CN113215032B - 一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物学和生物技术，具体公开了一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其在果蔬采后保鲜中应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）M73，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.15464，保藏日期：2018年3月20日。该菌株通过诱变选育得到，具有广泛的抑菌谱和高抑制率。其发酵液、抑菌物质及采用其发酵液制备制剂用于防治软枣猕猴桃果腐病及其它真菌病害，具有效果好、可产业化生产，制备工艺简单，使用方法简单、无毒、无污染，绿色环保等优点。

Description

一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其菌 剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物学和生物技术，特别是一株用于抑制植物病原真菌生长的解淀粉芽孢杆菌M73及其在拮抗软枣猕猴桃采后病原菌中的应用。

背景技术

农业生产中真菌病害是一个常见的问题，真菌病害不仅会感染作物造成减产，甚至绝收，影响产品品质，而且会侵染采后的农产品，造成采后损失。植物病原真菌对植物的侵染除了会造成严重的经济损失，一些真菌产生的真菌毒素（如黄曲霉毒素B1等）会在食物中残留，严重威胁人们健康。世界各国每年农作物仓储中会有25-50%受到真菌侵染，可造成高达30%的仓储损失。使用化学杀菌剂是当前最常用的手段，化学杀菌剂可以很好的抑制或杀灭病原菌，起到很好的防治效果。然而，化学杀菌剂也存在许多不足。化学杀菌剂大部分会进入环境，污染环境水体，威胁其它生物，影响生态平衡。另外化学农药的作用机制固定，会使病原菌产生抗性。此外化学杀菌剂大多对人和动物有害，用于农产品会在植物的营养生长中积累，最终在农产品中产生化学农药残留，这可能会导致致癌、致畸以及致死的后果。

目前，已经开发出多种新的方法用于抑制植物病原真菌生长。生物农药便是很有希望的绿色农药。而产芽孢的芽孢杆菌属细菌可能是最有效的用于植物保护的生物杀菌剂之一。芽孢杆菌可以合成许多生物活性物质，这些物质可以抑制植物病原真菌的生长。芽孢杆菌杀菌剂的优点包括：可以高效的抑制病原菌，具有多种多样的抗菌机制，可以诱导植物的***抗性，可以促进植物的生长，具有形成生物被膜的能力，从而阻止植物病原真菌进入食物和传播。产芽孢的细菌，与其它的生物活性产品相比具有许多生物技术上的优势。如专利文献CN 105349459A公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。所获得的解淀粉芽孢杆菌GB1，分离自黄瓜老茎，该菌株具有的广谱抑菌作用，其能够抑制病原真菌分生孢子萌发、菌丝生长，并定植于伤口形成生物膜，有效阻止病原菌的侵染，抑制植物病原菌以及其他有害微生物的侵染繁殖，并具有促进植物生长的机制，产生植物激素促进植物生长发育，进而增加产量，但其抑菌能力有限。目前能够高效拮抗植物病原真菌的生防制剂还很少，因此筛选、选育出一种能够高效拮抗植物病原菌的微生物菌株，并制成微生物菌剂，通过生物防治的方式降低植物病害给农业生产带来的危害，非常必要。目前一种新型的常压室温等离子体(ARTP)诱变技术的兴起微生物的育种提供了便利。

猕猴桃是呼吸跃变型水果，在果实成熟过程中存在呼吸速率的突然升高，乙烯合成显著增加，果实急速***，糖分迅速增加。成熟后的猕猴桃因其高糖分，柔软果实极易破损，极不耐储运。近年来一种新的猕猴桃——软枣猕猴桃开始进入市场，与普通常见的美味猕猴桃、中华猕猴桃不同，软枣猕猴桃光滑无毛，果皮薄可以带皮食用，并且风味浓郁。软枣猕猴桃因为其食用方便，营养丰富，风味极佳，并且不易保存的特点在欧美市场上价格极高。因为其极高的价值和市场潜力，今年来软枣猕猴桃开始在我国大量栽培，软枣猕猴桃也是四川地区猕猴桃产区升级换代的主要品种之一。

软枣猕猴桃因为其光滑无毛，皮薄的特性在生长采摘和储运过程中，非常容易损伤表皮，又因为呼吸跃变的成熟方式，常温下很快成熟***，因而极易腐烂，货架期极短，目前除电商空运直送外，市场很难见到。

甲基环丙烯（1-MCP）是一种乙烯拮抗剂，可以竞争性结合乙烯受体，阻断乙烯作用，延缓果实的成熟，因而广泛用于果蔬、花卉的保鲜。

海藻酸钠是海藻产生的一种多糖，海藻酸钠无毒，水溶液具有较高的黏度，已被用作食品的增稠剂、稳定剂、乳化剂等，早在1938年就已被收入美国药典。海藻酸钠亲水性强，具有吸水性，可用于食品保水。并且海藻酸钠形成凝胶的条件温和，这可以避免敏感性药物、蛋白质、细胞和酶等活性物质的失活，可以作为优良的食品助剂。

