CN112424231A - 抗pd-1抗体及其剂量和用途 - Google Patents

抗pd-1抗体及其剂量和用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供了抗PD‑1抗体或其片段。还提供了使用该抗体或其片段治疗和诊断诸如癌症、感染或免疫紊乱的疾病的方法。

Description

抗PD-1抗体及其剂量和用途
相关申请
本申请要求2018年7月19日提交的PCT申请PCT/CN2018/096206的优先权及其权益。该申请的内容通过整体引用而并入本文。
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发明背景
细胞程序性死亡1(PD-1)的cDNA于1992年从经历凋亡的鼠T细胞杂交瘤和造血祖细胞系中分离出来。基因切除研究表明，PD-1的缺陷导致了各种小鼠品系中不同的自身免疫表型。带有转基因T细胞受体(TCR)的PD-1缺陷同种异体T细胞，表现出对同种异型抗原的增强响应，这表明T细胞上的PD-1在响应抗原时起着负调控作用。
一些研究促进了与PD-1相互作用的分子的发现。在1999年，使用分子克隆和基于其于B7家族分子的同源性的人表达序列标签数据库检索，独立地从PD-1中确定了B7同系物1(B7-H1，也称为程序性死亡配体1[PD-L1])，并表明B7-H1在体外是人T细胞响应的抑制剂。当Freeman、Wood和Honjo的实验室表明B7-H1(以下称为PD-L1)是PD-1的结合和功能***时，这两项独立的研究在一年后合并了。接下来确定了PD-L1缺陷型小鼠(PD-L1 KO小鼠)很容易诱发自体免疫疾病，尽管该小鼠品系并不是自发产生该疾病。后来变得很清楚，PD-L1/PD-1的相互作用在体内T细胞响应的抑制中起着重要作用，尤其是在肿瘤微环境中。
即时的初步研究表明，肿瘤相关的PD-L1促进活化的T细胞的凋亡(Dong H.etal.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potentialmechanismofimmune evasion.Nature medicine.2002；8(8):793-800)，并刺激人外周血T细胞中的IL-10产生(Dong H,et al.,B7-H1,a third member ofthe B7family,co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10secretion.Naturemedicine.1999；5(12):1365-9)以介导免疫抑制。众所周知，PD-L1对免疫抑制的影响更为复杂。除T细胞凋亡和IL-10诱导外，PD-L1还可以通过多种机制诱导T细胞功能障碍。PD途径在体外和体内还显示了促进T细胞失能。
最近，FDA批准了两种PD-1mAb(PD-1单克隆抗体)用于治疗人类癌症，其中一种来自百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)公司(Opdivo,纳武单抗,MDX-1106,BMS-936558,ONO-4538)，另一种来自默克(Merck)公司(Keytruda,派姆单抗,lambrolizumab,MK-3475)。此外，在涉及数千名患者的数百项临床试验中，正在积极开发针对PD-1或PD-L1的多个单克隆抗体。因此，到目前为止，抗PD疗法通过诱导晚期和转移性肿瘤的消退并提高生存率而产生了显著的临床益处。更重要的是，抗PD疗法具有持久的作用、可耐受的毒性，并且显示适用于广泛的癌症类型，尤其是在实体瘤中。这些临床发现进一步证实了PD途径阻断的原理，并使抗PD疗法区别于与个体化或肿瘤类型特异性疗法而作为独特的类别。由于其相对于其他癌症疗法的独特性和不重叠的机制，抗PD疗法正在与几乎所有的癌症治疗方法相结合，试图进一步扩大治疗效果。除了与各种癌症免疫疗法(如癌症疫苗、共刺激和共抑制抗体，以及过继细胞疗法)相结合外，各种临床试验也已开始将抗PD疗法与化学疗法、放射疗法和靶向疗法联合。
抗PD疗法已成为针对人类癌症免疫疗法的主角，尤其是对于实体瘤。这种疗法不同于主要是为了增强全身性免疫反应或针对癌症产生从头免疫力的先前免疫治疗药物；相反，抗PD疗法可调节肿瘤部位的免疫反应，靶向肿瘤诱导的免疫缺陷，以及修复正在进行的免疫反应。虽然用于各种人类癌症治疗的抗PD疗法的临床成功已经验证了这种方法，其仍然有助于我们在癌症免疫疗法中发现和设计新的临床应用方法。
发明内容
本公开提供了抗PD-1抗体，所述抗体对PD-1蛋白具有出色的结合和抑制活性。经测试的其中之一甚至显示出比经监管机构验证的两种抗PD-1抗体产品具有更高的结合活性。
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，且其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ IDNO:6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；和(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，本公开的抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或它们的组合。在一些实施方案中，所述轻链恒定区是κ或λ链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其片段可为IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型。在某些实施方案中，所述同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中，所述抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID：39的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:35、SEQ ID ID NO：37或SEQ ID NO:39具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:41、SEQ ID ID NO：43或SEQ ID NO:45具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开提供了对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，且其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ IDNO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO:18)；和(d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)所示，但其中至少一个包含一个、两个或三个氨基酸添加、缺失、保守氨基酸替换或它们的组合。
