的构建中。我们在研究中发现，IR780分子结构中环己烯上的氯原子可以在非常温和的条件下被叠氮快速取代。在温和的反应条件下，该反应不易受到其他一些亲核性基团的影响，生成含叠氮的化合物在一定时间内可以稳定存在，进而可以和末端炔烃发生快速的点击反应，生成含三氮唑的荧光探针，表现出比IR780和ICG荧光波长更红、光稳定性更好的性质。基于此，我们设计并合成了带有炔基的IR780衍生物作为基本荧光分子骨架，发展了点击反应-取代反应-点击反应的一锅三步串联反应策略来快速构建多功能的近红外荧光探针。含有叠氮的功能基团首先通过点击反应与化合物中的炔基连接，不需要纯化；然后加入叠氮化钠进行取代反应，该取代反应可以在10-15 分钟内完成且不会受到加入的硫酸铜、抗坏血酸钠以及配体THPTA的影响；最后直接加入含炔基的化合物再次进行点击反应，从而引入第二个功能基团。在本章的工作中，我们利用该一锅三步串联反应策略构建了含有不同电性，不同数量靶向基团的近红外荧光小分子探针并进行了细胞和活体成像分析研究。同时，利用此策略我们可以在miRNA蛋白、抗体等生物大分子上同时修饰近红外荧光染料以及靶向基团。

在一个实施例中，所述第一步点击反应或第三步点击反应，加入配体、催化剂和还原剂。

在一个实施例中，所述第一步点击反应或第三步点击反应以THPTA作为配体，以硫酸铜为催化剂，以抗坏血酸钠为还原剂。

在一个实施例中，所述第二步取代反应的溶剂中，水含量小于20％。

在一个实施例中，所述第二步取代反应的溶剂为DMSO/H₂O(5/1)。

在一个实施例中，在所述步骤2中，首先含有叠氮的功能基团通过点击反应与所述基本荧光分子骨架的的炔基连接，不需要纯化；然后加入叠氮化钠进行第二步取代反应；最后直接加入含炔基的化合物再次进行点击反应，从而引入第二个功能基团。

在一个实施例中，本发明的多模态荧光探针用于细胞和活体成像分析。

在一个实施例中，本发明的多模态光探针用于核酸、抗体和蛋白等生物大分子的近红外荧光标记。

图1为现有技术多模态分子探针及其合成策略，图2为本发明多功能分子探针及其合成策略。

在一个实施例中，所述多模态探针为荧光/PET双模态探针¹⁸F-NIR。

在一个实施例中，所述多模态探针为近红外荧光探针NIR-miR34a。

在一个实施例中，所述一或多个功能基团相同或不同。

在一个实施例中，所述一或多个功能基团是不同电性的功能基团。

在一个实施例中，所述一或多个功能基团为c-RGD靶向基团。

在一个实施例中，所述功能基团为MRI成像基团、PET成像基团、核酸分子肿瘤细胞特异性靶向基团或蛋白分子。

在一个实施例中，所述功能基团为RGD、环状RGD(c-RGD)、叶酸(Folic acid)、半乳糖(Galactose)、生物素(Biotin)、荧光染料、钆III-1,4,7,10-四氮环十二烷基-1,4,7,10-四乙酸(Gd-DOTA)、¹⁸F标记的N-炔丙基-N,N-二甲基铵甲基三氟化硼(N-Propargyl-N,N-dimethylammoniomethyltrifluoroborate)、核酸适配体(Aptamer)，miRNA、西妥昔单抗(Cetuximab)抗体或牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA)。

本发明提供的一锅三步串联反应方法可以高效率、高收率地构建具有不同功能的近红外荧光探针、靶向型多模态探针用于细胞以及活体成像研究，其克服了目前报道的构建多功能、多模态探针的方法产率低、步骤繁琐等缺陷。该方法提供了一个以近红外荧光分子为骨架的分子模板，在此基础上通过串联的点击反应高效率的引入多个功能基团、成像基团，构建出具有不同功能的多模态分子影像探针，为分子影像学研究提供了一个强有力的工具。

附图简要说明

图1是现有技术多模态分子探针及其合成策略。

图2是本发明多功能分子探针及其合成策略。

图3是一锅三步串联反应探针合成流程及每一步HPLC分析。

图4是化合物3-3c(1μM)在不同溶剂中的吸收光谱以及荧光光谱。

图5是探针3-3c和ICG(1μM,PBS,pH＝7.3)的吸收光谱以及荧光光谱。

图6是化合物3-3c(1μM)在不同pH的PBS中的光学性质。

图7是探针3-3c或ICG的吸收光谱及吸光度与照射前的比值(A/A₀)。

图8是化合物3-4c～3-9c的化学结构及性能测试。

图9是化合物3-10c～3-12c的化学结构及性能测试。

图10是三种不同电性的近红外荧光探针的荧光成像。

图11是化合物3-3c、3-13c～3-15c的化学结构及性能测试。

图12是不同浓度的3-15c的荧光成像及荧光强度的定量分析。

图13是U87MG细胞与近红外荧光探针的荧光成像，标尺：20μm。

图14是U87MG细胞及HEK-293细胞的荧光成像。

图15是U87MG移植瘤小鼠尾静脉注射探针3-3c，3-13c，3-14c或3-15c(5nmol) 后的荧光成像及肿瘤部位荧光强度的定量分析。

图16是U87MG移植瘤小鼠尾静脉注射探针3-3c，3-13c，3-14c或3-15c(5nmol) 后主要器官的荧光成像及肿瘤和主要器官荧光强度的定量分析。

图17是串联反应方法对miRNA-34a进行荧光标记。

图18是NIR-miR34a(30pmol)，miRNA-34a(30pmol)以及NC(30pmol)转染进入U87MG细胞后的荧光素酶报告基因实验。

图19是转染NC(30pmol)，miRNA-34a(30pmol)，NIR-miR34a(30pmol) 或与1μMmiRNA-34a或1μM NIR-miR34a孵育72小时后的荧光成像。

图20是转染NC(30pmol)，miRNA-34a(30pmol)，NIR-miR34a(30pmol)或与1 μMmiRNA-34a或1μM NIR-miR34a孵育72小时后的流式细胞实验及平均荧光强度。

图21是三步串联反应策略对Cetuximab进行修饰的反应过程及SDS-PAGE分析结果。

图22是A549细胞的荧光成像。

图23是A549细胞加入或不加Ce-Alkyne(40μg/mL)的荧光成像。

图24是三步串联反应策略对BSA进行近红外荧光标记反应过程图示及 SDS-PAGE分析结果。

图25是BSA和BSA-NIR的ESI-MS分析。

图26是荧光/PET双模态探针¹⁸F-NIR的构建流程及HPLC分析和MALDI-MS 质谱分析。

图27是U87MG移植瘤小鼠注射探针¹⁸F-NIR的PET成像图及肿瘤对探针的摄取量随时间变化的曲线和肿瘤与肌肉摄取量的比值随时间变化的曲线。

图28是U87MG移植瘤小鼠通过尾静脉注射F-NIR(5nmol)前后的荧光成像及肿瘤部位荧光强度的定量分析和肿瘤与背景荧光信号的比值(T/B)随时间变化曲线。

具体实施方式

试剂与仪器

所有化学试剂和溶剂均购自与上海百灵威科技有限公司，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司和Sigma-Aldrich。分析溶剂与试剂为色谱纯，常规试剂均为分析纯且未经进一步纯化处理。高糖Dulbecoo’s Modified Eagle Medium (DMEM)，胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)，胰蛋白酶(Trypsin)和 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)细胞增殖检测试剂盒均购自KeyGen Biotech(中国南京)。HeLa、U87MG、A549细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

