CN112501100B - 一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法 - Google Patents

一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联产1,2,4‑丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明提供了构建得到的重组大肠杆菌接种至种子培养基中，得到种子液，将种子液接种至含有木糖和葡萄糖的发酵培养基中，添加IPTG诱导培养，制备得到1,2,4‑丁三醇和聚羟基丁酸酯；本发明在已有利用木糖产丁三醇菌株的基础上引入以葡萄糖为底物的聚羟基丁酸酯途径，使原有菌株可以联产1,2,4‑丁三醇和PHB，提高了葡萄糖的附加值，而且联产菌株可以降低发酵成本，充分利用现有资源，并且通过对发酵条件的优化，也提高了1,2,4‑丁三醇和PHB的产量。

Description

一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法
技术领域
本发明涉及一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。
背景技术
1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol，BT)是一种手性多元醇类化合物，属于非天然化学品，化学式为C4H10O3，相对分子质量为106.12，表观与甘油相似，为无色无味、透明的油状液体，性质稳定易溶于水及醇类中，具有旋光性。
1,2,4-丁三醇广泛应用于工业生产及生活中，在军工方面，丁三醇作为前体物质可用来合成丁三醇三硝酸酯(BTTN)，BTTN是一种高能推进剂，因其具有冲击性小、热稳定性高、挥发性低等优点作为***油的优良替代品，BTTN也可用于生长因子以及缓解心绞痛、抗癌、抗病毒药物的合成；在医药领域，1,2,4-丁三醇(BT)可作为缓释剂，以及合成治疗胆固醇药物与艾滋病药物及抗癌药物的重要中间体；在高分子材料领域，使用1,2,4-丁三醇作为交联剂，可以提高聚合物的强度和硬度。除此之外，BT作为烟草行业添加剂，可以减弱硝基化合物及焦油对人体的毒害作用；在彩色显影液中添加BT可以增加其色彩度以及粘着力；BT能够抑制微生物生长，可以作为防腐剂的添加剂，增强防腐处理的效果。
聚羟基丁酸酯(PHB)是已知的多羟基烷酸酯(PHA)，被认为可以改变细胞内代谢流和氧化/还原状态，增强宿主的抗逆性。许多化学物质和材料，包括两个具有应用潜力的重要产品，BT和聚羟基烷酸酯(PHAs)，可以从生物上从可再生的基质中产生。由于其生物可降解性和生物相容性，已被广泛研究作为潜在的绿色替代品石油衍生聚合物的药物传输，农业，纤维工业和消费品。
目前，丁三醇生产主要以木糖和葡萄糖共底物发酵，由于本实验室前期敲除了木糖代谢途径上的基因xylAB，所以木糖仅用于生产丁三醇，而葡萄糖用于菌株的生长，葡萄糖的附加值较低。
由于1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯(PHB)的产物分别在胞外和胞内，从理论上来讲，可同时利用菌株发酵生产两种物质，但是目前还未有能够同时生产这两种物质的菌株，若能获得一株生产两种产物的菌株，并且通过对构建的工程菌株发酵过程进行条件优化，提高1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯(PHB)产量具有重要意义，同时也会为将多种廉价底物转化为多种高附加值产品奠定基础，尤其是如何在大规模生产如发酵罐水平中提升1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯(PHB)产量，以适应工业生产，成为研究的热点和难点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：
将发酵微生物接种至种子培养基中，得到种子液，将种子液接种至含有木糖和葡萄糖的发酵培养基中，添加IPTG诱导培养，制备得到1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯；
所述培养条件为，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L～1mmol/L，IPTG添加时间为发酵开始后1.5～2h，木糖添加时间为发酵开始后0～6h，初始葡萄糖消耗完之后补加5～10g/L葡萄糖，温度为32～37℃，转速为100～400rpm，通气比为0.50～0.75v/(v·min)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵微生物为重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌的按如下方法构建：以E.coli KXW3009为宿主细胞，以pRSFDuet为载体，过表达来自于真养产碱杆菌的phbCAB基因，所述pRSFDuet载体上连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的tac启动子。
在本发明的一种实施方式中，所述E.coli KXW3009的具体构建方法见“景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018”。
在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌单菌落接种到装有10mL种子培养基的50mL的摇瓶中，在37℃，150rpm摇床中培养7h，制备得到一级种子液。
在本发明的一种实施方式中，将一级种子液按照1％(v/v)的接种量，接种到装有250mL种子培养基的500mL的摇瓶中，37℃，150rpm摇床中培养8h，制备得到二级种子液。