在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中一个包含保守氨基酸替换。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中两个每个都包括保守氨基酸替换。在一些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中三个每个都包括保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的抗体或其片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码本文所述的抗体或其片段的重链的核苷酸序列。例如，所述重链可以包含选自SEQ IDNo:19、23、27、31、35、37和39或其变体的氨基酸序列。例如，所述核苷酸序列可以包含选自SEQ ID No:20、24、28、32、36、38和40或其变体的核苷酸序列。
或者，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码本文所述的抗体或其片段的轻链的核苷酸序列。例如，所述轻链可以包含选自SEQ ID No:21、25、29、33、41、43和45或其变体的核苷酸序列。例如，所述核苷酸序列可以包含选自SEQ ID No:22、26、30、34、42、44和46或其变体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码选自SEQ ID No:1-18的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一个实施方案中，还提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本文所述的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列。在某些实施方案中，所述一个或多个控制序列在适当的宿主中指导本文所述的抗体或其片段的生产。在一些实施方案中，所述一个或多个控制序列选自下组：启动子、增强子、停止信号、信号肽、前导序列、转录终止子和其任意组合。例如，所述一个或多个控制序列可为启动子。
在一个实施方案中，还提供了一种包含本文所述的核酸构建体的载体。在一些实施方案中，所述载体是一种表达载体。在一些实施方案中，所述载体选自下组：质粒、粘粒、病毒、微型染色体和人工染色体。
在一个实施方案中还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的核酸构建体或本文所述的载体。在某些实施方案中，所述核酸构建体或载体被整合到宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，所述核酸构建体或载体是作为染色体外实体存在的。所述宿主细胞可为原核细胞。所述宿主细胞可为真核宿主细胞。例如，所述宿主细胞可为哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞可为人类细胞。
在一个实施方案中，还提供了一种发酵培养基，所述发酵培养基包含：本文所述的抗体或其片段，本文所述的多核苷酸，本文所述的核酸构建体，本文所述的载体，或本文所述的宿主细胞。
在一个实施方案中，还提供了一种组合物，所述组合物包含本公开的抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，还提供的是一种分离的细胞，所述分离的细胞包含一个或多个编码所述抗体或其片段的多核苷酸。
还提供了用途和方法。在一个实施方案中，提供了本公开的抗体或其片段在制备用于癌症治疗的药物中的用途。所述癌症可以选自下组：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、***癌、甲状腺癌。还提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向患者施用本公开的抗体或其片段。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种治疗有需要的患者的癌症或感染的方法，其包括：(a)用本公开的抗体或其片段在体外处理细胞；以及(b)向患者施用所述经处理的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在另一个实施方案中，提供了本公开的抗体或其片段在制备用于治疗感染的药物中的用途。在某些实施方案中，所述感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。
在另一个实施方案中，还提供了本公开的抗体或其片段在制备用于治疗免疫紊乱的药物中的用途。在一些实施方案中，所述免疫紊乱选自下组：感染、与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、***性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和周围神经***炎性病症、多发性硬化、狼疮和格林-巴利综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、胰腺炎、创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、缺血性疾病、心肌梗塞、动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和缺乏母胎耐受相关的***症。
在某些方面，提供了在有需要的对患者中治疗癌症、感染或免疫紊乱的方法，其包括向患者施用一个或多个剂量对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中每次给药为约1mg/kg至约10mg/kg。在某些实施方案中，每次给药为约1mg/kg，约3mg/kg，或约10mg/kg。在某些实施方案中，每次给药为3mg/kg。
