CN112430673B

CN112430673B - 一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的snp位点基因型的试剂

Info

Publication number: CN112430673B
Application number: CN202011520753.7A
Authority: CN
Inventors: 王庆; 秦启伟; 杨敏; 陈锦鹏; 黄健玲; 李鑫帅; 郑乐云
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112430673A

Abstract

本发明公开了一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂，所述。本发明公开了一个与神经坏死病毒抗性相关的SNP位点，该SNP位点基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于基因型为CC或者TT的个体。检测赤点石斑鱼该SNP的基因型，能够有效地确定其是否具有神经坏死病毒抗感性状。本发明的SNP标记与赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性密切相关，在亲本选育中选择具有CT基因型的个体将有利于提高后代抗神经坏死病症的能力，利用本发明标记进行辅助育种，可以加快赤点石斑鱼抗病优良品种的培养进程。

Description

一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂

技术领域

本发明涉及分子生物学与遗传育种技术领域，具体地，涉及一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂。

背景技术

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)俗称红斑，鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑鱼属(Epinephelus)，主要分布于北太平洋西部，我国产于舟山群岛以南经台湾海峡至南海、北部湾一带海域。其具有肉质鲜美，营养价值高的特点，是华南沿海地区重要的石斑鱼养殖品种。

赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)，对石斑鱼的成鱼以及幼鱼危害很大，严重时死亡率可达100％，往往给石斑鱼养殖造成巨大的经济损失，严重威胁到石斑鱼养殖产业的健康发展，然而目前针对该病毒引起的疾病仍无有效的治疗手段，主要以防控监测为主。

中国专利CN201610255794.5公开了一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法；CN201610465941.1公开了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用；CN201910873715.0公开了一种检测石斑鱼神经坏死病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法；CN200910039534.4公开了一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒；CN03114369.5公开了石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法，但是缺乏一种检测石斑鱼神经坏死病毒抗性的方法。

PPAR-δ(Peroxisome proliferator-activated receptor delta)是过氧化物酶体增殖物激活受体家族PPARs(Peroxisome proliferator-activated receptors)的成员之一，这是一类转录因子，其可以通过结合在靶基因上游启动子区域的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)上抑制或激活靶基因的表达，以调控机体的各种生物进程，如脂代谢，细胞存活，癌细胞入侵，血管生成，致癌信号通路，免疫反应等。近年来，PPARs在免疫反应中的调控作用越来越受到研究者们的重视。

近年来，随着细胞生物学、分子生物学等现代生物技术的发展，DNA分子标记技术也逐渐应用到抗病新品种的选育研究工作中，并展现出巨大的应用潜力，抗病分子标记的开发和应用，能够大大提高育种的有效性和可预见性。其中SNP标记为二等位基因变异，相较于其他分子标记来说检测更为自动化，统计也更加方便，是最理想的遗传标记。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂。

本发明的第一个目的是提供一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂。

本发明的第二个目的是提供所述的试剂在制备石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒。

本发明的第四个目的是提供所述试剂或所述的斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒在石斑鱼分子育种中的应用，其特征在于，选育具有斑鱼神经坏死病毒抗性的石斑鱼。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明公开了一个与神经坏死病毒抗性相关的SNP位点，该SNP位点位于SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的5’端第520个碱基，其基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于基因型为CC或者TT的个体。

因此办发明要求保护一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂，所述试剂用于检测SNP位点的基因型，所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的5’端第520个碱基，所述SNP位点基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于基因型为CC或者TT的个体。

优选地，所示石斑鱼为赤点石斑鱼。

优选地，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物。

SEQ ID NO.2：5’-gtgggaggaatgctgatgtg-3’；

SEQ ID NO.3：5-attcttcttcaccgtggaggc-3’。

本发明还要求保护所述的试剂在制备石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用。

本发明进一步要求保护一种石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒，含有所述试剂。

优选地，所述试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物。

试剂盒的使用方法为：

(1)提取待测赤点石斑鱼的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获取的DNA作为模板，以SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，确定待测赤点石斑鱼的SNP标记的基因型；

(4)根据步骤(3)确定的SNP标记的基因型确定待测赤点石斑鱼是否对神经坏死病毒抗感：

即SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(全长584bp)自5’端起第520位碱基C或T与赤点石斑鱼神经坏死病毒抗性性状显著相关，样本赤点石斑鱼该SNP标记的基因型为CT，样本对神经坏死病毒更抗感，即该SNP位点的基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后死亡概率要显著低于其他基因型个体。

本发明提供的所述斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒的使用方法中，基因组提取不受特别限制，可以采用传统酚氯仿法提取，也可以采用试剂盒提取，本发明中的具体实施例是采用试剂盒提取，试剂盒操作简便、快速、提取的DNA质量高。