核磁图谱(¹H NMR和¹³C NMR)由400MHz Bruker Avance III 400 spectrometer测得，溶剂为DMSO-d₆，化学位移(δ)以ppm为单位，单重峰，双重峰，三重峰，四重峰，dd(doublet of doublets)峰，多重峰以及宽峰分别以s,d,t, q,dd,m以及br表示；耦合常数(J)以Hz为单位；氢的个数用图谱的积分值确定，记为nH。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)由 ABSCIEX MALDI TOF-TOF 4800plus测得；高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，HPLC)分析使用Thermo Scientific DionexUltimate 3000，流动相(eluent)为含有1‰三氟乙酸的乙腈和水；紫外-可见吸收光谱(UV-vis spectra)使用Ocean Optics Maya 2000Pro UV-Visible spectrometer测得；荧光光谱 (fluorescence spectra)使用HORIBA Jobin Yvon Fluoromax-4 fluorescencespectrometer测得；细胞荧光图片由奥林巴斯倒置荧光光显微镜(Olympus IX73fluorescent inverted microscope)拍摄；流式细胞分析实验由Coulter FC-500 flowcytometer(Beckman Coulter,USA)测得。PET成像图片由Inveon Dedicated micro-PETscanner(Siemens)拍摄。

合成方法

化合物3-2的合成

化合物3-2的合成流程

化合物3-2的合成，反应条件：(a)KI，CH₃CN，回流，24h；(b)n-BuOH/ 苯(7/3)，135℃，回流，6h，67％。

将2,3,3-三甲基吲哚(2,3,3-Trimethylindolenine，10mmol)与5-氯戊炔 (5-Chloro-1-pentyne，10mmol)溶于8mL乙腈中，加入碘化钾(22mmol)搅拌回流 24h。反应完后，过滤并收集滤液，旋干溶剂后剩余固体用丙酮重结晶得中间体化合物3-1。不经进一步纯化，直接将化合物3-1(4.4mmol)与2-氯-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯甲醛(2-chloro-3-(hydroxyMethylene)cyclohex-1-enecarbaldehyde)(2 mmol)溶于40mL正丁醇/苯(7/3)的混合溶剂中并于135℃下搅拌回流6h。旋干溶剂后，经柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，体积比为100/1到50/1)分离纯化得深绿色固体化合物3-2，产率为67％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.24(d,J ＝14.0Hz,2H),7.64(d,J＝7.4Hz,2H),7.48-7.42(m,4H),7.32-7.28(m,2H), 6.38(d,J＝14.2Hz,2H),4.27(t,J＝7.3Hz,4H),2.99(t,J＝2.5Hz,2H),2.72(t,J＝5.9Hz,4H),2.37-2.33(m,4H),1.97-1.86(m,6H),1.69(s,12H)；¹³C NMR(101 MHz,DMSO-d₆)δ172.39,148.14,143.15,141.98,141.04,128.59,126.34,125.19, 122.53,111.28,101.51,83.49,72.23,49.02,42.79,27.45,25.91,20.29,15.27.MS: calcd.for C₄₀H₄₄ClN₂ ⁺[M⁺]:587.3188；found MALDI-MS:m/z 587.2511。

应用串联反应策略合成各化合物的一般方法

方法一

将化合物3-2(0.017mmol)和相应叠氮化合物(0.0374mmol)溶于1mL DMSO；将硫酸铜(0.017mmol)，抗坏血酸钠(0.017mmol)，三(3-羟丙基***甲基)胺 (THPTA)(0.034mmol)溶于200μL水中并加入前述溶液中，室温下，搅拌反应30分钟。反应完成后，不处理，继续下一步反应。

取叠氮化钠(0.085mmol)溶于20μL水中，直接加入上述反应液中，室温继续反应15分钟。反应结束后，不作进一步处理，继续下一步反应。

将相应炔基化合物(0.026mmol)溶于DMSO中，硫酸铜(0.017mmol)，抗坏血酸钠(0.017mmol)，THPTA(0.034mmol)溶于水中并依次加入上述反应液中，室温下反应30分钟。反应完后，使用半制备高效液相色谱分离纯化，冻干后得到相应化合物。

方法二

将化合物3-2(0.017mmol)和相应叠氮化合物(0.0374mmol)溶于1mL DMSO；将硫酸铜(0.0085mmol)，抗坏血酸钠(0.0085mmol)，THPTA(0.0085mmol)溶于 50μL水中并加入前述溶液中，室温下，搅拌反应30分钟。反应完成后，不处理，继续下一步反应。

取叠氮化钠(0.051mmol)溶于10μL水中，直接加入上述反应液中，室温继续反应15分钟。反应结束后，不作进一步处理，继续下一步反应。

将相应炔基化合物(0.026mmol)溶于DMSO中，硫酸铜(0.0085mmol)，抗坏血酸钠(0.0085mmol)，THPTA(0.0085mmol)溶于50μL水中并依次加入上述反应液中，室温下反应30分钟。反应完后，使用半制备高效液相色谱分离纯化，冻干后得到相应化合物。

化合物3-3c的合成：

化合物3-3c按照上述方法一合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.63 (s,1H),7.93(s,2H),7.52(d,J＝7.4Hz,2H),7.44-7.37(m,4H),7.26-7.22(m,2 H),6.62(d,J＝13.9Hz,2H),6.36(d,J＝14.1Hz,2H),4.76(s,2H),4.51(t,J＝5.1 Hz,5H),4.28(m,4H),3.82(t,J＝5.2Hz,4H),3.70-3.45(m,24H),3.42-3.37(m, 6H),3.12-3.08(m,1H),2.79(t,J＝7.2Hz,6H),2.10-2.06(m,4H),1.26-1.16(m, 15H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.02,145.51,141.82,140.99,140.70, 126.47,125.22,122.57,122.36,111.45,101.84,72.26,69.90,69.75,69.55,69.52, 68.98,68.69,60.17,60.14,49.25,48.68,45.55,27.15,26.92,26.32,24.26,21.90, 8.38.MS:calcd.for C₆₁H₈₆N₁₁O₁₀ ⁺[M⁺]:1132.6554；MALDI-MS:m/z 1132.5031。

化合物3-4c的合成：

化合物3-4c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.38 (s,1H),7.93(s,2H),7.55(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(m,4H),7.25(m,2H),6.62(d, J＝14.0Hz,2H),6.33(d,J＝14.1Hz,2H),4.31(m,8H),2.66-2.88(m,10H), 1.66-2.15(m,16H),1.45(m,2H),1.24(m,20H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H),0.84(m, 6H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ171.93,147.63,145.58,141.87,140.93, 128.55,126.39,125.40,125.25,122.50,122.00,111.47,101.78,49.20,48.66,43.33, 40.12,39.91,39.70,39.49,39.28,39.07,38.86,31.48,30.56,29.63,27.12,26.93, 26.30,25.48,24.41,23.85,21.96,21.88,21.65,13.80,13.72.MS:calcd.for C₄₉H₆₂N₁₁O₃ ⁺[M⁺]:930.6593；found MALDI-MS:m/z930.4919。

