CN112516310B - 一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法及其应用，该纳米前药的制备方法如下：首先将透明质酸的葡萄糖醛酸环用高碘酸钠部分氧化得到含有醛基的透明质酸，得到的产物再与阿霉素和氨基二茂铁通过亚胺键连接，得到透明质酸前药，再通过超声辅助自组装法制备得到前药纳米颗粒。该前药纳米颗粒生物相容性好，体外稳定性好，通过亚胺键同时负载两种抗癌药物阿霉素和氨基二茂铁，具有pH敏感性，可在肿瘤酸环境中选择性大量释放药物，并实现了化学疗法和化学动力学疗法的联合引用，显著提高治疗效果，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用，提高药物使用的安全性，在抗肿瘤药物控制释放领域中的具有广阔的应用前景。

Description

一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法及其应用
技术领域
本发明设计生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法及其应用。
背景技术
因非传染性疾病死亡的人数现在占全球死亡人数的绝大部分，癌症预计将成为21世纪世界各国人民非正常死亡的头号死因和提高预期寿命的最大障碍。根据世界卫生组织2015年的估计，在全球172个国家中，有91个国家的数据显示癌症是其70岁一下年龄段人口的第一或第二大死亡原因，另有22个国家，癌症在其非正常死因中排名第三或第四。
科学家们进行了许多的研究，以改进几种癌症治疗方法，并减少疾病的转移和复发。因此，在过去的几十年中，人们一直在努力通过引入纳米药物递送***将治疗剂转移到肿瘤区域，事实证明，这种药物比常规的癌症治疗方法更有效、更安全。在临床实践中，纳米粒(Nanoparticles，NPs)作为药物输送***比传统的全身给药***显示出几个优点，包括：(Ⅰ)克服了溶解度有限的问题，保护有效载荷不会失活或生物降解；(Ⅱ)延长有效载荷的循环时间，而不会迅速从体内清除；(Ⅲ)通过被动或主动靶向机制在肿瘤部位提供更高浓度的药物；(Ⅳ)在一个治疗平台上提供多种药物，以实现协同作用；(Ⅴ)通过刺激敏感的药物释放***控制/持续释放特定于肿瘤部位的有效载荷；(Ⅵ)通过NPs介导的内化克服多药耐药和外排转运蛋白；(Ⅶ)提高治疗效率，同时减少药物的***生物分布和***毒性。此外，在临床前研究中，NPs在进行多模式协同治疗(例如化疗和热疗)的同时能够监测治疗进展。
阿霉素，作为一种广谱的抗肿瘤药物被广泛用于各种癌症的临床治疗。作为蒽环类抗癌剂，阿霉素通过抑制拓扑异构酶II，破坏核DNA和诱导活性氧来介导细胞死亡。一方面，通过主要位于线粒体的还原酶的催化，阿霉素的糖苷配基部分的氧化导致形成半醌自由基，该自由基可以通过使用O2作为电子受体迅速还原为母体化合物。该氧化还原循环导致形成超氧化物(例如超氧阴离子自由基)，其自发地或通过超氧化物歧化酶转化为过氧化氢(H2O2)。另一方面，特别是在癌细胞中，阿霉素可以激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidases,NOXs)，它可以通过膜传输电子。活化的NOXs可以催化NADPH生成NADP+，同时释放电子。然后氧气接收电子以产生超氧阴离子自由基，其通过超氧化物歧化酶进一步经历歧化反应产生H2O2。
作为细胞内氧化物的主要成分，H2O2在正常组织中在20nM左右，而在癌组织中由于过量的H2O2积累其水平高达50—100μM。作为癌症治疗的一种新颖的策略，利用Fenton反应产生的ROS介导的化学动力学疗法(Chemodynamic therapy，CDT)在对抗癌细胞方面已显示出显着的功效，CDT通常利用Fe2+和Fe3+介导的Fenton反应催化弱酸性肿瘤微环境中过量的H2O2生成羟基自由基(·OH)，并以此来破坏并杀死癌细胞。·OH相对于H2O2和通过光动力触发产生的1O2具有更强的氧化能力(E(·OH/H2O)＝2.80V，E(H2O2/H2O)＝1.78V，E(1O2/H2O)＝2.17V)，但·OH的半衰期较短仅约为10-9s，这意味着·OH很难扩散到远处，而仅触发与周围有机物质的氧化反应，比如DNA损伤、蛋白质中氨基酸的氧化和脂质中多不饱和脂肪酸的氧化，因此将用于催化Fenton反应的纳米催化剂直接递送至癌细胞中仅触发癌细胞内部的Fenton反应可以减轻对正常组织或细胞的损害。
