CN112457387A - 一种厚壳贻贝寡肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种厚壳贻贝寡肽及其用途，属于生物活性肽技术领域，厚壳贻贝寡肽的氨基酸序列为Leu‑Ala‑Ala‑Ser‑His或Tyr‑Glu‑Leu‑His‑Asp。本发明厚壳贻贝寡肽具有较高的ACE抑制活性，无细胞毒性，能增加血管内皮细胞(HUVEC细胞)中内源性舒张因子NO含量且降低内源性收缩因子ET‑1含量，亦即通过影响血管内皮细胞的功能来发挥其降压作用。本发明厚壳贻贝寡肽可用于制备具有调节血压作用的保健食品和/或药物。

Description

一种厚壳贻贝寡肽及其用途
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种厚壳贻贝寡肽及其用途。
背景技术
高血压病大大增加了心脏、大脑、肾脏等器官患病的风险，也大大增加了患其他疾病的风险。因为高血压患者可以多年保持无症状状态，所以世界卫生组织称高血压是一种人类健康的“隐形杀手”。据统计，全世界有11.3亿人患有高血压，其中只有不到五分之一的高血压患者的病情可以得到控制，其中在2016年因心血管疾病(CVD)死亡的人数就占全球死亡人数的31％，是全球死亡的主要原因之一。其中高血压也是导致患者患有CVD病症的主要因素之一，因此，治疗和预防高血压已成为一项艰巨而必要的任务。
血管紧张素转换酶通过将血管紧张素I转化为具有强血管收缩作用的八肽血管紧张素II，并通过血管舒张作用降解缓激肽，这一过程在调节血压方面发挥重要作用。目前，市场上用于降压的药主要有阿米洛利、呋塞米、可乐定、氯沙坦等，这些药在发挥其本身的疗效之时也会给人体带来很大的副作用，例如咳嗽、味觉障碍、氮质血症、血管性水肿和皮疹等，严重者甚至导致死亡。因此，与合成血管紧张素转换酶抑制剂相比，天然的食源性血管紧张素转换酶抑制肽更安全、副作用更少、更容易被人体吸收，因而受到广泛关注，目前认为天然来源的ACE抑制剂可作为控制血压的替代治疗剂。
发明内容
本发明的目的在于一种ACE抑制活性高的厚壳贻贝寡肽。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种厚壳贻贝寡肽，其氨基酸序列为Leu-Ala-Ala-Ser-His或Tyr-Glu-Leu-His-Asp。
本发明厚壳贻贝寡肽具有较高的ACE抑制活性，无细胞毒性，能增加血管内皮细胞(HUVEC细胞)中内源性舒张因子NO含量且降低内源性收缩因子ET-1含量，亦即通过影响血管内皮细胞的功能来发挥其降压作用。因此，本发明ACE抑制肽可以作为潜在的天然降压药品或功能性食品进行研究，同时也为厚壳贻贝的商业价值的提高提供理论支持。
优选地，以寡肽序列为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰。
优选地，寡肽具有降血压作用。
优选地，1mg/mL寡肽的ACE抑制率＞85％。
本发明还公开了厚壳贻贝寡肽在制备具有调节血压作用的保健品和/或食品和/或药物中的用途。
优选地，厚壳贻贝寡肽在制备具有降血压作用的保健品和/或食品和/或药物中的用途。
优选地，ACE抑制肽在HUVEC细胞降压和调节中的用途。
本发明还公开了一种预防和/或治疗高血压的产品，含有Leu-Ala-Ala-Ser-His和/或Tyr-Glu-Leu-His-Asp作为活性成份。
本发明具有如下有益效果：本发明厚壳贻贝寡肽具有较高的ACE抑制活性，无细胞毒性，能增加血管内皮细胞(HUVEC细胞)中内源性舒张因子NO含量且降低内源性收缩因子ET-1含量，亦即通过影响血管内皮细胞的功能来发挥其降压作用。因此，本发明ACE抑制肽可以作为潜在的天然降压药品或功能性食品进行研究，同时也为厚壳贻贝的商业价值的提高提供理论支持。
附图说明
图1为本发明厚壳贻贝寡肽的ACE抑制活性；
图2为本发明厚壳贻贝寡肽对HUVEC细胞中NO水平的影响；
图3为本发明厚壳贻贝寡肽对HUVEC细胞中ET-1水平的影响。
具体实施方式
本发明允许各种修改及变形，其特定实施例进行了举例，下面进行详细说明。但并非要把本发明限定于公开的特别形态之意，相反，本发明包括与由权利要求项所定义的本发明思想一致的所有修改、均等及替代。
这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并非限定于这些实施例，这是所属技术领域的技术人员不言而喻的。
本公开实施例提供一种厚壳贻贝寡肽的制备流程为：
厚壳贻贝肉室温解冻清洗→剪碎→加入乙酸乙酯脱脂→风干→粉碎→特定蛋白酶酶解→高温灭活，冷却至室温→高速离心除沉淀→分离、纯化、测序。
本公开实施例还提供一种厚壳贻贝寡肽的制备方法，包括：
1)将冷冻的厚壳贻贝肉室温流水解冻，清洗干净，低温烘干表面水分，解剖绞碎，加乙酸乙酯浸泡24-72h，脱脂过程中不断搅拌，脱脂后的样品经真空抽滤去除乙酸乙酯(旋蒸回收)后，烘干，粉碎得厚壳贻贝粉；
2)按料液比1:20-60将厚壳贻贝粉中加水，再加入1-5％胰蛋白酶，在pH 7-9、30-50℃条件下酶解3.0-5.0h，反应结束后，灭酶，得酶解液；
3)选用截留分子量为1kDa的超滤膜对步骤2)所得厚壳贻贝酶解液进行超滤，得到<1kDa酶解物，冷冻干燥得；