本发明赤点石斑鱼个体基因型检测方法不受特别限制，SnapShot、飞行时间质谱、测序、芯片、单链构象多态性聚合酶链式反应、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应等技术均可用于SNP的检测。其中，SnapShot法检测SNP位点准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短，因此，本发明实施例采用SnapShot法检测SNP标记。

本发明进一步还要求保护、所述试剂或、所述的斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒在石斑鱼分子育种中的应用，选育具有斑鱼神经坏死病毒抗性的石斑鱼。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一个与神经坏死病毒抗性相关的SNP位点，该SNP位点基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于基因型为CC或者TT的个体。检测赤点石斑鱼该SNP的基因型，能够有效地确定其是否具有神经坏死病毒抗感性状。

本发明的SNP标记与赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性密切相关，在亲本选育中选择具有CT基因型的个体将有利于提高后代抗神经坏死病症的能力，利用本发明标记进行辅助育种，可以加快赤点石斑鱼抗病优良品种的培养进程。

本发明还提供一对用于检测该SNP位点的引物，利用该SNP位点的引物对可以有效的检测待测赤点石斑鱼的基因型，其结果一方面可以判断待测赤点石斑鱼是否对神经坏死病毒具有抗感性，另一方面可以为亲本选择提供参考。因此，利用本发明的SNP位点引物可以检测赤点石斑鱼基因型，判断该个体是否对神经坏死病毒具有抗感性，能够有效用于赤点石斑鱼分子标记辅助选择育种，加快赤点石斑鱼抗病优良品种的培育进程。

本发明还提供了一种用于检测所述SNP标记的试剂盒，该试剂盒可以有效检测赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性状，用于赤点石斑鱼分子标记辅助育种。

附图说明

图1为利用SNP位点引物进行PCR扩增的电泳检测图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1赤点石斑鱼PPAR-δ基因的SNPs的筛选

1、实验方法

(1)赤点石斑鱼样本来源

待测样本赤点石斑鱼取自于厦门小嶝岛石斑鱼养殖场同一批次人工繁殖的2月龄的赤点石斑鱼，随机挑选体重在50g/尾左右的健康鱼苗300尾。

采用腹腔注射法向赤点石斑鱼注射半致死浓度(1×10⁷TCID₅₀/mL)的神经坏死病毒培养液，3天内死亡个体和有典型发病症状个体为易感个体，10天后仍存活并且无明显发病症状的个体为抗感个体。

随机选取50尾抗感个体(抗感组)和50尾易感个体(易感组)，剪取其鳍条，保存于无水乙醇中，用于基因组DNA提取。

(2)石斑鱼样本基因组DNA提取

基因组DNA提取使用TreliefTMAnimal Genomic DNA Kit(TsingKe)试剂盒，按照说明书操作如下：

1)准备组织样品：取适量石斑鱼鳍条组织于1.5mL离心管中，用灭过菌的剪刀将鳍条剪碎；

2)活化硅胶膜：将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μL Buffer BL，12,000g离心1min；

3)样品消化：取20μL Proteinase K至新的1.5mL离心管中，加入200μL ddH₂O稀释后的组织碎片，漩涡震荡10s，再加入200μL Buffer gA1，漩涡震荡10s，56℃孵育1～3h或过夜，期间震荡3～5次；

4)孵育结束后，加入200μL无水乙醇，漩涡震荡混匀；

5)将步骤4)所得溶液全部转入Spin Column中，12,000g离心1min，弃滤液；

6)加入500μL Buffer PW，12,000g离心30s，弃滤液；

7)重复步骤6)一次；

8)加入500μL Wash Buffer，12,000g离心30s，弃滤液；

9)12,000g空甩2min，弃滤液，将Spin Column放入新的1.5mL离心管中，开盖晾1min；

10)往吸附膜中央处加50～100μL事先预热到65℃的TE Buffer，室温放置2min，12,000g离心2min；

11)将得到的溶液重新加入Spin Column中，12,000g离心2min；

12)取2μL DNA进行电泳检测，1μL用于测定DNA浓度，-20℃保存。

(3)赤点石斑鱼PPAR-δ基因的DNA序列的获得

以上一步提取的赤点石斑鱼鳍条DNA为模板，根据斜带石斑鱼基因组数据库中的PPAR-δ基因DNA序列为参考，利用Primer 5.0软件设计引物，通过PCR扩增，产物测序，序列拼接和比对，最终获得赤点石斑鱼PPAR-δ基因的基因组DNA序列。

(4)赤点石斑鱼PPAR-δ基因的SNPs的筛选

赤点石斑鱼PPAR-δ基因的SNPs位点的筛查利用直接测序法进行。根据已经获得的PPAR-δ基因组DNA序列设计引物，以抗感组和易感组各5个样本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物送至TsingKe公司测序，观察测序结果的峰图，并对测序结果进行多重比对分析，预测存在的SNPs及其对应的基因型。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃4min；94℃10s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。