我们的前期研究发现 软枣猕猴桃成熟后腐败的主要病原菌为霉菌，因此，结合1-MCP，海藻酸钠和B. amyloliquefaciens可以用于软枣猕猴桃的采后保鲜。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效拮抗植物病原真菌的解淀粉芽孢杆菌诱变菌株及微生物制剂和应用，该制剂可以有效防治植物真菌病害，从而减少化学农药的使用，保护环境，降低生产成本，提高产品品质。

本发明通过下述技术方案实现：

用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌诱变菌株M73，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为CGMCC NO.15464。

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）M73，是从俄罗斯引进具有较好抑菌能力的原始菌株，并通过ARTP诱变选育的诱变菌株。

通过对峙实验证明：所述解淀粉芽孢杆菌M73抑制多种病原菌的能力强于出发菌株。

本发明还提供了的一种含有解淀粉芽孢杆菌M73的水果保鲜剂。

所述微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌M73的总活菌数不低于8×10⁹个/g。

本发明进一步提供了所述微生物菌剂在防治软枣猕猴桃果腐病及其它真菌病害中的应用。

所述微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：将培养好的种子液按体积比1-3%的比例接种到发酵培养基中，28-37℃，培养48-60小时，得到发酵液；

步骤二：将步骤一的发酵液于65-90℃干燥至以重量百分比计的含水率低于5%，再加入10%的海藻酸钠得到M73微生物菌剂。

步骤一中，所述种子液通过下述方法获得：先将解淀粉芽孢杆菌菌株M73划线转接到PDA平板中，置于培养箱28-37℃恒温培养24-48小时；再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株M73 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，28-37℃摇床振荡培养24-48小时得到种子液。

步骤一中，所述发酵培养基包含以下组分：L-谷氨酸钠5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，葡萄糖20g，FeSO₄ 0.15mg，氯化钾 0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MnSO₄•H₂O 5.0mg，CuSO₄•5H₂0 0.16mg，蒸馏水1000 ml，pH 7.2，115℃下高压灭菌15 min。

本发明所述的微生物制剂通过采后软枣猕猴桃浸泡方式抑菌，实现对采后软枣猕猴桃保鲜。

本发明所述的微生物制剂还可以与MCP和海藻酸钠协同作用，实现对采后软枣猕猴桃更好的保鲜。其应用于采后软枣猕猴桃的方法是：（1）1-MCP准备：按照1-MCP片剂产品说明书方法，1-MCP药片用湿润滤纸包裹后，置于50x45x40 厘米密封塑料箱内反应12小时释放气体；（2）M73发酵液准备：M73菌液按2.5%接种Landy培养基，30℃ 、200 rpm发酵36小时至稳定期后期；（3）M73、海藻酸钠涂膜剂准备：M73发酵液准备与上面一致，然后按m/V加入 1%海藻酸钠，搅拌至完全溶解的粘稠溶液。（4）然后浸泡使用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供的用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）M73，通过对引进自俄罗斯的具有较好抑菌效果的菌株进行诱变选育得到，据有广泛的抑菌谱和很高效的抑制率,抑制灰霉菌达到化学农药腐霉利的效果。

2、本发明提供的含有解淀粉芽孢杆菌M73的微生物菌剂具有以下积极作用：

1）具有较好的防病作用：该菌剂中含有能够高效拮抗灰霉菌及其它真菌生长的解淀粉芽孢杆菌M73，且菌剂中该菌株的总活菌数达到8×10⁹个/g以上，将其覆盖在果实表面能够抑制腐败霉菌的发生，抑菌率达95%。

2）具有良好的保水作用：该菌剂施用后能够在水果表面形成保护膜，抑制病原菌生长，同时减少水分流失，维持果实品质。

3）无毒无污染无残留：该微生物菌剂是由解淀粉芽孢杆菌M73、培养基和海藻酸钠组成，不含任何有毒有害成份，在农业生产中使用具有无毒、无污染、无残留的优点，符合我国生产绿色食品的要求。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌M73及出发菌株对灰霉菌的抑制效果图。

图2为本发明解淀粉芽孢杆菌M73与化学农药腐霉利对灰霉菌的抑制效果图。

图3为本发明解淀粉芽孢杆菌M73产的脂肽图。

图4为本发明解淀粉芽孢杆菌M73产生的脂肽电喷雾质谱图。

图5为本发明解淀粉芽孢杆菌M73产生的脂肽抑菌效果图。

图6为本发明解淀粉芽孢杆菌M73形成生物被膜能力图。

图7为本发明解淀粉芽孢杆菌M73差异表达基因代谢通路。

图8为本发明解淀粉芽孢杆菌M73处理对软枣猕猴桃货架期影响。其中C：对照；M：1-MCP处理；MB：1-MCP和M73处理；MBS：1-MCP和M73及海藻酸钠涂膜处理。