化合物3-5c的合成：

化合物3-5c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.38 (s,1H),7.89(s,2H),7.55(d,J＝7.4Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,2H),6.62(d, J＝14.1Hz,2H),6.33(d,J＝14.1Hz,2H),4.36(t,J＝5.4Hz,4H),4.27(t,J＝7.6 Hz,4H),3.77(t,J＝5.4Hz,4H),3.57(t,J＝6.4Hz,4H),2.86(t,J＝7.8Hz,2H), 2.67-2.80(m,8H),1.85-2.11(m,8H),1.82(m,4H),1.24(d,J＝8.4Hz,12H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ171.96,148.01,145.37,141.86,140.98,137.21, 138.69,132.51,128.63,126.40,125.23,122.56,111.50,101.92,92.23,60.05,59.87, 52.06,48.68,43.81,32.73,27.15,26.92,26.38,23.93,21.95,21.58.MS:calcd.for C₄₉H₆₂N₁₁O₃ ⁺[M⁺]:852.5032；found MALDI-MS:m/z852.5031。

化合物3-6c的合成：

化合物3-6c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.37 (s,1H),7.93(s,2H),7.55(d,J＝7.4Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,2H),6.61(d, J＝14.1Hz,2H),6.33(d,J＝14.1Hz,2H),4.33(t,J＝7.0Hz,4H),4.27(t,J＝7.7 Hz,4H),3.07(t,J＝7.3Hz,4H),2.70-2.80(m,11H),2.25(t,J＝7.4Hz,4H), 1.89-2.14(m,6H),1.82(m,4H),1.46(m,4H),1.25(d,J＝12.5Hz,12H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ174.11,173.27,172.06,147.51,146.51,145.59, 141.85,141.05,140.89,128.52,126.35,125.52,125.22,122.47,122.04,111.45, 101.74,48.92,48.71,43.31,36.57,34.71,33.36,32.88,31.52,29.35,29.14,27.21, 26.91,26.31,23.80,21.97,21.41,20.46,20.19.MS:calcd.forC₅₅H₆₈N₁₁O₆ ⁺[M⁺]: 978.5354；found MALDI-MS:m/z 978.4258。

化合物3-7c的合成：

化合物3-7c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.15 (s,1H),7.95(m,4H),7.42-7.58(m,6H),7.28-7.41(m,13H),7.20(m,2H),6.73 (d,J＝14.0Hz,2H),6.38(d,J＝14.2Hz,2H),5.57(s,4H),4.28(t,J＝7.8Hz,4 H),2.66-2.82(m,8H),1.85-2.13(m,6H),1.21(d,J＝18.4Hz,12H)；¹³C NMR (101MHz,DMSO-d₆)δ172.08,147.07,146.97,146.03,141.79,140.96,140.69, 136.14,131.32,129.85,129.20,128.71,128.50,128.05,127.80,126.20,125.49, 125.26,124.92,122.58,122.34,111.43,101.94,52.73,48.69,43.38,26.96,26.91, 26.31,23.87,21.95,20.18.MS:calcd.forC₆₂H₆₄N₁₁ ⁺[M⁺]:962.5341；found MALDI-MS:m/z 962.3941。

化合物3-8c的合成：

化合物3-8c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.21 (s,1H),8.01(m,4H),7.63(m,2H),7.31-7.55(m,14H),7.20(m,2H),6.71(d,J＝ 14.0Hz,2H),6.38(d,J＝14.2Hz,2H),5.57(s,4H),4.28(t,J＝7.7Hz,4H), 2.67-2.85(m,8H),1.85-2.11(m,6H),1.20(d,J＝16.0Hz,12H)；¹³C NMR(101 MHz,DMSO-d₆)δ172.12,146.77,146.09,145.96,141.79,140.96,140.60,135.14, 133.05,132.77,129.76,129.34,128.70,128.50,127.11,126.014,125.29,122.59, 122.39,111.46,101.98,51.91,48.70,43.40,26.94,26.89,26.30,23.87,21.96,20.15. MS:calcd.for C₆₂H₆₁Cl₃N₁₁ ⁺[M⁺]:1064.4172；found MALDI-MS:m/z 1064.2535。

化合物3-9c的合成：

化合物3-9c按照上述方法二合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.68 (s,1H),9.00(br,2H),8.81(br,4H),8.37(br,2H),8.11(s,2H),7.53(br,4H),7.50 (d,J＝7.8Hz,2H),7.36-7.47(m,4H),7.23(m,2H),6.70(d,J＝14.0Hz,2H), 6.45(d,J＝14.1Hz,2H),5.85(s,4H),4.33(t,J＝7.9Hz,4H),2.75-2.88(m,8H), 1.85-2.17(m,6H),1.20(d,J＝15.9Hz,12H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ 172.20,158.57,158.21,150.47,146.45,146.31,146.05,145.98,143.48,141.78, 140.98,140.27,128.74,128.54,126.13,125.39,123.91,123.22,122.52,111.59, 102.20,51.37,48.74,43.46,26.91,26.35,23.93,21.99,20.10MS:calcd.for C₅₉H₆₁N₁₄ ⁺[M⁺]:965.5198；found MALDI-MS:m/z965.5097。

化合物3-10c的合成：

化合物3-10c按照上述方法一合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.09 (s,1H),8.10(s,2H),7.54(d,J＝7.4Hz,2H),7.47-7.41(m,4H),7.29-7.25(m,2 H),6.51(dd,J＝14.0Hz,4H),5.05(s,2H),4.95(t,J＝6.7Hz,4H),4.33(m,4H), 3.94(t,J＝6.8Hz,4H),3.27(s,7H),3.15(s,20H),2.81(t,J＝7.6Hz,5H),2.39(d, J＝5.8Hz,4H),2.08(t,J＝7.4Hz,5H),1.26(d,J＝10.2Hz,12H)；¹³C NMR(101 MHz,DMSO-d₆)δ172.45,158.93,158.61,146.73,146.54,142.32,141.46,140.68, 136.86,132.30,129.11,127.01,125.88,123.44,122.85,112.14,102.64,63.65,58.77, 53.07,52.61,49.23,43.70,27.82,27.29,26.92,24.74,24.53,22.48,20.55.MS:calcd. for C₅₆H₈₂N₁₄Na⁵⁺[(M+Na)⁵⁺]:973.6825；found MALDI-MS:m/z 974.4594。

化合物3-11c的合成：

化合物3-11c按照上述方法一合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.27 (s,1H),8.02(s,2H),7.49(d,J＝7.4Hz,2H),7.40(d,J＝4.2Hz,4H),7.25-7.22 (m,2H),6.67(d,J＝13.9Hz,2H),6.31(d,J＝14.0Hz,2H),4.47(t,J＝7.0Hz,4 H),4.26(m,4H),4.02(s,2H),2.80(t,J＝7.3Hz,4H),2.77-2.74(m,4H), 2.52-2.47(m,4H),2.16-2.04(m,8H),1.99(m,2H),1.26(s,12H)；¹³C NMR(101 MHz,DMSO-d₆)δ172.19,147.62,145.32,141.84,141.27,140.99,128.44,126.99, 126.58,125.15,122.68,122.34,111.35,101.67,48.83,48.61,48.18,48.01,43.21, 27.45,27.05,26.24,23.89,21.81,20.17.MS:calcd.forC₄₉H₆₂N₁₁O₉S₃ ⁺ [(M+3H)⁺]:1044.3670；found MALDI-MS:m/z 1044.2421。