在本发明的一种实施方式中，将二级种子液按照10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，编码所述phbCAB的核苷酸序列如GenBank:MH558939.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述培养条件为，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，IPTG添加时间为发酵开始后1.5h，木糖添加时间为发酵0h时，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养的温度为34～37℃，转速为250～300rpm。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养时，温度为37℃，转速为250rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为：酵母浸粉5.0～7.5g/L、氯化钠10～15g/L、蛋白胨10～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖10～15g/L，木糖20～30g/L，酵母粉5.0～7.5g/L，氯化钠10～15g/L，蛋白胨10～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基和种子培养基的pH为7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述培养为发酵罐培养，装液量为2.5L，发酵罐为5L发酵罐。
有益效果
(1)本发明提供了一种可用于利用大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。该方法通过优化工程菌株E.coli KXW3009A在5L发酵罐发酵过程中的培养温度、转速、诱导剂IPTG添加时间以及底物添加时间，使BT产量达到12.85g/L，PHB产量为4.01％(w/w)；其中，BT的产量比优化之前的产量(6.9g/L)提高了86.23％。
(2)本发明在实验室已有利用木糖产丁三醇菌株的基础上引入以葡萄糖为底物的聚羟基丁酸酯途径，使原有菌株可以联产1,2,4-丁三醇和PHB，提高了葡萄糖的附加值，而且联产菌株可以降低发酵成本，充分利用现有资源。
附图说明
图1：重组大肠杆菌发酵生产1,2,4-丁三醇和PHB的实验结果；其中，a：250mL摇瓶发酵培养；b：5L发酵罐发酵培养。
图2：改变木糖添加时间对1,2,4-丁三醇产量影响的实验结果；其中，a：木糖添加时间为0h时；b：木糖添加时间为6h时。
图3：改变IPTG添加时间对1,2,4-丁三醇和PHB产量影响的实验结果；其中，a：IPTG添加时间为1.5h时；b：IPTG添加时间为2h时。
图4：大肠杆菌在不同转速下联产1,2,4-丁三醇和PHB的实验结果；其中，a：转速为200rpm；b：转速为250rpm；c：转速为300rpm；d：转速为350rpm；e：转速为400rpm。
图5：大肠杆菌在不同温度下联产1,2,4-丁三醇和PHB的实验结果；其中，a：32℃下发酵培养；b：34℃下发酵培养；c：37℃下发酵培养。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L。
摇瓶发酵培养基：葡萄糖10g/L，木糖30g/L，酵母粉7.5g/L，氯化钠15g/L，蛋白胨15g/L，碳酸钙4g/L。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，木糖30g/L，酵母粉7.5g/L，氯化钠15g/L，蛋白胨15g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
代谢产物1,2,4-丁三醇(BT)产量的测定：将发酵液经6000rpm离心5min，取500μL上清液经0.22μm水系微孔滤膜处理，利用HPLC法检测发酵液中1,2,4-丁三醇的浓度；其中，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm，9μm)，流动相为5mmol/L H2SO4，柱温为60℃，流速为0.6mL·min-1，进样体积为20μL，检测器为示差折光检测器。
代谢产物聚羟基丁酸酯(PHB)产量的测定：取发酵48h的PHB合成细胞，离心收集1mL细胞，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，称量。称取以上完全干燥的干菌体，同时称取PHB标准样品约20mg转移至预先准确称重的带螺口的试管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2mL甲醇(含有3％硫酸)和2mL氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，沸水浴4h。待其完全冷却，打开酯化管并加入1mL去离子水，然后将盖子旋紧并激烈震荡10min，至体系完全充分混匀，此时将试管置于通风处中静置1h以分相；分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相用无水硫酸钠除去多余水分并离心过膜，然后加入到气相样品瓶中，待测。
实施例1：联产PHB和D-1,2,4-丁三醇重组菌株的构建
具体步骤如下：
phbCAB来自于真养产碱杆菌，其核苷酸序列GenBank:MH558939.1所示，将phbCAB通过同源重组酶(ABclonal公司)酶连接至pRSFDuet-tac载体的酶切位点SacⅠ和SalⅠ处(pRSFDuet-tac载体的构建方法为，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的tac连接至pRSFDuet载体的BamHⅢ和SalⅠ位点)，构建得到pRSFDuet-tac-phbCAB表达载体，将此表达载体转入大肠杆菌BL21中，在37℃下至长出单克隆，挑取单克隆并测序验证，得到阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即得到pRSFDuet-tac-phbCAB表达载体，将表达载体pRSFDuet-tac-phbCAB转入E.coli KXW3009，测序验证得到重组菌E.coli KXW3009A。