具体实施方式

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌M73，结合实例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

一、以下为本发明实施例中所采用的培养基及其相应配方：

1、马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自然pH。马铃薯加适量自来水煮沸半小时后，八层纱布过滤，补足1000 ml水，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2、液体Landy培养基配方为：L-谷氨酸钠5g，MgSO₄.7H₂O 0.5 g，葡萄糖 20 g，FeSO4 0.15mg，氯化钾 0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MnSO₄•H₂O 5.0mg，CuSO₄•5H₂0 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.2，105℃下高压灭菌15min。

二、平板对峙测定抑制真菌活性的方法

具体步骤如下：

实验真菌在固体PDA培养基上培养1-7天（培养时间依据不同的菌株而定）后，在培养皿上用直径10mm的打孔器切下真菌菌块，并且放置在另一加入PDA固体培养基的培养皿上，间隔20mm分别放置抑制物，培养皿放置在24℃培养，真菌菌丝会在培养基上向4周扩散，如果抑制物有抑菌作用，菌丝生长就会收到抑制，抑制范围根据抑制物抑菌能力及浓度而定，最终在抑制物周围形成一个菌丝不能生长的抑菌圈。抑菌圈大小可以评估抑制物对真菌的抑制效果。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌M73的诱变选育

将引进自俄罗斯的解淀粉芽孢杆菌1841培养到指数期，用ARTP诱变处理后，涂板，挑选诱变菌株进行培养，将诱变菌株进行对比抑菌实验，选择抑菌作用明显提升的诱变菌株73号，命名为M73。

如图1所示，M73抑菌作用明显强于起始菌1841,1841的抑菌圈直径为18.25mm，M73为26.25mm，抑菌作用提高52%。

由此可见，经过诱变选育得到的解淀粉芽孢杆菌的抑菌能力出色，明显强于出发菌株。

实施例2 解淀粉芽孢杆菌M73抑菌能力评价

将解淀粉芽孢杆菌M73及化学农药腐霉利分别置于平板中央抑制灰霉菌，腐霉利按照说明书稀释500倍使用。如图2所示，腐霉利的抑菌圈直径为21mm，解淀粉芽孢杆菌M73的抑菌圈直径为26mm。

由此可见，解淀粉芽孢杆菌M73抑制灰霉菌的效果强于化学农药腐霉利。

实施例3 解淀粉芽孢杆菌M73的抑菌脂肽提取及成分鉴定

将解淀粉芽孢杆菌M73用Landy培养基培养48小时后，将发酵液离心去除菌体得到发酵液上清，加入5M盐酸至pH为2，沉淀2小时后，离心收集沉淀，用纯水清洗3次，干燥后用甲醇氯仿溶解，过滤得到滤液，在旋蒸得到脂肽粗提物，再用甲醇溶解重旋蒸等到较纯的脂肽。

如图3所示，得到的脂肽呈棕色。将得到的脂肽进行电喷雾质谱鉴定，如图4所示，主要成分为：C13 Kurstakins、C14 Iturin B、C15 Bacillomycin D、C15 Iturin A、C15Iturin B、C16 Bacillomycin D；Bacillibactin、C14 Surfactin A和C16 BacillomycinL。

由此可见，解淀粉芽孢杆菌M73可以产生多种脂肽抗生素，具有广泛的抑菌作用。

实施例4 解淀粉芽孢杆菌M73脂肽抑菌活性评价

将解淀粉芽孢杆菌M73及出发菌株1841发酵产生的脂肽分别提取纯化后，用DMSO溶解，配成10mg/mL的溶液进行抑菌实验，如图5所示，M73的脂肽抑菌圈直径为22mm—26.25mm,起始菌1841为15mm。

由此可见，进行诱变选育得到解淀粉芽孢杆菌M73产生的抑菌物质抑菌能力更强。

实施例5 解淀粉芽孢杆菌M73生物被膜形成能力评价

将解淀粉芽孢杆菌M73和出发菌株1841分别用Landy培养基培养24小时后再置放置24小时后，观察培养基表面的生物被膜，如图6所示，M73的培养基表面有大量生物被膜形成，覆盖整个培养基表面，1841的培养基表面只有少量菌膜。