综上所述，如何构建一种简单有效适用于体内的纳米药物递送***，通过化学动力学疗法增强化疗，在降低阿霉素毒副作用增强其疗效的同时实现其在肿瘤部位的富集，是本发明致力解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法及其应用，该纳米前药生物相容性好，体外稳定性好，实现了化学疗法和化学动力学疗法的联合引用，具有较好的抗肿瘤活性，在抗肿瘤药物控制释放领域中的具有广阔的应用前景。
为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
提供一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法，包括以下步骤：
(1)以高碘酸钠为氧化剂，使透明质酸部分氧化开环，羟基氧化成醛基，得产物OHA，化学反应式为：
Figure BDA0002830677400000021
(2)将步骤(1)得到的OHA与盐酸阿霉素和氨基二茂铁进行反应，盐酸阿霉素的氨基和氨基二茂铁的氨基分别与OHA的醛基反应形成具有pH敏感性的亚胺键，即得两亲性高分子前药OHA-DOX/AFc，其化学反应式为：
Figure BDA0002830677400000031
(3)将步骤(2)得到的两亲性高分子前药的水溶液，采用超声辅助自组装法制备得到肿瘤酸环境响应的纳米前药。
按上述方案，所述步骤(1)中，透明质酸结构单元与高碘酸钠的摩尔比为1：0.9～1.1。
按上述方案，所述步骤(2)中，盐酸阿霉素和氨基二茂铁的摩尔量总和占OHA摩尔量的50～70％；所述的盐酸阿霉素和氨基二茂铁的投料摩尔比为3～5：1。
按上述方案，所述步骤(1)中，透明质酸分子量为30000～48000Da。
按上述方案，所述步骤(1)中，将透明质酸溶于去离子水中得到透明质酸溶液，搅拌下逐滴加入高碘酸钠溶液并于30～50℃条件下避光搅拌4～5小时，使透明质酸部分氧化开环，随后加入乙二醇继续搅拌30～60分钟终止反应，经透析、冷冻、干燥后得到产物OHA。
优选地，乙二醇与高碘酸钠用量的摩尔比为1：2～5。
优选地，所述的透析截留分子量为3500。
优选地，所述的透析介质为去离子水，用量为透明质酸溶液体积的60～100倍。
优选地，所述的透明质酸溶液的浓度为18～22mg/mL；所述的高碘酸钠溶液的浓度为0.4～0.6mol/L。
按上述方案，所述步骤(2)中，将OHA溶于甲酰胺中得到OHA溶液，在搅拌下加入盐酸阿霉素和氨基二茂铁，调节pH至8～9，在30～50℃条件下继续搅拌48～72小时，经透析、冷冻、干燥后得到具有pH敏感性的两亲性高分子前药OHA-DOX/AFc。
优选地，所述的透析截留分子量为3500。
优选地，所述的透析为先用50～70倍体积的甲酰胺透析24～36小时，再用100～150倍体积的去离子水透析48～72小时。
按上述方案，所述步骤(3)中，将pH敏感性的两亲性高分子前药溶于去离子水中得到浓度为0.1～1.5mg/mL的前药溶液，间歇脉冲超声20～60min，超声功率为150～250W，制备得到肿瘤酸环境响应的纳米前药。
提供一种上述方法制备得到的肿瘤酸环境响应的纳米前药在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物同时负载药物阿霉素和氨基二茂铁。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