化合物3-12c的合成：

化合物3-12c按照上述方法一合成得到。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.11 (s,1H),8.11(s,2H),7.57(d,J＝7.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.1Hz,2H),7.42(t,J＝ 8.1Hz,2H),7.26(t,J＝7.4Hz,2H),6.56(d,J＝13.8Hz,2H),6.40(d,J＝14.0Hz, 2H),4.99(s,2H),4.93(t,J＝7.0Hz,4H),4.31(m,4H),3.86(t,J＝7.0Hz,4H), 3.56-3.52(m,6H),3.19(s,6H),3.09(s,12H),2.83-2.78(m,8H),2.58(t,J＝6.6 Hz,2H),2.50-2.47(m,4H),2.11-1.99(m,12H),1.26(d,J＝14.7Hz,12H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ171.98,146.17,141.83,141.03,140.25,135.82, 128.62,126.48,125.37,123.07,122.51,111.65,102.12,62.58,60.39,50.64,49.90, 48.77,47.65,47.28,43.40,42.76,27.39,26.84,26.32,24.02,21.97,19.03,18.86.MS: calcd.for C₆₂H₉₁N₁₄O₉S₃ ⁺[M⁺]:1271.6250；found MALDI-MS:m/z1271.5363。

化合物3-13c的合成：

化合物3-13c按照上述方法一合成得到。MS:calcd.for C₈₀H₁₀₈N₁₉O₁₃ ⁺ [M⁺]:1542.8369；found MALDI-MS:m/z 1542.6571。

化合物3-14c的合成：

化合物3-14c按照上述方法一合成得到。MS:calcd.for C₁₀₃H₁₃₈N₂₇O₁₈ ⁺ [M⁺]:2041.0708；found MALDI-MS:m/z 2041.3165。

化合物3-15c的合成：

化合物3-15c按照上述方法一合成得到。MS:calcd.for C₁₂₂H₁₆₀N₃₅O₂₁ ⁺ [M⁺]:2451.2523；found MALDI-MS:m/z 2451.1848。

荧光光谱的测定

各化合物分别溶于DMSO中配制成储备液。使用时，用PBS(pH 7.4)或相应溶剂稀释至所需浓度。例如，化合物3-3c(2μM)溶于PBS，随后用荧光光谱仪测定该溶液的荧光光谱(激发波长790nm，发射波长范围800nm-900nm)。

光稳定性的测定

配制10μM探针3-3c或ICG的PBS溶液置于1.5mL离心管中，用785nm激光 (40mW)照射不同时间，分别在照射前、照射2min,5min,10min以及20min后用紫外-可见吸收光谱仪测定ICG以及3c溶液的吸收光谱。

细胞培养

HeLa，U87MG和A549细胞使用含10％胎牛血清及1％双抗的高糖DMEM 培养基在含5％CO₂的37度恒温恒湿培养箱中培养。

荧光成像

将约5×10⁴个HeLa或A549或U87MG细胞种在四孔玻底培养皿(In vitroScientific,D35C4-20-1-N)中并培养过夜。加入含有5μM相应化合物的新鲜培养基继续孵育24小时。随后将培养基移除并用1×PBS洗三遍，加入新鲜培养基置于倒置荧光镜(cy7通道)下进行成像分析。

肿瘤模型的建立

4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠购买于南京大学模式动物研究所(MARC)，所有动物实验均遵从南京大学动物保护和使用委员会的规章制度。将约2×10⁶个重悬于50μL DMEM/基质胶(1/1)中的U87MG细胞注射入裸鼠皮下指定位置。待肿瘤长至0.7-0.9cm(约10-15天)后，进行荧光成像实验。

活体荧光成像

通过尾静脉注射相应探针(5nmol)，注射前以及注射6小时后，用IVIS Lumina XRIII活体成像***进行荧光成像(激发滤光片：780nm；长通发射滤光片：840nm)。

荧光素酶报告基因检测

U87MG细胞种在24孔板(Corning)中，第二天使用Lipofectamine 2000将0.25 μg荧光素酶报告基因质粒转染进入细胞中。质粒转染4小时后，根据说明书提供的量使用Lipofectamine 2000将miRNA-34a(30pmol)或NIR-miR34a(30pmol) 或NC(30pmol)转染到相应细胞中。转染4小时后，将培养基换为新鲜培养基，继续孵育48小时。根据说明书使用荧光素酶测定试剂盒测量荧光素酶荧光信号。

抗体的近红外荧光标记

按照前述一般步骤得到3-11b(150nmol)反应液，取标记有炔基的抗体 Ce-Alkyne150μL(5mg/mL，PBS溶液)加入上述反应液，随后加入CuSO₄(75 nmol)，抗坏血酸钠(300nmol)以及THPTA(75nmol)并于室温下反应30min。反应完成后加入5mL PBS用10kd超滤管于4000转离心10分钟，重复三次并将剩余液体浓缩至150μL。所得溶液直接用于后续实验。

细胞表面抗体的近红外荧光标记及荧光成像

将约5×10⁴个A549细胞种在四孔玻底培养皿(In vitro Scientific, D35C4-20-1-N)中并培养过夜。加入或不加40μg/mL cetuximab孵育1小时，随后将培养基移除并加入含有1μM Hoechst 33342以及5μM Dio的新培养基继续孵育15分钟，随后移除培养基并用PBS洗三遍，接着加入按照前述一般步骤得到3-11b(5nmol)，同时加入CuSO₄(25μM),抗坏血酸钠(2.5mM)以及THPTA (125μM)，孵育10分钟后移除培养基并用PBS洗三遍，进行荧光成像。

¹⁸F标记荧光/PET双模态探针的制备以及PET成像

使用QMA柱捕获回旋加速器产生的¹⁸F离子，随后用300μL哒嗪-HCl缓冲液将¹⁸F离子洗到反应管中并加入30μL Alk-BF₃(25mM,溶于DMSO),于80 度反应30分钟。反应完后，反应液用5mL水稀释并通过Sep-Pak固相萃取柱，用水洗去游离的¹⁸F离子。标记好的[¹⁸F]Alk-BF₃用甲醇从C18柱上洗下并浓缩。在标记[¹⁸F]Alk-BF₃的同时，称取化合物3-2(0.75μmol)以及N₃-c-RGD(1.65 μmol)溶于100μL DMSO中，将硫酸铜(0.38μmol)，抗坏血酸钠(0.38μmol)， THPTA(0.38μmol)溶于10μL水中，加入前述溶液中，室温下，反应30分钟。反应完成后，加入叠氮化钠(3.75μmol)继续反应10分钟。反应完成后，加入已经标记好的[¹⁸F]Alk-BF₃，并补加硫酸铜(0.38μmol)，抗坏血酸钠(0.38μmol)， THPTA(0.38μmol)，继续反应30分钟。反应完成后，用半制备高效液相色谱分离纯化。浓缩后稀释为含10％乙醇的生理盐水溶液备用。U87MG移植瘤小鼠在进行PET扫秒前用2％的异氟烷麻醉并置于扫描床上，通过尾静脉注射探针 ¹⁸F-NIR(145.2μCi,200μL)，分别在注射探针后30min,60min,90min,120min 以及150min进行PET成像。

结果与讨论

串联点击反应的条件优化

首先我们对于该串联反应方法的反应条件进行了优化。首先针对点击反应我们分别筛选了几种常用的配体，包括三(2-苯并咪唑甲基)胺 (Tris(2-Benzimidazolylmethyl)amine，NTB)，三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基] 胺(Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine，TBTA)以及三(3-羟丙基*** 甲基)胺(THPTA)。如表1所示，不加入配体，点击反应也可以发生，但在30分钟内只有约一半原料转化为产物(产率49％)。加入配体NTB或TBTA，可以使产率进一步提高，而在加入THPTA的条件下，点击反应可以很快速的进行并在30分钟内几乎反应完全，通过HPLC分析转化率可以达到98％。不加入还原剂抗坏血酸钠或不加入催化剂硫酸铜的条件下，反应无法进行。因此，我们选择 THPTA作为配体，硫酸铜为催化剂，抗坏血酸钠为还原剂的条件进行点击反应。针对取代反应我们主要筛选了反应的溶剂与反应时间(表2)，我们发现该取代反应可以在室温下，于DMF或DMSO中快速进行，大量的水的存在会影响取代反应的进行，但考虑到点击反应的催化体系需要水作为溶剂，且我们希望利用此方法对一些生物大分子进行修饰，因此我们在反应体系中加入了20％的水并加大了叠氮化钠的用量(5当量)。我们发现在此条件下反应15分钟即可反应完全，并且在后续的反应中我们也验证了增加叠氮化钠的用量并不会影响后续的点击反应，因此我们选定DMSO/H₂O(5/1)为溶剂，反应时间为15分钟。第三步点击反应中，由于在第一步反应中已加入硫酸铜，THPTA，只需要在反应体系中补加少量抗坏血酸钠即可促进点击反应的进行，但其转化率只能达到约81％，此时补加0.5当量硫酸铜，THPTA以及抗坏血酸钠，继续反应30分钟即可使反应转化率达到90％以上(表3)。