生防解淀粉芽孢杆菌的生物被膜影响其在植物表面的附着能力和抗逆性，由此可见M73的生防能力高于出发菌。

实施例6解淀粉芽孢杆菌M73的突变基因位点分析

将解淀粉芽孢杆菌M73及出发菌株分别进行全基因组测序，通过比较基因组学分析诱变菌株M73的突变基因位点，如表1所示。

从表1可见，本发明解淀粉芽孢杆菌M73是在出发菌株1841的基因组上发生6个基因突变，因而增强了抑菌能力。

实施例7解淀粉芽孢杆菌M73的代谢组学分析

将解淀粉芽孢杆菌M73及1841分别培养12、24、36小时后，提取RNA进行转录组分析，分析诱变前后差异表达基因。

结果如图7所示，解淀粉芽孢杆菌M73与出发菌株相比，差异最大的代谢通路有磷酸转移酶、ABC转运子、磷酸肌醇代谢、糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等，这些都与脂肽合成相关。表明诱变菌株的突变基因影响了上述代谢通路，因而增加了脂肽产量和改变脂肽组分。

实施例8解淀粉芽孢杆菌M73对软枣猕猴桃果腐病的防治作用

将新鲜初步成熟的软枣猕猴桃果实进行清洗干燥后备用，1-MCP准备：按照1-MCP片剂产品说明书方法，1-MCP药片用湿润滤纸包裹后，置于50x45x40 厘米密封塑料箱内反应12小时释放气体。 M73发酵液准备：M73菌液按2.5%接种Landy培养基，30℃、200rpm发酵36小时至稳定期后期。 M73、海藻酸钠涂膜剂准备：M73发酵液准备与上面一致，然后按m/V加入 1%海藻酸钠，搅拌至完全溶解的粘稠溶液。

挑选大小一致、无损伤的软枣猕猴桃随机分成4组，每组30个，对照组不作任何处理；1-MCP组（M组）：用1-MCP处理24小时；1-MCP和芽孢杆菌组（MB）：用1-MCP处理24小时后均匀喷洒M73发酵液至表面湿润，自然晾干；1-MCP和芽孢杆菌海藻酸钠涂膜组（MBS）：用1-MCP处理24小时后，置于M73、海藻酸钠成膜液中浸泡5秒，捞出晾干。所有样品置于无菌容器，25℃，80%相对湿度环境中储存。

结果如图8所示，未经处理的软枣猕猴桃在第5天已经明显***，果实失水皱缩失去商品价值，第10天表面出现霉菌生长完全失去食用价值，到第17天完成腐败。1-MCP处理组在第10天开始***，表面轻微失水，有少量霉菌生长；第17天霉菌开始大量生长，果实腐败，并且失水严重。1-MCP和M73处理组，在第10天左右开始***，到第17天也几乎没有霉菌生长，但是到第17天失水严重。1-MCP和M73及海藻酸钠涂膜组，在第17天依然保持良好外形且没有霉菌生长的痕迹，依然具有食用价值。经过3种方式复合处理可以延长软枣猕猴桃货架期1周以上。

由此可见，M73具有较好的生防应用潜力，本发明的复合配方对软枣猕猴桃保鲜具有较好作用。

上述实施例的实验结果表明：通过对出发菌株1841进行ARTP诱变，基因发生了多个突变，得到诱变菌株M73，与出发菌株相比，M73的抑菌能力明显增强，抑制灰霉菌的能力好于化学农药腐霉利，抑菌物质脂肽合成相关的一些代谢通路基因转录增强，抑菌物质合成改变，并且诱变菌株M73形成生物被膜的能力明显增强。该菌株与其它果蔬保鲜剂连用对软枣猕猴桃的保鲜起到明显的效果。

Claims (5)

1.一株用于拮抗软枣猕猴桃采后病原菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）M73，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15464。

2.一种微生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌M73。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌M73的总活菌数不低于8×10⁹个/g。

4.如权利要求2所述的微生物菌剂，制备方法包括以下步骤：

步骤一：将培养好的种子液按体积比1-3%的比例接种到发酵培养基中，28-37℃，培养48-60小时，得到发酵液；

步骤二：将步骤一的发酵液于65-90℃干燥至以重量百分比计的含水率低于5%，再加入10%的海藻酸钠得到微生物菌剂；

其中：步骤一中，所述种子液通过下述方法获得：先将解淀粉芽孢杆菌菌株M73划线转接到PDA平板中，置于培养箱28-37℃恒温培养24-48小时；再将获得的解淀粉芽孢杆菌菌株M73 的菌苔接种到PDA 液体培养基中，28-37℃摇床振荡培养24-48小时得到种子液；

其中：步骤一中，所述发酵培养基包含以下组分：L-谷氨酸钠5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，葡萄糖20g，FeSO₄ 0.15mg，氯化钾0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MnSO₄•H₂O 5.0mg，CuSO₄•5H₂0 0.16mg，蒸馏水1000ml，pH7.2，115℃下高压灭菌15min。

5.如权利要求2或3或4所述的微生物菌剂在防治软枣猕猴桃果腐病中的应用。

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