1.本发明以价廉易得、水溶性好、生物相容性良好的天然高分子透明质酸作为载体，通过具有pH敏感特性的亚胺键同时与两种抗癌药物阿霉素和氨基二茂铁偶联，然后自组装得到纳米前药，所得纳米前药具有pH敏感性，在正常体循环中可以控制抗癌药物的释放，而达到肿瘤酸环境时，阿霉素和氨基二茂铁会大量释放出来，提高治疗指数，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用，提高药物使用的安全性。
2.本发明同时负载两种抗癌药物阿霉素和氨基二茂铁，在肿瘤细胞酸性环境中两种药物同时释放，阿霉素在抑制肿瘤细胞的同时诱导细胞产生过氧化氢，氨基二茂铁则催化肿瘤细胞内高水平的过氧化氢(包括肿瘤细胞的特有的和阿霉素诱导产生的过氧化氢)生成氧化性更强的羟基自由基杀伤肿瘤细胞，从而实现协同作用增强疗效；本发明纳米前药同时负载阿霉素和氨基二茂铁，实现了化学疗法和化学动力学疗法的联合引用，同等抑制作用下减少了阿霉素的使用，在增效的同时降低了阿霉素的毒副作用，在抗肿瘤药物控制释放领域中的具有广阔的应用前景。
3.本发明通过简单的氧化和席夫碱反应两步合成方法即实现了阿霉素和氨基二茂铁在透明质酸上的同时负载，反应条件温和易于控制，反应原料廉价易得性质稳定，制备过程操作简单，所得纳米前药体外稳定性好，有利于工业化生产应用。
4.本发明两亲性高分子前药可自组装形成纳米颗粒得纳米前药，并可通过结构中透明质酸与CD44受体作用将纳米前药靶向至肿瘤，提高纳米前药的选择性；同时纳米前药的平均粒径大小在100～250纳米之间，可通过增强的渗透和保留效应在肿瘤部位积蓄，实现药物在肿瘤部位的富集，增强治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中中间产物OHA核磁图谱(1H NMR)。
图2为对比例4中高分子前药NPs(AFc)的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)。
图3为对比例3中高分子前药NPs(DOX)的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)。
图4为实施例1中高分子前药NPs(DOX4/AFc)的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)。
图5为实施例1中HA、OHA、OHA-DOX4/AFc和对比例4中OHA-AFc以及对比例3中OHA-DOX的红外光谱图。
图6为实施例1中纳米前药NPs(DOX4/AFc)的粒径分布与透射电镜图。
图7为实施例1中纳米前药NPs(DOX4/AFc)的阿霉素体外累积释药结果。
图8为实施例1中纳米前药NPs(DOX4/AFc)的氨基二茂铁体外累积释药结果。
图9为实施例1中纳米前药NPs(DOX4/AFc)的稳定性结果。
图10为实施例1中OHA的体外毒性实验结果。
图11为对比例3中NPs(DOX)的体外毒性实验结果。
图12为对比例4中NPs(AFc)的体外毒性实验结果。
图13为对比例1中NPs(DOX1/AFc)、对比例2中NPs(DOX2/AFc)和实施例1中NPs(DOX4/AFc)的体外4T1细胞毒性实验结果。
图14为对比例1中NPs(DOX1/AFc)、对比例2中NPs(DOX2/AFc)和实施例1中NPs(DOX4/AFc)的体外HUVEC细胞毒性实验结果。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
实施例1
提供一种肿瘤酸环境响应的纳米前药NPs(DOX4/AFc)的制备方法，包括以下步骤：
1)将2.0g透明质酸(分子量48000Da，透明质酸结构单元摩尔量为5.0mmol)溶解于100mL去离子水中得到透明质酸溶液，将透明质酸溶液装入250mL单口烧瓶中，搅拌下逐滴加入10mL高碘酸钠溶液(0.5mmol/mL)并在40℃条件下继续避光搅拌反应4h，随后加入1mL乙二醇搅拌30min终止反应，所得反应溶液用6L去离子水避光透析(MWCO 3500)三天，冻干后得到白色海绵状OHA。