实施例2：重组大肠杆菌发酵生产PHB和D-1,2,4-丁三醇
具体步骤如下：
(1)将实施例1得到的重组大肠杆菌E.coli KXW3009A单菌落接种到装有10mL种子培养基的50mL的摇瓶中，37℃，150rpm摇床中培养7h，制备一级种子液；
(2)将步骤(1)得到的一级种子液以1％(v/v)的接种量，接种到装有250mL种子培养基的500mL的摇瓶中，37℃，150rpm摇床中培养8h，制备二级种子液；
250mL摇瓶发酵：将步骤(1)得到的一级种子液以1％(v/v)的接种量，接种到装有50mL摇瓶发酵培养基的250mL的摇瓶中培养；培养条件和结果如下所示：
5L发酵罐发酵：将步骤(2)得到的二级种子液以10％(v/v)的接种量，接种到5L发酵罐中培养；培养条件和结果如下所示：
在250mL摇瓶发酵培养过程中，发酵培养基的木糖和葡萄糖的添加时间为发酵开始后的2h时，发酵培养的条件为：2h时添加IPTG至0.5mmol/L，温度为37℃，转速为200rpm。
在5L发酵罐发酵培养过程中，发酵培养基的木糖和葡萄糖的添加时间为发酵开始后的2h时，发酵培养的条件为：2h时添加IPTG至0.5mmol/L，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖，温度为37℃，转速为200rpm，通气比为0.75v/(v·min)。
发酵培养48h，检测发酵液中重组大肠杆菌的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图1所示。
由图1可知，250mL摇瓶培养阶段，菌株在48h内消耗木糖21.02g，消耗葡萄糖10g，BT产量为10.30g/L，PHB为8.10％(w/w)。
5L发酵罐培养阶段，菌株在48h内消耗木糖27.00g，消耗葡萄糖14.60g，BT产量为6.90g/L，PHB为5.43％(w/w)。
实施例3：重组大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB过程中，改变木糖添加时间对发酵罐培养阶段1,2,4-丁三醇产量的影响
具体步骤同实施例2，区别在于，将实施例1得到的重组大肠杆菌E.coli KXW3009A在5L发酵罐发酵培养，培养过程中，发酵培养基的木糖的添加时间分别为0h和6h时，发酵培养的条件为：OD600为0.8时添加IPTG至0.5mmol/L，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖，温度为37℃，通气比为0.75v/(v·min)，转速为400rpm。
发酵培养48h，检测发酵液中重组大肠杆菌的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图2所示。由图2可知，在发酵0h时，在发酵培养基中添加木糖，菌株在48h内消耗木糖21.4g，消耗葡萄糖14.4g，菌体最终CDW为4.03g/L，BT产量为10.69g/L，摩尔转化率为0.7mol/mol；
在发酵开始6h时，在发酵培养基中添加木糖，菌株在48h内消耗木糖19g，消耗葡萄糖16.4g，菌体最终CDW为4.77g/L，BT产量为6.4g/L，摩尔转化率为0.48mol/mol。
可见，在发酵开始时，向培养基中直接添加木糖可以使BT产量达到更高。
实施例4：5L发酵罐发酵培养过程中，诱导剂IPTG的添加时间对发酵罐培养阶段重组大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的影响
具体步骤同实施例2，区别在于，将实施例1得到的重组大肠杆菌E.coli KXW3009A在5L发酵罐发酵培养，培养过程中分别在1.5h和2h时添加IPTG，发酵培养的条件为：添加IPTG终浓度为0.5mmol/L，发酵12h时补加5g/L葡萄糖和30g/L木糖，温度为37℃，通气比为0.75v/(v·min)，转速为400rpm。
发酵培养48h，检测发酵液中重组大肠杆菌的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图3所示。由图3可知，在发酵开始1.5h时添加IPTG，菌体24h后生长缓慢，菌体最终CDW为6.33g/L，BT产量为6.78g/L，摩尔转化率为0.29mol/mol，PHB为3.69％(w/w)；
在发酵开始2h时添加IPTG，菌体24h后生长缓慢，菌体最终CDW为5.89g/L，BT为6.29g/L，摩尔转化率为0.27mol/mol，PHB为2.35％(w/w)。
通过对比，发现在发酵开始1.5h时添加IPTG对大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB更有利。
实施例5：5L发酵罐发酵培养过程中，转速对发酵罐培养阶段重组大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的影响
具体步骤同实施例2，区别在于，将实施例1得到的重组大肠杆菌E.coli KXW3009A在5L发酵罐发酵培养，培养过程参数设置如下：添加IPTG终浓度为0.5mmol/L，IPTG添加时间为发酵开始后1.5h左右，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖，温度为37℃，通气比为0.75v/(v·min)，分别将转速设置为100rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm以及400rpm。