4)将步骤3)所得<1kDa酶解物配置成40-60mg/mL的溶液，离心，取上清液过0.45μm微滤膜，以充分除去不溶性杂质；取3mL样品并通过恒流泵恒流上样至QFF离子交换层析柱中，依次按照Tris-HCl缓冲液、Tris-HCl(含0.05M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.1M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.25M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.5M NaCl)缓冲液逐级洗脱，并在214nm紫外波长下收集出峰组分，按峰合并收集液，比较各峰的抗氧化活性，选择活性较高组分冻干，备用；
5)将步骤4)所得组分溶液3mL加入到Sephadex G-25凝胶过滤层析色谱柱中，以超纯水为流动相，流速为0.4-0.6mL/min，每10min收集一管，并于214nm吸收波长处检测，按峰合并收集液，比较各峰的抗氧化活性，选择活性较高组分冻干，备用；
6)将步骤5)所得组分溶于超纯水并过0.22μm微孔滤膜后，吸取3μL加载到Zorbax300SB-C18柱(4.6×250mm)上进行分离，洗脱液包含两种，一种A液0.06％TFA的水，一种B液含有0.05％TFA的乙腈，使用梯度洗脱：0-4min，1％B；4-16min，1％-9％B；16-24min，9％-50％B；24-24.5min，50％-100％B；24.5-30.5min，100％B，在280nm处测吸光度值，并分别收集各组份冻干，经测定存在氨基酸序列为Leu-Ala-Ala-Ser-His的组分，分子量为497.55Da；存在氨基酸序列为Tyr-Glu-Leu-His-Asp的组分，其分子量为675.70Da。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种厚壳贻贝寡肽的制备方法，包括：
1)将冷冻的厚壳贻贝肉室温流水解冻，清洗干净，低温烘干表面水分，解剖绞碎，加乙酸乙酯浸泡48h，脱脂过程中不断搅拌，脱脂后的样品经真空抽滤去除乙酸乙酯(旋蒸回收)后，烘干，粉碎得厚壳贻贝粉；
2)按料液比1:40将厚壳贻贝粉中加水，再加入3％胰蛋白酶，在pH 8、40℃条件下酶解4.0h，反应结束后，置于100℃的沸水中加热灭酶10min，得酶解液；
3)选用截留分子量为1kDa的超滤膜对步骤2)所得厚壳贻贝酶解液进行超滤，得到<1kDa酶解物，冷冻干燥得；
4)将QFF通过玻璃棒引流缓缓倒入层析柱中(柱体积约200mL)。等上层沉降完成后，用双蒸水清洗层析柱，清洗3～5个柱体积，充分洗去残留的乙醇。再用Tris-HCl缓冲溶液(0.05M，pH 8.0)平衡至pH恒定。将步骤3)所得<1kDa酶解物配置成50mg/mL的溶液，离心，取上清液过0.45μm微滤膜，以充分除去不溶性杂质；取3mL样品并通过恒流泵恒流上样至QFF离子交换层析柱中，依次按照Tris-HCl缓冲液、Tris-HCl(含0.05M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.1M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.25M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.5M NaCl)缓冲液逐级洗脱，并在214nm紫外波长下收集出峰组分，按峰合并收集液，比较各峰的抗氧化活性，选择活性较高组分冻干，备用；
5)葡聚糖凝胶Sephadex G-25经适量超纯水浸泡过夜，使凝胶充分溶胀，并弃去上层漂浮的颗粒，用抽滤装置对其进行脱气泡处理。将层析柱(直径×柱长：2cm×120cm)垂直固定于铁架台上，检漏后加入适量双蒸水，将Sephadex G-25沿玻璃棒连续缓慢的加入到色谱柱中，让其自然沉降，之后以2倍柱体积量的超纯水平衡色谱柱。开启恒流泵过夜，用流水压实胶柱体。色谱柱平衡后，将步骤4)所得组分溶液3mL加入到Sephadex G-25凝胶过滤层析色谱柱中，以超纯水为流动相，流速为0.5mL/min，每10min收集一管，并于214nm吸收波长处检测，按峰合并收集液，比较各峰的抗氧化活性，选择活性较高组分冻干，备用；
6)将步骤5)所得组分溶于超纯水并过0.22μm微孔滤膜后，吸取3μL加载到Zorbax300SB-C18柱(4.6×250mm)上进行分离，洗脱液包含两种，一种A液0.06％TFA的水，一种B液含有0.05％TFA的乙腈，使用梯度洗脱：0-4min，1％B；4-16min，1％-9％B；16-24min，9％-50％B；24-24.5min，50％-100％B；24.5-30.5min，100％B，在280nm处测吸光度值，并分别收集各组份冻干得H1-H8组份；
7)将H1-H8共8条多肽的氨基酸序列和分子量，用Applied Biosystems 494Protein Sequencer(Perkin Elmer，USA)测定8条肽N-末端氨基酸序列，根据AppliedBiosystems提供的标准程序进行Edman降解。