2)将100mg OHA(0.25mmol)溶于20mL甲酰胺中并转移至100mL单口烧瓶中，搅拌下加入68.7mg盐酸阿霉素(DOX·HCl)(0.118mmol)和6.0mg氨基二茂铁(AFc)(0.030mmol)，用三乙胺调节溶液pH至8～9，于40℃避光搅拌反应48h，反应结束后将溶液先用1L DMF避光透析(MWCO 3500)一天，再用2L去离子水避光透析(MWCO3500)两天，所得溶液冻干后得到***海绵状OHA-DOX4/AFc。
3)称取50mg OHA-DOX4/AFc溶于50mL去离子水溶，待完全溶解后，将所得溶液放在细胞破碎仪探头下超声20min(间歇脉冲，脉冲时间2s，间歇时间2s，输出功率200w)，利用超声辅助纳米粒自组装，超声完毕后用0.8μm滤膜过滤溶液以除去杂质，随后将滤液冻干，即得到肿瘤酸环境响应的纳米前药NPs(DOX4/AFc)。
取5mg NPs(DOX4/AFc)纳米粒分散于5mL去离子水中制成1mg/mL的溶液，然后在细胞破碎仪中超声处理10min使纳米粒分散均匀，取一滴纳米粒溶液滴于300目的铜网上，用滤纸吸除多余的溶液，待铜网风干后用透射电子显微镜(Transmission electronmicroscope,TEM)观察纳米粒的形貌，结果见图6。
对比例1
提供一种纳米前药NPs(DOX1/AFc)的制备方法，包括以下步骤：
1)将2.0g透明质酸((分子量48000Da，透明质酸结构单元摩尔量为5.0mmol))溶解于100mL去离子水中得到透明质酸溶液，将透明质酸溶液装入250mL单口烧瓶中，搅拌下逐滴加入10mL高碘酸钠溶液(0.5mmol/mL)并在40℃条件下继续避光搅拌反应4h，随后加入1mL乙二醇搅拌30min终止反应，所得反应溶液用6L去离子水避光透析(MWCO 3500)三天，冻干后得到白色海绵状OHA。
2)将100mg OHA(0.25mmol)溶于20mL甲酰胺中并转移至100mL单口烧瓶中，搅拌下加入43.1mg盐酸阿霉素(0.074mmol)和15.0mg氨基二茂铁(0.074mmol)，用三乙胺调节溶液pH至8～9，于40℃避光搅拌反应48h，反应结束后将溶液先用1L DMF避光透析(MWCO 3500)一天，再用2L去离子水避光透析(MWCO 3500)两天，所得溶液冻干后得到***海绵状OHA-DOX1/AFc。
3)称取50mg OHA-DOX1/AFc溶于50mL去离子水溶，待完全溶解后，将所得溶液放在细胞破碎仪探头下超声20min(间歇脉冲，脉冲时间2s，间歇时间2s，输出功率200w)，利用超声辅助纳米粒自组装，超声完毕后用0.8μm滤膜过滤溶液以除去杂质，随后将滤液冻干，即得到纳米前药NPs(DOX1/AFc)。
对比例2
提供一种纳米前药NPs(DOX2/AFc)的制备方法，包括以下步骤：
1)将2.0g透明质酸((分子量48000Da，透明质酸结构单元摩尔量为5.0mmol))溶解于100mL去离子水中得到透明质酸溶液，将透明质酸溶液装入250mL单口烧瓶中，搅拌下逐滴加入10mL高碘酸钠溶液(0.5mmol/mL)并在40℃条件下继续避光搅拌反应4h，随后加入1mL乙二醇搅拌30min终止反应，所得反应溶液用6L去离子水避光透析(MWCO 3500)三天，冻干后得到白色海绵状OHA。
2)将100mg OHA(0.25mmol)溶于20mL甲酰胺中并转移至100mL单口烧瓶中，搅拌下加入57.2mg盐酸阿霉素(0.099mmol)和9.9mg氨基二茂铁(0.049mmol)，用三乙胺调节溶液pH至8～9，于40℃避光搅拌反应48h，反应结束后将溶液先用1L DMF避光透析(MWCO 3500)一天，再用2L去离子水避光透析(MWCO 3500)两天，所得溶液冻干后得到***海绵状OHA-DOX2/AFc。
3)称取50mg OHA-DOX2/AFc溶于50mL去离子水溶，待完全溶解后，将所得溶液放在细胞破碎仪探头下超声20min(间歇脉冲，脉冲时间2s，间歇时间2s，输出功率200w)，利用超声辅助纳米粒自组装，超声完毕后用0.8μm滤膜过滤溶液以除去杂质，随后将滤液冻干，即得到纳米前药NPs(DOX2/AFc)。
对比例3
提供一种纳米前药NPs(DOX)的制备方法，包括以下步骤：