第一步：点击反应

表1第一步点击反应的条件筛选

^a转化率由HPLC分析得出

第二步：取代反应

表2第二步取代反应的的条件筛选

^a转化率由HPLC分析得出

第三步：点击反应

表3第三步点击反应的条件筛选

^a转化率由HPLC分析得出

化合物3-3c的光学性质研究

筛选出最优条件后，我们首先利用此方法合成了带有三个PEG链的近红外荧光探针3-3c，由HPLC分析可知每一步都可以高转化率得到单一的产物，最终化合物的分离收率可以达到92％。如图3所示，其中(a)是串联反应合成探针3-3c 的流程图；(b)是串联反应合成探针3-3c每一步的HPLC分析。由于三氮唑取代的IR780是一种新的近红外荧光染料，我们首先测定了该类荧光染料在不同溶剂中的吸收以及荧光光谱，图4表示化合物3-3c(1μM)在不同溶剂中的吸收光谱 (a)以及荧光光谱(b)。化合物3-3c在质子性溶剂如水(PBS)和甲醇中，其最大吸收波长为790nm，最大发射波长为805nm(PBS)以及810nm(甲醇)。在非质子性溶剂如二氯甲烷和DMSO中，其最大吸收波长红移至803nm，最大发射波长红移至818nm(二氯甲烷)与822nm(DMSO)。为了研究该类近红外荧光分子是否适用于进行成像研究，我们以临床上使用的近红外荧光染料ICG 作为对比，测定了化合物3-3c的相关光学性质与稳定性。在水溶液(PBS,1×)中，化合物3-3c的最大吸收波长在790nm左右，相比较ICG(最大吸收波长780nm) 红移约10nm。化合物3-3c的最大发射波长为805nm，相比ICG(最大发射波长800nm)红移约5nm。值得注意的是，相同浓度(1μM)的化合物3-3c的吸收以及荧光强度显著高于ICG。图5表示探针3-3c和ICG(1μM,PBS,pH＝7.3) 的吸收光谱(a)以及荧光光谱(b)。化合物3-3c激发波长为790nm，ICG激发波长为780nm。表4列出ICG以及3-3c的光学性质。经测定化合物3-3c的摩尔消光系数为186600M^-1cm^-1，绝对荧光量子产率为3.22％，高于相同条件下ICG的摩尔消光系数(83600M^-1cm^-1)与绝对荧光量子产率(1.90％)。

表4 ICG以及3-3c的光学性质

^aICG与3c的最大激发波长、最大发射波长、绝对荧光量子产率以及摩尔消光系数均在PBS(1×,pH＝7.3) 中测定。

^β绝对荧光量子产率的定义为QY＝PN_em/PN_ab,其中PN_em和PN_ab分别表示荧光材料发射以及吸收的光子数。 ICG激发波长为780nm，3c激发波长为790nm。

我们进一步研究了化合物3-3c在不同pH溶液中的荧光以及吸收光谱的变化。图6表示化合物3-3c(1μM，PBS)在不同pH溶液中的吸收光谱(a)与荧光光谱 (b)。(c)化合物3-3c(1μM，PBS)在不同pH下790nm处的吸光度。(d)化合物3-3c(1μM，PBS)在不同pH下805nm处的荧光强度。激发波长为790nm。在pH为3.0-10.0的范围内化合物3-3c的吸收以及荧光基本保持稳定，随pH增加而略有下降。在酸性较强(pH<2.0)或碱性较强(pH>11.0)时，其吸收与荧光强度有较大程度的降低。以上结果表明该化合物在正常生理环境的pH下具有较稳定的光学性质，适合进行成像研究。

虽然ICG已广泛应用于科学研究与临床中，但在光照下易发生光氧化而限制了其进一步的应用。图7表示10μM探针3-3c(a)或ICG(b)的PBS溶液用 785nm激光(40mW)照射前与照射2min,5min,10min以及20min的吸收光谱。 (c)785nm激光照射2min,5min,10min以及20min后790nm处吸光度与照射前的比值(A/A₀)。，用785nm激光(40mW)照射2分钟后，ICG溶液(10μM)在 780nm处的吸收即降低了约30％，随着照射时间的增加，其吸光度快速降低。在照射20分钟后，ICG溶液的吸光度降低到未照射时的15％，这说明了约85％的ICG已经降解。与之相比，在相同条件下用激光照射2分钟后，3-3c溶液在 790nm处的吸光度仅降低了4％，在照射20分钟后，仍有约50％的3-3c保持稳定。以上结果说明，我们所构建的新型近红外荧光染料的光稳定性相比ICG大大提高，因此更适用于进行近红外荧光成像研究。

串联反应底物适用性研究

在筛选出串联反应每步的最优条件后，我们首先研究了该方法的底物适用性。

串联反应应用于构建含不同官能团化合物

该串联反应方法可以与烷基叠氮以及烷基炔反应，以较高产率得到含有三个烷基链的近红外荧光分子3-4c，而且羟基以及羧基的存在不会影响各步的反应效率(化合物3-5c，分离收率72％；化合物3-6c，分离收率79％)。对于芳基叠氮以及芳基炔也可以高产率的得到对应产物(化合物3-7c，分离收率71％)且取代反应不会影响芳基叠氮或芳基炔苯环上的取代基(化合物3-8c，分离收率69％)。除此之外，该方法还可以构建含有杂环的近红外荧光分子(如含有三个吡啶基团的化合物3-9c，分离收率83％)。由于3-4c～3-9c化合物较为疏水，我们在用串联反应方法合成时进一步降低了水的用量(方法二)。3-4c～3-9c六个化合物的分离收率相比3-3c较低，这可能是由于化合物疏水性较强，在用半制备高效液相色谱分离纯化时损失较大。我们进一步测定了化合物3-4c～3-9c 的吸收光谱。在图8中，(a)化合物3-4c～3-9c的化学结构；(b)化合物3-4c～3-9c 最大吸收以及最大发射波长总结；化合物3-4c～3-9c(1μM,PBS/DMSO＝3/7, v/v)的吸收光谱(c)和荧光光谱(d)。激发波长795nm。在PBS/DMSO(3/7,v/v) 溶剂中，化合物3-4c～3-9c的最大吸收在795-800nm，最大发射波长在812nm -816nm。