发酵培养48h，检测发酵液中重组大肠杆菌的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图4所示。由图4可知，培养转速为100rpm时，菌体不生长；
当发酵培养转速为200rpm时，菌株在48h内消耗木糖20.7g，消耗葡萄糖17.15g，菌体最终CDW为3.77g/L，1,2,4-丁三醇(BT)产量为8.97g/L，摩尔转化率为0.61mol/mol，多羟基丁酸酯(PHB)为4.25％(w/w)；
当转速为250rpm时，菌株在48h内消耗木糖26.02g，消耗葡萄糖15.19g，菌体最终CDW为4.98g/L，BT为12.85g/L，摩尔转化率为0.71mol/mol，PHB为4.61％(w/w)；
当转速为300rpm时，菌株在48h内消耗木糖25.06g，消耗葡萄糖19.39g，菌体最终CDW为6.26g/L，BT为10.52g/L，摩尔转化率为0.59mol/mol，PHB为4.12％(w/w)；
当转速为350rpm时，菌株在48h内消耗木糖23.91g，消耗葡萄糖18.62g，菌体最终CDW为7.34g/L，BT为5.92g/L，摩尔转化率为0.35mol/mol，PHB为5.75％(w/w)；
当转速为400rpm时，菌株在48h内消耗木糖26.66g，消耗葡萄糖19.46g，菌体最终CDW为7.53g/L，BT为6.47g/L，摩尔转化率为0.35mol/mol，PHB为3.76％(w/w)。
通过对比，发现转速为250rpm时，BT产量最高，而PHB产量也比较高，可以选为大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的最佳转速。
实施例6：5L发酵罐发酵培养过程中，温度对发酵罐培养阶段重组大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的影响
具体步骤同实施例2，区别在于，将实施例1得到的重组大肠杆菌E.coli KXW3009A分别在32℃、34℃以及37℃下于5L发酵罐发酵培养，培养过程参数设置如下：在发酵开始1.5h时添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖，转速为250rpm，通气比为0.75v/(v·min)。
发酵培养48h，检测发酵液中重组大肠杆菌的生物量以及各代谢产物的含量变化，检测结果见图5所示。
由图5可知，当发酵培养温度为32℃时，菌株在48h内分别消耗木糖和葡萄糖为21.08g和15.31g，菌体最终CDW为6.67g/L，BT产量为6.79g/L，摩尔转化率为0.46mol/mol，PHB为12.34％(w/w)；
当发酵培养温度为34℃时，菌株在48h内分别消耗木糖和葡萄糖为25.54g和15.01g，菌体最终CDW为5.62g/L，BT产量为12.66g/L，摩尔转化率为0.71mol/mol。PHB为7.94％(w/w)；
当发酵培养温度为37℃时，菌株在48h内分别消耗木糖和葡萄糖为26.02g和15.19g，菌体最终CDW为4.98g/L，BT产量为12.85g/L，摩尔转化率为0.76mol/mol，PHB为4.01％(w/w)。
我们对比可以发现，当培养温度为37℃时，BT产量达到最高，可以作为大肠杆菌联产1,2,4-丁三醇和PHB的理想培养温度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法
<130> BAA201474A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 60
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 120
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 180
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 240
cacacaggaa aca 253

Claims (2)

1.一种联产1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述方法为，发酵微生物为重组大肠杆菌；将所述 发酵微生物接种至种子培养基中，在37℃，150rpm摇床中培养7h，得到一级种子液，将一级种子液按照1％的接种量，接种到种子培养基中，37℃，150rpm摇床中培养8h，制备得到二级种子液；将二级种子液按照10％的接种量接种至含有木糖和葡萄糖的发酵培养基中，添加IPTG诱导培养，制备得到1,2,4-丁三醇和聚羟基丁酸酯，所述发酵培养基为：葡萄糖10～15g/L，木糖20～30g/L，酵母粉5.0～7.5g/L，氯化钠10～15g/L，蛋白胨10～15g/L；
所述培养条件为，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，IPTG添加时间为发酵开始后1.5h，木糖添加时间为发酵开始后0h，初始葡萄糖消耗完之后补加10g/L葡萄糖，温度为34～37℃，转速为250～300rpm rpm，通气比为0.50～0.75v/(v·min)；
所述重组大肠杆菌的按如下方法构建：以E.coli KXW3009为宿主细胞，以pRSFDuet为载体，过表达来自于真养产碱杆菌的编码核苷酸序列如GenBank:MH558939.1所示的phbCAB基因，所述pRSFDuet载体上连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的tac启动子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基和种子培养基的pH为7.0。
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