1)将2.0g透明质酸((分子量48000Da，透明质酸结构单元摩尔量为5.0mmol))溶解于100mL去离子水中得到透明质酸溶液，将透明质酸溶液装入250mL单口烧瓶中，搅拌下逐滴加入10mL高碘酸钠溶液(0.5mmol/mL)并在40℃条件下继续避光搅拌反应4h，随后加入1mL乙二醇搅拌30min终止反应，所得反应溶液用6L去离子水避光透析(MWCO 3500)三天，冻干后得到白色海绵状OHA。
2)将100mg OHA(0.25mmol)溶于20mL甲酰胺中并转移至100mL单口烧瓶中，搅拌下加入85.8mg盐酸阿霉素(0.148mmol)，用三乙胺调节溶液pH至8～9，于40℃避光搅拌反应48h，反应结束后将溶液先用1L DMF避光透析(MWCO 3500)一天，再用2L去离子水避光透析(MWCO 3500)两天，所得溶液冻干后得到红色海绵状OHA-DOX。
3)称取50mg OHA-DOX溶于50mL去离子水溶，待完全溶解后，将所得溶液放在细胞破碎仪探头下超声20min(间歇脉冲，脉冲时间2s，间歇时间2s，输出功率200w)，利用超声辅助纳米粒自组装，超声完毕后用0.8μm滤膜过滤溶液以除去杂质，随后将滤液冻干，即得到纳米前药NPs(DOX)。
对比例4
提供一种纳米前药NPs(AFc)的制备方法，包括以下步骤：
1)将2.0g透明质酸((分子量48000Da，透明质酸结构单元摩尔量为5.0mmol))溶解于100mL去离子水中得到透明质酸溶液，将透明质酸溶液装入250mL单口烧瓶中，搅拌下逐滴加入10mL高碘酸钠溶液(0.5mmol/mL)并在40℃条件下继续避光搅拌反应4h，随后加入1mL乙二醇搅拌30min终止反应，所得反应溶液用6L去离子水避光透析(MWCO 3500)三天，冻干后得到白色海绵状OHA。
2)将100mg OHA(0.25mmol)溶于20mL甲酰胺中并转移至100mL单口烧瓶中，搅拌下加入30mg氨基二茂铁(0.148mmol)，用三乙胺调节溶液pH至8～9，于40℃避光搅拌反应48h，反应结束后将溶液先用1L DMF避光透析(MWCO 3500)一天，再用2L去离子水避光透析(MWCO3500)两天，所得溶液冻干后得到淡黄色海绵状OHA-AFc。
3)称取50mg OHA-AFc溶于50mL去离子水溶，待完全溶解后，将所得溶液放在细胞破碎仪探头下超声20min(间歇脉冲，脉冲时间2s，间歇时间2s，输出功率200w)，利用超声辅助纳米粒自组装，超声完毕后用0.8μm滤膜过滤溶液以除去杂质，随后将滤液冻干，即得到纳米前药NPs(AFc)。
下面对实施例和对比例中的产物进行结构表征和性能测定。
1.结构表征
利用核磁共振波谱仪，以氘代水为溶剂分别测量得到OHA的1H NMR图谱和OHA-DOX、OHA-AFc、OHA-DOX4/AFc的1H,1H-COSY NMR图谱，结果见图1-4。其中图1为实施例1中中间产物OHA核磁图谱(1H NMR)；图2为对比例4中高分子前药OHA-AFc的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)；图3为对比例3中高分子前药OHA-DOX的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)；图4为实施例1中高分子前药OHA-DOX4/AFc的二维核磁图谱(1H,1H-COSY NMR)。
图1显示，其中9.2ppm处的峰为醛基质子信号，表明透明质酸成功氧化开环形成了醛基。在图2中可以清晰地看到AFc的1号质子与2号和3号质子在{3.9ppm，5.0ppm}和{3.8ppm，4.9ppm}处产生强相互作用信号，并且有与之对称的信号，可证明OHA-AFc的成功合成；在图3的OHA-DOX的图谱中，同样的，DOX的4号与5号质子和6号与7号质子分别在{1.3ppm，4.1ppm}和{3.8ppm，4.5ppm}处产生强相互作用信号，也有与之对称的信号出现，即证明OHA-DOX的成功合成；同样在图4的OHA-DOX4/AFc的图谱中可以很容易的找到AFc和DOX的相关质子相互作用的特征信号，表明OHA-DOX1/AFc的成功合成。