构建不同电性的近红外荧光小分子

利用一锅三步串联反应方法构建不同电性的探针3-10c，3-11c以及3-12c。

在筛选出合适的反应条件后，我们首先利用此策略以较高的收率快速构建了正电性的3-10c，负电性的3-11c以及电中性的3-12c并测定了各探针的吸收光谱以及荧光光谱。在图9中，(a)探针3-10c～3-12c的化学结构；(b)探针3-10c～ 3-12c最大吸收以及最大发射波长总结；(c)探针3-10c～3-12c(1μM,PBS)的吸收光谱；(d)探针3-10c～3-12c(1μM,PBS)的荧光光谱。激发波长790nm。探针3-10c与探针3-12c的光学性质类似，探针3-10c的最大吸收波长与最大发射波长分别794nm与809nm，探针3-12c的最大吸收与最大发射波长分别794nm 与811nm。探针3-11c的吸收光谱与荧光光谱略有蓝移，最大吸收与最大发射波长为790nm和805nm。

我们将合成的三种不同电性的近红外荧光探针分别与HeLa细胞进行孵育，并进行荧光成像，如图10所示，HeLa细胞与5μM不同电性的近红外荧光小分子3-10c，3-11c或3-12c孵育24小时并继续与1μM细胞核染料Hoechest 33342 孵育15分钟后的荧光成像，标尺：20μm。与电正性的探针3-10c孵育后，细胞内出现了明亮的近红外荧光，而在相同条件下与负电性的探针3-11c孵育的细胞中仅有非常弱的近红外荧光，说明相比3-11c，电正性的探针3-10c更容易被细胞所摄取，这主要是由于静电相互作用，正电性的化合物更容易被负电性的细胞膜所吸引从而增大细胞的摄取。此外，实验发现细胞与电中性的3-12c孵育后，细胞内的荧光强度也明显弱于与3-10c进行孵育的细胞，这说明含有内盐形式的正负离子对的化合物3-12c也较难被细胞摄取。以上实验说明了该串联反应方法可以用于快速构建不同电性的近红外荧光小分子，通过改变荧光小分子所带的电性，可以调节细胞对于探针分子的摄取。

构建含有不同数量靶向基团的近红外荧光探针

利用一锅三步串联反应方法构建含不同数量靶向基团的化合物3-3c，3-13c，3-14c以及3-15c

验证了该方法可以用一些含叠氮、炔基的小分子快速构建不同性质的近红外荧光探针后，我们进一步用含叠氮或炔基的PEG和环状RGD(c-RGD)构建了含有不同数量靶向基团(环状RGD，c-RGD)的近红外荧光探针。利用该串联反应方法，高产率的得到了不含c-RGD的3-3c，含一个c-RGD基团的3-13c，含两个 c-RGD基团的3-14c以及含三个c-RGD基团的3-15c。我们首先测定了四个探针的光谱性质，如图11所示，(a)探针3-3c,3-13c～3-15c的化学结构；(b)探针3-3c, 3-13c～3-15c最大吸收波长以及最大发射波长总结；探针3-3c,3-13c～3-15c(1μ M,PBS)的吸收光谱(c)和荧光光谱(d)，激发波长790nm。随着c-RGD基团数量增加，探针的最大吸收略有红移(3-3c的最大吸收为790nm，3-13c的最大吸收为792nm，3-14c的最大吸收为793nm，3-15c的最大吸收为794nm)。相应的，探针的最大发射波长也略红移(3-3c的最大发射波长为805nm，3-13c的最大发射波长为 807nm，3-14c的最大发射波长为808nm，3-15c的最大发射波长为809nm)。

在进行细胞成像实验前，我们先细胞实验条件进行了优化，在图12中，(a) 不同浓度的3-15c与U87MG细胞孵育不同时间后的荧光成像，标尺:20μm；(b) 细胞荧光强度的定量分析。5μM 3-15c与U87MG细胞孵育24小时后，细胞内的荧光即达到最大，继续增加孵育时间，细胞的荧光几乎不再变化，说明在24 小时，细胞对探针摄取达到最大，因此我们选择24小时为最佳孵育时间。

为了研究在同一个小分子内引入不同靶向基团对探针靶向能力的影响，我们分别用5μM 3-3c，3-13c，3-14c以及3-15c分别与U87MG细胞进行孵育，在 24小时后，移除含探针的培养基并用PBS洗三遍，随后进行荧光成像。如图13 所示，U87MG细胞与5μM含不同数量c-RGD的近红外荧光探针3-3c，3-13c， 3-14c或3-15c孵育24小时并继续与1μM细胞核染料Hoechest 33342孵育15分钟后的荧光成像，标尺：20μm。U87MG细胞与不含RGD的化合物3-3c孵育 24小时后，细胞内几乎没有近红外荧光，说明化合物3-3c很难被U87MG细胞摄取。而随着分子中c-RGD数量的增加，细胞内的荧光逐渐增强，说明在探针中引入靶向基团c-RGD可以增加细胞对探针的摄取，而且在痛一个探针中引入更多的靶向基团可以进一步提高探针的摄取。

为了进一步探究c-RGD在细胞靶向成像中的所起的作用，我们先用50μM c-RGD与U87MG细胞进行孵育，使U87MG细胞表面的α_vβ₃整合素受体与c-RGD 结合，1小时后，移除培养基并加入含5μM 3-15c的新鲜培养基并继续孵育24 小时。在图14中，(a)U87MG细胞与5μM3-15c孵育24h，再与1μM Hochesst 33342孵育10min后荧光成像；(b)U87MG细胞与c-RGD(50μM)预孵育1小时后加入3-15c(5μM)孵育24小时，再与1μM Hochesst 33342孵育10min后的荧光成像；(c)HEK-293细胞与5μM 3-3c孵育24小时，再与1μM Hochesst 33342 孵育10min后荧光成像；(d)HEK-293细胞与5μM 3-15c孵育24小时，再与1μM Hochesst 33342孵育10min后荧光成像。标尺：20μm。当加入c-RGD预孵育(b) 后，细胞内的荧光强度相比不加c-RGD孵育的对照组(a)显著降低。接着我们用 α_vβ₃整合素受体表达量很少的HEK-293细胞分别与3-3c以及3-15c进行孵育， 24小时后，更换新鲜培养基并进行荧光成像，我们发现不论是与3-3c或3-15c 孵育的HEK-293细胞内均没有出现明显的荧光，这表明c-RGD基团在细胞对该系列探针的摄取过程中起着重要的作用。这些结果说明了在同一个小分子内引入数量更多的靶向基团可以增加探针的靶向性从而增加细胞对探针的摄取。

接下来我们在活体层面对比了这几个近红外荧光探针对U87MG肿瘤的靶向能力，我们分别将200μL3-3c，3-13c，3-14c或3-15c(5nmol)通过尾静脉注射入种有U87MG移植瘤的小鼠体内，在注射前(pre)以及注射后6小时进行荧光成像。如图15所示，(a)U87MG移植瘤小鼠通过尾静脉注射探针3-3c，3-13c，3-14c 或3-15c(5nmol)前(Pre)与注射6h后(Post)的荧光成像(激发滤光片：780nm，长通发射滤光片：845nm)。肿瘤的位置由箭头标示。(b)图15(b)中注射探针6 h后小鼠肿瘤部位荧光强度的定量分析。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)，*p <0.05,**p<0.01。如图15所示，注射探针6小时后，小鼠肿瘤部位可以看到明显的近红外荧光，并且随着c-RGD靶向基团数量的增加，肿瘤部位的荧光强度显著增强，这说明c-RGD靶向基团数量的增加，可以提高肿瘤组织对探针的摄取，从而产生更强的荧光信号。在注射探针6小时后，我们将小鼠处死，取出包括心、肝、脾、肺、肾、胃、肠以及肿瘤在内的主要器官并进行荧光成像。如图16所示，(a)U87MG移植瘤小鼠通过尾静脉注射探针3-3c，3-13c，3-14c或 3-15c(5nmol)6小时后主要器官的的荧光成像(激发滤光片：780nm，长通发射滤光片：845nm)；(b)图16(b)中肿瘤的荧光强度定量分析，数据以平均值± 标准偏差的形式表示(n＝3)。各探针均主要分布在肝脏以及肾脏中，说明探针主要是通过肝以及肾代谢的。与体内成像类似，肿瘤的荧光强度随c-RGD基团数量的增加而增加。以上实验结果说明，活体层面上，探针中靶向基团数量增加，可以显著提高U87MG肿瘤组织对于探针的摄取，进而提高探针对肿瘤组织的成像能力。此外，不限于同一种靶向基团，利用我们发展的串联反应策略，可以很方便的构建含有多种靶向基团的近红外荧光探针，从而可以更准确的对目标生物靶标进行荧光成像。