通过Q-TOF质谱仪(Micromass，Waters，USA)与电喷雾电离(ESI)源结合准确测定8种肽的分子量。电离是在毛细管电压为3500V的正模式下进行的。氮气在雾化过程中保持在40psi，在蒸发过程中保持9L/min在350℃时。以质心模式从M/Z100到2000收集数据，如表1。
表1厚壳贻贝多肽H1-H8的出峰时间、氨基酸序列和分子量
Figure BDA0002814014130000041
Figure BDA0002814014130000051
实施例2：
厚壳贻贝寡肽的ACE抑制活性测试
主要试剂：盐酸(分析纯)、氯化钠(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司；N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)，购自Solarbio公司；血管紧张素转换酶(ACE)、FAPGG(N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly)，购自美国Sigma公司。
试剂的配制：80mM HEPES缓冲液(pH 8.3，Cl－浓度为300mM)：HEPES 1.910g，NaCl1.755g，双蒸水溶解后，NaOH调节pH至8.3再补充水至100mL，置4℃备用；FAPGG溶液(1mM)：取3.994mg FAPGG粉末加HEPES缓冲液，混合溶解，定容至10mL，置4℃避光保存；ACE抑制剂(待测肽)：称取适量的活性肽粉末，用HEPES缓冲液为溶剂配制成一系列浓度的活性肽溶液；ACE溶液(0.1U/mL)：将0.25U ACE溶于2.5mL的HEPES缓冲液中，即可得到0.1U/mLACE溶液，置-20℃保存备用。
ACE抑制活性的测定：在96孔板上按表2设计添加反应物，在340nm处分别测定空白孔和样品孔的初始吸光度(A1，B1)，在37℃的恒温培养条件下反应30min，再测定其吸光度(A2，B2)。ACE抑制活性计算公式如下：
Figure BDA0002814014130000052
其中：Bi(B1-B2)为样品孔吸光值在30min的变化：Ai(A1-A2)为空白孔吸光值在30min的变化。
表2 ACE抑制活性测定
Figure BDA0002814014130000053
数据处理：实验结果用平均值±标准偏差表示(n＝3)，并使用Origin和SPSS 22.0软件进行作图和数据分析。
厚壳贻贝寡肽的ACE抑制活性如图1，图中CP为卡托普利，CSY为到Sephadex G-25凝胶过滤层析得活性较高组分，CSY-1为Leu-Ala-Ala-Ser-His，CSY-2为Tyr-Glu-Leu-His-Asp，CSY-3为Gln-Glu-Thr-Tyr。可以看出，本发明厚壳贻贝寡肽Tyr-Glu-Leu-His-Asp具有较好的ACE抑制活性，同时寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Gln-Glu-Thr-Tyr也具有ACE抑制活性。
实施例3：
厚壳贻贝寡肽对HUVEC细胞中NO水平和ET-1水平的影响
材料：人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelialm Cell，HUVEC)购于中国科学院上海细胞库。
主要试剂：DMEM培养基、特级胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素液、胰酶-EDTA、PBS、四甲基偶氮(MTT)、卡托普利(Cap)、去甲肾上腺素(NE)，购自北京索莱宝科技有限公司；二甲亚砜(DMSO)、无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；NO试剂盒、内皮素-1(ET-1)试剂盒，购自南京建成生物工程。
UVEC细胞的培养：HUVEC细胞使用DMEM+10％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青霉素-链霉素)培养液进行培养。培养流程如下：复苏后的细胞置于含5％CO2培养箱中，37℃培养，12h后换液，等到细胞生长至能覆盖瓶底80％-90％时，用胰酶进行消化并传代。取对数生长期的HUVEC细胞作为实验材料。
HUVEC细胞毒性试验(MTT法)：将对数生长期的HUVEC，接种于若干96孔培养板。每孔180μL，细胞数0.9×104个/孔，置于37℃、5％CO2的恒温箱中孵育24h。样品组加入20μL寡肽其终浓度分别为100、200、300、400和500μM，空白组加入20μL PBS，孵育24h后，再加入20μL MTT孵育4h后弃去培养液，再加入150μL DMSO在37℃下孵育10min后，用酶标仪在570nm测量吸光度值，计算细胞存活率。
细胞存活率计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组/对照组)×100
实验分组及处理：将对数生长期的HUVEC，接种于若干6孔培养板。每孔1.8mL，细胞数3.5×105个/孔，置于37℃、5％CO2的恒温箱中孵育24h。随机分组如下：