将实施例1中HA、OHA、OHA-DOX4/AFc和对比例3中OHA-DOX以及对比例4中OHA-AFc粉末分别与干燥的溴化钾粉末混合压片，通过傅里叶红外变换光谱仪在500-4000cm-1范围内进行扫描得到他们的红外吸收光谱曲线，结果见图5。
如图5所示，OHA的光谱曲线与HA的曲线相比较，在1736cm-1处出现新峰，为醛羰基的-C＝O的伸缩振动，证明醛基的生成；OHA-AFc的光谱曲线与OHA的光谱曲线比较，OHA-AFc曲线在865cm-1出现新峰，为茂环的＝C-H的变形振动，并且在1610-1660cm-1之间(C＝C伸缩振动)强度增加，证明AFc成功接枝于OHA上；OHA-DOX的光谱曲线与OHA的光谱曲线比较，OHA-DOX在1758cm-1的新峰为苯环骨架振动，1410cm-1处的新峰为苯环的C-H伸缩振动，说明DOX的成功接枝；OHA-DOX4/AFc的光谱曲线与OHA的光谱曲线比较，在1758、1410、865cm-1出现新峰，即说明DOX和AFc均成功接枝。
2.对对比例1中NPs(DOX1/AFc)、对比例2中NPs(DOX2/AFc)、对比例3中NPs(DOX)、对比例4中NPs(AFc)、实施例1中NPs(DOX4/AFc)、的粒径、表面电势和载药量的测定。
精密称取各纳米前药溶于20mL盐酸溶液(1M)中，避光搅拌24h，取反应液用紫外分光光度计测量其在481nm波长处的吸光度，带入阿霉素紫外吸收-浓度标准曲线后计算得到各前药中DOX的载药量；AFc的载药量则通过原子吸收光谱仪测量上述溶液中的铁元素的含量后计算得到。阿霉素载药量(DLCDOX)和氨基二茂铁载药量(DLCAFc)均通过式1计算得到。
Figure BDA0002830677400000091
式中cdrug表示盐酸溶液中测得的DOX或AFc的浓度(mg/mL)；Vsolution表示盐酸溶液的体积(mL)；mprodrug表示所称取的纳米前药的质量(mg)；Mdrug表示DOX或AFc的摩尔质量(g/mol)。
采用动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)法测定纳米前药的粒径和粒径分布系数(Polydispersity index,PDI)，取5mg纳米前药分散于5mL去离子水中制成1mg/mL的溶液，然后在细胞破碎仪中超声处理10min使纳米粒分散均匀，取适量溶液装入石英比色皿用激光粒度仪测定各纳米前药的粒径和PDI；取适量溶液装入激光粒度仪所用的电泳池中，液面应高过电极，以测量纳米前药的表面电势；所有样品均测量三次，测量结果如表1。
表1各纳米前药的载药量、平均粒径(Size)、粒径分布系数(PDI)和表面电势(Zetapotential)
Figure BDA0002830677400000092
图6是实施例1制备得到的NPs(DOX4/AFc)的粒径分布图与透射电镜图，从图中可以看出，纳米前药具有球形结构和较窄的粒径分布。
3.稳定性测试
取1mg NPs(DOX4/AFc)纳米前药分散于10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline，PBS)中制成0.1mg/mL的溶液，用细胞破碎仪超声处理10min后置于恒温培养箱中(100rpm，37℃)，每两天取少量溶液测量一次纳米粒的粒径和PDI，总共观测十天，以研究纳米前药在生理pH环境下的稳定性，结果见图9。
结果如图9所示，在十天内，纳米前药在生理pH 7.4的PBS中粒径与PDI变化较小，说明其在生理pH条件下具有良好的稳定性。
4.实施例1制备得到的纳米前药NPs(DOX4/AFc)的体外释药性能