对miRNA进行近红外荧光标记

在前面的研究中，我们验证了“一锅三步”串联反应方法可以利用不同的小分子、环肽来快速构建具有不同性质、靶向性的近红外荧光探针，接下来我们研究了探针能否用于对一些生物大分子，如DNA，RNA等进行快速的近红外荧光标记。我们选用了3’端含有炔基的miRNA-34a，对其进行标记，通过简单的三步反应，在引入近红外荧光团的同时，引入靶向基团c-RGD从而可以将miRNA带入细胞中，发挥其生物学功能，并对其进行近红外荧光成像。通过HPLC分析可知，带炔基的miRNA-34a几乎完全转化为产物NIR-miR34a，我们将修饰后的 miRNA-34a用半制备HPLC进行分离纯化，冷冻干燥后得到了绿色粉末，通过质谱确认结构正确(图17)。图17表示串联反应方法对miRNA-34a进行荧光标记，(a)串联反应方法标记miRNA-34a并引入靶向基团的反应示意图；(b) Alkyne-miRNA-34a及标记反应后的HPLC分析；(c)标记后的NIR-miR34a的质谱分析。

为了验证经过修饰后的miRNA-34a的生物学功能是否受到影响，我们将 NIR-miR34a转染到HeLa细胞内，用未修饰的miRNA-34a以及无功能的随机序列NC进行对比。我们采用了含有在3’非翻译区的miRNA-34a的互补序列的荧光素酶报告基因***。通过该***，我们能评估经过修饰的NIR-miR34a是否能够与其互补序列结合来抑制荧光素酶的表达。如图18所示，NIR-miR34a(30 pmol)，miRNA-34a(30pmol)以及NC(30pmol)转染进入U87MG细胞后的荧光素酶报告基因实验。经过标记的NIR-miR34a与未经修饰的miRNA-34a均可以显著的抑制荧光素酶的表达，这说明了用该串联反应策略引入含有两个环状RGD靶向基团的及红外荧光小分子不会对miRNA-34a的生物学功能产生影响。

为了进一步验证NIR-miR34a可以通过环状RGD的靶向作用进入细胞发挥 miRNA-34a的功能，我们将在3’非翻译区含有miRNA-34a的互补序列的GFP 报告基因质粒转染进入HeLa细胞，因此细胞可以表达GFP绿色荧光蛋白。然后我们分别用Lipofectamine 2000将miRNA-34a或NIR-miR34a转染进入细胞，或在培养基中直接加入miRNA-34a或NIR-miR34a与细胞进行孵育，72小时后，对细胞进行荧光成像。如图19所示，HeLa细胞转染3’非翻译区含有miRNA-34a 的互补序列的GFP报告基因质粒，接着转染NC(30pmol)，miRNA-34a(30pmol)， NIR-miR34a(30pmol)或与1μMmiRNA-34a或1μMNIR-miR34a孵育72小时后的荧光成像，标尺：20μm。转染miRNA-34a和NIR-miR34a的细胞GFP 的表达量明显降低，而直接与miRNA-34a进行孵育的细胞，荧光强度与对照组细胞没有明显差别，说明单独的miRNA-34a很难进入细胞。当我们用修饰后的 NIR-miR34a与细胞进行孵育时，细胞内的荧光也有一定程度的降低，但其降低程度比转染miRNA-34a或NIR-miR34a的细胞略低。我们进一步进行了流式细胞实验，结果与细胞成像实验类似(图20)。在图20中，(a)HeLa细胞转染3’ 非翻译区含有miRNA-34a的互补序列的GFP报告基因质粒，接着转染NC(30 pmol)，miRNA-34a(30pmol)，NIR-miR34a(30pmol)或与1μM miRNA-34a或1 μMNIR-miR34a孵育72小时后的流式细胞实验；(b)图20(b)中各组细胞经相应方法处理后的平均荧光强度。这些结果说明了修饰过的NIR-miR34a由于引入了两个靶向基团，可以增加细胞对于探针的摄取，探针进入细胞后，miRNA序列可以发挥其生物学功能。这说明了，我们所发展的串联反应方法可以在不影响 RNA活性的情况下，在RNA上引入近红外荧光小分子，同时可以引入其他功能性基团，这对于RNA靶基因的寻找，在细胞、组织以及活体层面追踪RNA分布等研究具有重要的作用。

对抗体以及蛋白分子进行近红外荧光标记

我们使用表皮生长因子受体(EGFR)的抗体cetuximab，使用“一锅三步”串联反应策略对其进行近红外荧光标记以验证该策略能否用于抗体分子的标记。我们首先通过戊炔酸的NHS酯，将炔基修饰到cetuximab表面的氨基上，随后，通过串联反应策略将修饰了磺酸基的近红外荧光小分子3-11c修饰到cetuximab上。我们通过SDS-PAGE实验来验证cetuximab上是否成功修饰上了近红外荧光小分子。SDS-PAGE电泳结束后，我们首先对凝胶进行近红外荧光成像，得到凝胶的荧光显色条带，随后对凝胶进行考马斯亮兰染色。在图21中，(a)利用一锅三步串联反应策略对Cetuximab进行修饰的反应过程。(b)cetuximab、标记了炔基的Ce-Alkyne以及标记了近红外荧光分子的Ce-NIR的SDS-PAGE分析。从结果中我们可以看到，在还原性的胶中，出现了两个条带，分别为抗体的轻链和重链，在修饰近红外荧光小分子后，轻重链的分子量均有一定程度的增加，而且在近红外荧光成像我们可以发现，这两个条带具有明显的近红外荧光。在非还原性的胶中，修饰的抗体分子量显著增加，而且该条带也具有近红外荧光。以上结果说明了通过我们的串联反应方法可以快速的对抗体进行近红外荧光标记。

成功证明在cetuximab上修饰了近红外荧光分子后，我们将标记完的Ce-NIR 与EGFR高表达的A549细胞进行孵育并进行荧光成像。如图22所示，孵育1 小时后，在细胞膜表面出现了明亮的近红外荧光，该荧光与细胞膜染料Dio的荧光较好的重叠，说明标记后的抗体可以与A549细胞膜表面的EGFR结合。图22 表示A549细胞与Ce-NIR(40μg/mL)或3-11a(1μM)孵育1小时，与细胞膜染料 Dio(1μM)以及细胞核染料Hochesst 33342(1μM)孵育15分钟后的荧光成像。当我们用反应中间体3-11a与细胞进行孵育时，由于磺酸基的存在，染料很难进入细胞，因此细胞中或细胞膜上都没有近红外荧光出现。以上实验证明，通过三步串联反应标记了近红外荧光小分子的抗体没有失去活性，仍然可以与抗原结合。