(1)空白对照(Control)组：不加任何试剂处理细胞；
(2)卡托普利(Cp)组：加入卡托普利终浓度为1μM；
(3)去甲肾上腺素(NE)组：加入去甲肾上腺素终浓度为0.5μM；
(4)CSY-1组：分别加入寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His终浓度为50μM、100μM、200μM；
(5)CSY-2组：分别加入寡肽Tyr-Glu-Leu-His-Asp终浓度为50μM、100μM、200μM。
HUVEC细胞内NO含量测定：采用硝酸还原酶试剂盒。其测定原理：NO化学性质活泼，在体内代谢转化为硝酸盐(NO3 -)和亚硝酸盐(NO2 -)，而亚硝酸盐(NO2 -)又进一步转化为硝酸盐(NO3 -)，本法利用硝酸还原酶特异性将硝酸盐(NO3 -)还原为硝酸盐(NO2 -)，通过在550nm测定其吸光值，计算NO含量。作用24h后，弃去培养液，用PBS洗三次，再使用细胞刮分别将每组细胞刮下收集到EP管中，在冰水浴中用细胞破碎仪将细胞破碎，加入300μL PBS，然后按NO试剂盒上的步骤进行操作。
HUVEC细胞内ET-1含量测定：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。其原理：往预先包被内皮素1(ET-1)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化氢酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅与样品中的内皮素1(ET-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长处测其吸光值，计算样品浓度。ET-1含量测定的具体步骤按试剂盒说明书进行操作。
与空白组相比，在100-400μM浓度范围内，CSY-1组和CSY-2组的细胞存活率均在90％以上。
厚壳贻贝寡肽对HUVEC细胞中NO水平的影响如图2所示，与空白对照组相比，卡托普利(Cp)组NO含量显著上升。此外，CSY-1组和CSY-2组中寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp分别以50、100、200μM的浓度作用于细胞，结果显示NO含量呈现剂量依赖性，说明寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp能抑制细胞中NO的生成。
厚壳贻贝寡肽对HUVEC细胞中ET-1水平的影响如图3所示，与空白对照组相比，卡托普利(Cp)组ET-1含量显著下降。此外，CSY-1组和CSY-2组中寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp分别以50、100、200μM的浓度作用于细胞，ET-1含量呈现剂量依赖性。同时，去甲肾上腺素(NE)抑制细胞中ET-1的释放，且加入ACE抑制肽后，ET-1含量显著下降，说明寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp能抑制细胞中ET-1的生成。
通过寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp对NO和ET-1两种因子的复合作用结果表明，寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp无明显毒性，并能促进HUVEC细胞中内源性舒张因子一氧化氮(NO)的释放和抑制内源性收缩因子内皮素(ET-1)的生成，表明这寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp对HUVEC细胞具有一定的降压和调节功能。因此，在体内环境下，寡肽Leu-Ala-Ala-Ser-His和Tyr-Glu-Leu-His-Asp可以通过影响血管内皮细胞的功能来发挥其降压作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种厚壳贻贝寡肽，其氨基酸序列为Leu-Ala-Ala-Ser-His或Tyr-Glu-Leu-His-Asp。
2.根据权利要求1所述的一种厚壳贻贝寡肽，其特征在于：以所述寡肽序列为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰。
3.根据权利要求1所述的一种厚壳贻贝寡肽，其特征在于：所述寡肽具有降血压作用。
4.根据权利要求1所述的一种厚壳贻贝寡肽，其特征在于：1mg/mL所述寡肽的ACE抑制率＞85％。
5.权利要求1所述的厚壳贻贝寡肽在制备具有调节血压作用的保健品和/或食品和/或药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述厚壳贻贝寡肽在制备具有降血压作用的保健品和/或食品和/或药物中的用途。
7.一种预防和/或治疗高血压的产品，含有Leu-Ala-Ala-Ser-His和/或Tyr-Glu-Leu-His-Asp作为活性成份。
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