根据中国药典2015中所描述的磷酸盐缓冲溶液的配制方法制备出pH5.0、5.6和7.4三种pH值的PBS，分别加入1％(v/v)的吐温-80混匀，因为DOX与与AFc的水溶性很差，所以需要表面活性剂来增加他们的溶解性。以PBS为释药研究的释放介质，分别称取三份8mgNPs(DOX4/AFc)分散在10mL三种pH值的PBS中，待分散均匀后装入透析袋(MWCO3500)内，将透析袋放入已装有40mL同样pH值PBS的50mL离心管中，随后将离心管放入恒温培养箱(100rpm，37℃)中孵育48h，分别在1、2、4、6、8、12、24、36、48h时取透析袋外透析袋外释放介质5mL并往离心管中补充5mL新鲜的释放介质，测量释放介质在481nm处的紫外吸收，通过阿霉素紫外吸收-浓度标准线计算得到释放介质中DOX的浓度，释放介质中的AFc浓度即通过原子吸收光谱仪测量。药物在48h内的累积释放度Q(％)通过式2计算得到。
Figure BDA0002830677400000101
式中cn和ci表示第n和第i次所取出的释放介质中DOX或AFc的浓度(mg/mL)；mdrug表示所称取的纳米前药中DOX或AFc的质量(mg)。
图7和图8是纳米前药的体外释药结果，从图中可以看出，纳米前药具有明显的pH敏感性，在微酸性环境中可以持续的释放出药物，这可以保证其在肿瘤部位大量释放药物。
5.OHA及纳米前药的体外细胞毒性试验
以CCK-8试剂盒来测定细胞的相对活力，并以此来研究OHA、NPs(AFc)、NPs(DOX)、NPs(DOX1/AFc)、NPs(DOX2/AFc)和NPs(DOX4/AFc)的对4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)和HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)的抑制作用。即将4T1细胞和HUVEC细胞以5×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中，每个孔包含100μL RPMI-1640完全培养基(含10％(v/v)FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素混合物)，孵育24小时(37℃，5％CO2)。此后，含有不同总药物(AFc+DOX)摩尔浓度的OHA、NPs(AFc)、NPs(DOX)、NPs(DOX1/AFc)、NPs(DOX2/AFc)和NPs(DOX4/AFc)的培养基替换掉每个孔中的培养基，继续孵育24小时后，弃去培养基，并补充100μL的含有CCK-8的新鲜培养基(10μL)，孵育2小时后，通过酶标仪测量450nm处的吸光度，用吸光度计算每个孔细胞的相对存活率(cell viability)，计算方法如式3所示。
Figure BDA0002830677400000111
式中ODsample为药物组的吸光度；ODcontrol为不加药物组的吸光度；ODblank为不含药物的培养基的吸光度。
图10为OHA的体外毒性实验结果；如图所示，OHA均未对4T1和HUVEC细胞产生明显的毒性作用，即使在浓度高达300μg/ml的高浓度下，两种细胞的存活率仍然保持在较高水平(90％以上)，这说明OHA的细胞毒性极弱，具有良好的生物相容性。
图11、12、13为游离药物和纳米前药对4T1细胞的抑制结果，所有纳米前药均显示出与游离药物相似的剂量依赖性毒性，它们对于肿瘤细胞具有更强的抑制作用；图14为纳米前药对HUVEC细胞的毒性结果，相对于纳米前药对4T1细胞的抑制结果而言，纳米前药对正常细胞的毒性较小。
6.纳米前药中阿霉素和氨基二茂铁协同性评价
采用协同系数(combination index,CI)来评价三种不同药物配比的纳米前药治疗的协同效果，计算方法如式4-2所示，其中IC50值根据细胞存活率用GraphPad Prism软件计算得到。
Figure BDA0002830677400000112
式中IC50(DOX)alone和IC50(AFc)alone表示DOX和AFc单独使用时的IC50值，IC50(DOX)pair和IC50(AFc)pair表示纳米前药的IC50值中DOX和AFc的量。当CI<1时证明药物具有协同效应；当CI＝1时证明药物产生加和效应；当CI>1时证明药物之间产生了拮抗作用。计算结果见表2：
表2各纳米前药的IC50值和CI值
Figure BDA0002830677400000113