为了进一步验证该串联反应方法能否直接用于在细胞培养的环境下直接对抗体分子进行标记，我们首先将A549细胞与标记了炔基的cetuximab孵育1小时，随后直接加入串联反应前两步的反应液，再加入2.5mM抗坏血酸钠，继续在37度孵育10分钟，随后移除培养基，用PBS洗三遍并进行荧光成像。如图 23所示，加入含炔基的抗体预孵育的A549细胞膜上出现了明显的近红外荧光，而未加入抗体的A549细胞则没有被标记上荧光。图23是原位click标记细胞膜表面的cetuximab抗体。A549细胞加入或不加Ce-Alkyne(40μg/mL)孵育1小时，与细胞膜染料Dio(1μM)以及细胞核染料Hochesst 33342(1μM)孵育15分钟后，加入串联反应前两步的反应液以及Sodium ascorbate(2.5mM),CuSO₄(25μM), THPTA(125μM)继续孵育10分钟，用PBS洗三遍后，进行荧光成像。这说明了该方法可以在细胞层面直接对抗体分子进行近红外荧光标记。

在证明该串联反应方法可以成功标记抗体后，我们尝试使用该方法对BSA 蛋白进行近红外荧光标记。在图24中，(a)利用一锅三步串联反应策略对BSA 进行近红外荧光标记反应过程图示；(b)BSA、标记了炔基的BSA-Alkyne以及标记了近红外荧光分子的BSA-NIR的SDS-PAGE分析。由于BSA肽链的34位有一自由巯基，因此我们先用含有炔基的马来酰亚胺与BSA中的巯基反应，在 BSA上标记上一个炔基。随后通过串联反应方法在BSA上引入了含有两个PEG 链的近红外荧光分子3-3a(a)。我们将BSA，BSA-Alkyne以及标记近红外荧光团后的BSA-NIR进行SDS-PAGE分析，在SDS-PAGE电泳结束后，我们首先对凝胶进行荧光成像(激发滤光片：780nm，长通发射滤光片：845nm)得到凝胶的近红外荧光显色条带，接着进行了考马斯亮兰染色。在(b)中，由于每个BSA 上只能标记一个近红外荧光分子(MW<1kD)，因此标记后的BSA条带位置与未标记的BSA相比没有明显差别，但在近红外荧光显色中则可以看到标记后的蛋白条带具有明显的近红外荧光而未标记的BSA蛋白未见明显的荧光。我们对BSA与标记后的BSA分别进行了质谱分析，ESI-MS确认了标记产物BSA-NIR。以上实验证明我们所发展的串联反应方法可以简单快速的在蛋白或抗体分子上标记近红外荧光团，通过这种方法标记的抗体与蛋白的生理活性不会受到影响。此外，我们可以在第一步的点击反应中使用含不同成像基团或其他功能基团的叠氮分子，实现多模态、多功能近红外荧光标记。在图25中，(a)BSA的ESI-MS 分析，(b)BSA-NIR的ESI-MS分析。

荧光/PET双模态分子影像探针的构建

在验证了我们所发展的串联反应方法可以高效率的构建含不同官能团的近红外荧光探针后，我们尝试用此方法构建荧光/PET双模态靶向探针。我们首先将化合物3-2与N₃-c-RGD进行点击反应引入环状RGD靶向基团，反应30分钟后加入叠氮化钠继续反应15分钟，随后加入¹⁸F标记好的小分子[¹⁸F]Alk-BF₃反应30分钟。反应完成后，通过半制备高效液相色谱分离纯化得到双模态探针 ¹⁸F-NIR。[¹⁸F]Alk-BF₃的保留时间在5.4min左右，反应30分钟后，5.4min左右的峰几乎完全消失，全部转化为探针¹⁸F-NIR的峰(保留时间14.1min)。我们用未标记¹⁸F的探针F-NIR进行质谱分析，确认探针结构正确。在图26中， (a)串联反应方法快速构建荧光/PET双模态探针¹⁸F-NIR；(b)串联反应方法构建双模态探针¹⁸F-NIR反应前后的放射性HPLC分析；(c)探针F-NIR的 MALDI-MS质谱分析。MS calcd.forC₁₀₀H₁₃₃BF₃N₂₈O₁₄ ⁺[M⁺]:2018.0596；found MALDI-MS:m/z 2018.2280。

在通过半制备得到¹⁸F标记的探针并除去乙腈后，我们将所得探针溶液用生理盐水稀释，通过尾静脉注射入U87MG移植瘤小鼠体内，分别在注射后30,60, 90,120以及150min进行PET成像。由图27可以看到，在注射探针30分钟后肿瘤部位即有较高的摄取(％ID/g约为4.3)，随着时间增加，肿瘤摄取量有进一步提高，在90分钟左右摄取量达到最大。另外随着正常组织内的探针逐渐被清除，肿瘤与肌肉组织信号比(T/M)逐渐增高。这也说明了我们的探针具有较好的肿瘤靶向能力，可以在肿瘤组织中停留较长时间。在图27中，(a)U87MG 移植瘤小鼠注射探针¹⁸F-NIR 30,60,90,120,150min后的PET成像图片(上图为冠状面，下图为横断面，肿瘤部位由红色箭头标出)；(b)肿瘤对探针的摄取量随时间变化的曲线；(c)肿瘤与肌肉摄取量的比值随时间变化的曲线。

同时，我们在注射探针F-NIR前、注射后0.5h,1h,2h,4h,8h以及24h 进行了荧光成像。如图28所示，在注射0.5h后，肿瘤位置的荧光强度迅速增加并达到最强，在0.5-8h内保持稳定并于8h后慢慢降低。该趋势与PET成像结果类似，肿瘤位置荧光在0.5h即达到最强可能是由于在此时间点正常组织中的探针未被清除，造成小鼠全身背景较强，使得测量出的肿瘤位置荧光较强。随着正常组织中的探针逐渐被清除，小鼠肿瘤部位与背景的信号比(T/B)逐渐增大，于8小时达到最高。通过近红外荧光成像以及PET成像说明我们所构建的靶向型荧光/PET双模态探针具有较好的肿瘤靶向成像能力。我们所发展的串联反应方法简单快速，产率高，因此对于构建多功能PET探针十分有利。

在图28中，(a)U87MG移植瘤小鼠通过尾静脉注射F-NIR(5nmol)前以及注射后30min,1h,2h,4h,8h以及24h的荧光成像。(激发滤光片：780nm；长通发射滤光片：845nm)肿瘤的位置由红色箭头标出，红色圆圈为肿瘤部位所取ROI，蓝色圆圈为背景所取ROI。(b)肿瘤部位荧光强度的定量分析。(c)肿瘤与背景荧光信号的比值(T/B)随时间变化曲线。

本发明提供了一种基于生物相容反应的“一锅三步”串联反应方法，用来快速构建多功能、多模态的近红外荧光分子。该反应方法以具有近红外荧光的IR780 衍生物为骨架，经过连续的点击反应、取代反应以及点击反应，可以高收率的实现多功能近红外荧光探针的构建。我们通过该方法构建了含不同电性、不用数量靶向基团的近红外荧光探针，并进行了荧光成像研究。利用该反应方法构建的含靶向基团以及近红外荧光分子的miRNA-34a可以被细胞摄取并发挥其生物学功能。该方法还可以高效率的实现抗体，蛋白等生物大分子的近红外荧光标记。相比较以往的标记方法，该串联反应方法简单，易实行，标记效率高。此外，我们利用该方法构建了含有两个c-RGD靶向基团的荧光/PET双模态探针¹⁸F-NIR，该探针对于α_vβ₃高表达的肿瘤具有较好的靶向成像效果。此串联反应在构建含有多个功能基团以及成像基团的复杂分子时，具有很大的优势。