2、实验结果

初步筛选得到8个候选的SNP位点。

实施例2赤点石斑鱼PPAR-δ基因的SNPs的确认

1、实验方法

依据实施例1得到的8个候选的PPAR-δ基因SNP位点及其附近的序列，随机选取的50个易感样品和50个抗感样品为模板，采用SnapShot法对实施例1得到的SNPs进行基因分型，并对分型结果与神经坏死病毒抗性进行关联分析。

SnapShot法检测由TsingKe公司完成，其扩增引物信息和单碱基延伸引物信息分别如表1和表2所示。抗神经坏死病毒相关性分析使用SPSS 17.0统计学软件中的卡方检验进行8个SNPs的基因分型及与神经坏死病毒抗性的关联分析(P<0.05表示差异显著)。

表1：SnapShot法检测SNP位点***引物信息

表2：SnapShot法检测SNP位点单碱基延伸引物信息

2、实验结果

等位基因及基因型在两组间的差异分析结果见表3。经过SPSS软件的关联分析，获得了1个与神经坏死病毒抗性相关的SNP位点(SNP5)，该SNP5位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(全长584bp)自5’端起第520bp处。

表3：石斑鱼PPAR-δ基因在抗感组和易感组的SNPs统计分析

由表1可知，在该位点处，在抗病群体中基因型CC、CT、TT频率分别37.5％、60.4％和2.1％，在易感群体中，基因型CC、CT、TT的频率为57.1％，38.8％和2.1％，统计分析结果表明该位点等位基因型频率在抗感和易感群体中存在显著差异(P<0.05)。进而证明SEQ IDNO.1所示核苷酸序列(全长584bp)自5’端起第520位碱基C或T与赤点石斑鱼神经坏死病毒抗性性状显著相关，为赤点石斑鱼疾病关联SNP标记，本发明的SNP标记可用于赤点石斑鱼抗病性状选育。

实施例3一种检测赤点石斑鱼对神经坏死病毒抗病性状的方法

通过对待测赤点石斑鱼进行SNP标记的检测，确定所述待测赤点石斑鱼对神经坏死病毒的抗感性。包括以下步骤：

(1)提取待测赤点石斑鱼的基因组DNA；

(2)以步骤(1)获取的DNA作为模板，以SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，

SEQ ID NO.2：5’-gtgggaggaatgctgatgtg-3’。

SEQ ID NO.3：5’-attcttcttcaccgtggaggc-3’。；

实施例4一种检测赤点石斑鱼对神经坏死病毒抗病性状的试剂盒

一、组成

核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物、PCR扩增试剂；

其中，SEQ ID NO.2：5’-gtgggaggaatgctgatgtg-3’；

SEQ ID NO.3：5’-attcttcttcaccgtggaggc-3’。

二、使用方法

同实施例3。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的试剂

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> Epinephelus akaara

<400> 1

gtgggaggaa tgctgatgtg aaactgcagc gaggcgagtg atgagtcaac ctgtcttttt 60

catcagataa taatgagata aagtcacatg tacataagtt ttactcaaat ggcaaaatga 120

ttggtttttg gctgcagaat actgaataaa atgttcaaaa taatctgatg accgaagact 180

taaatgtcaa cagagtaaaa ctaaactaaa aatagttttc tttaatgcag ataaaactaa 240

aatgtcagac tttgagtcaa ccaaaacgtg actaaaaaaa caggatgacg ttgactgtat 300

atgataaaaa cttacaagga catttgaaac aagactaaga caaaataaaa tgtagctgac 360

aaaaataaca tgtgctgctt cggtataatt tattgttctg tgtgctgtgc acattttggc 420

ttttattcta atttacattt tataaaatta ttttactcca aaggaaatct gtctttgata 480

agaataattg acctgccatt ttgtgtatca gttacccact gcgtgttacc ttgaattcat 540

gaagaaaacg ttttttctct catgcctcca cggtgaagaa gaat 584

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgggaggaa tgctgatgtg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attcttcttc accgtggagg c 21

Claims

1.检测与石斑鱼神经坏死病毒抗性相关的SNP位点基因型的引物在制备赤点石斑鱼神经坏死病毒抗性检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物用于检测SNP位点的基因型，所述SNP位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的5’端第520个碱基，所述SNP位点基因型为CT的赤点石斑鱼感染神经坏死病毒后的死亡概率要显著低于基因型为CC或者TT的个体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物。

3.权利要求1中所述的引物在石斑鱼分子育种中的应用，其特征在于，选育具有石斑鱼神经坏死病毒抗性的赤点石斑鱼。