Figure BDA0002830677400000121
由上表2中数据可以看出，对比例1的纳米前药NPs(DOX1/AFc)和对比例2的NPs(DOX2/AFc)的CI值分别为1.016和1.078，表明在这两种药物比例下，阿霉素和氨基二茂铁仅产生了加和效应甚至轻微的拮抗效应，而实施例1的NPs(DOX4/AFc)的CI值(0.878)则显示出两药物产生了协同效应，说明较大占比的阿霉素协同效果更好，这是由于足够多的阿霉素诱导细胞产生了更多的过氧化氢，而氨基二茂铁作为芬顿反应催化剂少量即可催化羟基自由基的产生。

Claims (9)

1.一种肿瘤酸环境响应的纳米前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以高碘酸钠为氧化剂，使透明质酸部分氧化开环，羟基氧化成醛基，得产物OHA，化学反应式为：
Figure FDA0003836319080000011
(2)将步骤(1)得到的OHA与盐酸阿霉素和氨基二茂铁进行反应，所述盐酸阿霉素和氨基二茂铁的摩尔比为3～5：1，盐酸阿霉素的氨基和氨基二茂铁的氨基分别与OHA的醛基反应形成具有pH敏感性的亚胺键，即得两亲性高分子前药OHA-DOX/AFc，其化学反应式为：
Figure FDA0003836319080000012
(3)将步骤(2)得到的两亲性高分子前药OHA-DOX/AFc的水溶液，采用超声辅助自组装法制备得到肿瘤酸环境响应的纳米前药。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，透明质酸结构单元与高碘酸钠的摩尔比为1：0.9～1.1；所述步骤(2)中，盐酸阿霉素和氨基二茂铁的摩尔量总和占OHA摩尔量的50～70％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，透明质酸分子量为30000～48000Da。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将透明质酸溶于去离子水中得到透明质酸溶液，搅拌下逐滴加入高碘酸钠溶液并于30～50℃条件下避光搅拌4～5小时，使透明质酸部分氧化开环，随后加入乙二醇继续搅拌30～60分钟终止反应，经透析、冷冻、干燥后得到产物OHA。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，乙二醇与高碘酸钠用量的摩尔比为1：2～5；所述的透明质酸溶液的浓度为18～22mg/mL；所述的高碘酸钠溶液的浓度为0.4～0.6mol/L；所述的透析去离子水的用量为透明质酸溶液体积的60～100倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将OHA溶于甲酰胺中得到OHA溶液，在搅拌下加入盐酸阿霉素和氨基二茂铁，调节pH至8～9，在30～50℃条件下继续搅拌48～72小时，经透析、冷冻、干燥后得到具有pH敏感性的两亲性高分子前药OHA-DOX/AFc。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的透析为先用50～70倍体积的甲酰胺透析24～36小时，再用100～150倍体积的去离子水透析48～72小时。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将pH敏感性的两亲性高分子前药溶于去离子水中得到浓度为0.1～1.5mg/mL的前药溶液，间歇脉冲超声20～60min，超声功率为150～250W，制备得到肿瘤酸环境响应的纳米前药。
9.一种权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的肿瘤酸环境响应的纳米前药在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物同时负载药物阿霉素和氨基二茂铁。
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