在根据本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ IDNO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；和(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ IDNO:18)。在本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体或其片段还具有重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或它们的组合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在某些实施方案中，所述同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中，所述抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在某些实施方案中，所述抗体或其片段是人源化抗体。
在本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID：39的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:35、SEQ ID ID NO：37或SEQ ID NO:39具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体或其片段包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:41、SEQ ID ID NO：43或SEQ ID NO:45具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。
在根据本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ IDNO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ IDNO:18)；和(d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)所示，但其中至少一个包括：一个、两个或三个氨基酸添加、缺失、保守氨基酸替换或它们的组合。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中一个包括保守氨基酸替换。在一些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中两个包括保守氨基酸替换。在一些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中三个包括保守氨基酸替换。
在根据本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症，且所述癌症选自下组：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、***癌、甲状腺癌。
在根据本文所述的任何一种方法的一些实施方案中，所述方法用于治疗感染，其中所述感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。在某些实施方案中，所述感染是肝炎。在某些实施方案中，所述感染选自下组：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。
在一些实施方案中，根据的方法中的任一个在此描述中，该方法可用于治疗免疫紊乱，且所述免疫紊乱选自下组：感染、与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、***性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和周围神经***炎性病症、多发性硬化、狼疮和格林-巴利综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、胰腺炎、创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、缺血性疾病、心肌梗塞、动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和缺乏母胎耐受相关的***症。
附图说明
图1显示了所有5种hPD-1(人PD-1)mAb(单克隆抗体)同种型都可以与hPD-1高特异性结合。
图2显示了抗-hPD-1未与hB7-1、hPD-L1、hB7-H3、hB7-H4和hCD137结合。
图3显示了hPD-1mAb可以与人和食蟹猴(cynomolgus monkey)细胞PD-1蛋白结合，而不会与mPD-1表现出交叉结合。
图4显示了hPD-1mAb剂量依赖性地对hPD-1与hPD-L1的结合具有阻断作用。
图5A和图5B显示了在竞争性结合环境中观察到的hPD-1mAb的抑制和阻断作用。
图6显示了确认RACE产物的凝胶电泳分析结果。
图7显示了重组DNA抗体结合PD-1(A)的能力，以及它们对PD-1与PD-L1(B)结合能力的阻断作用。
图8显示了9种人源化抗体对PD-1表现出不同的结合亲和力，包括高于和低于亲本抗体的亲和力。
图9显示了人源化抗体可以对PD-1与PD-L1的结合能力产生阻断作用。
图10A和图10B显示了人源化抗体可以对PD-1与PD-L2的结合能力具有阻断作用。
图11显示了人源化的单克隆抗体增强了同种异体CD8+CTL细胞对癌细胞的体外细胞毒性。
图12显示了混合淋巴细胞反应(MLR)对抗hPD-1抗体的增殖响应。
图13显示了在MLR培养物上清液中IL-2和IFNγ的表达情况。
图14A和图14B显示了PD-1mAb抑制了PD-L1在淋巴细胞上的表达。
图15显示了人源化PD-1抗体的体内抗肿瘤活性。
图16显示了抗体结合亲和力和动力学的比较。
图17显示了PD-1/PD-L1阻断中PD-1抗体的比较。
图18显示了单克隆抗体与同种异体CD8+CTL细胞对癌细胞的体外增强细胞毒性的比较。
图19显示了测试样品与hPD-1或mPD-1的结合(ELISA法)。
图20显示了使用流式细胞术测定的测试样品与表达hPD-1或cPD-1的CHOK1细胞的结合。
图21显示了测试样品对hPD-L1(左)和hPD-L2(右)与表达hPD-1的CHOK1细胞结合的阻断活性。
图22显示了人类MLR测定中的IL-2(左)和IFN-γ(右)水平。
图23显示了在工程化的肿瘤和T细胞共培养测定中的IFN-γ水平。
图24显示了来自ELISA结果的表位结合(上图)，以及不同测试样品的表位重叠的示意图(下图)。
图25显示了在低固定化水平(60RU，左图)和高固定化水平(960RU，右图)下纳武单抗(Nivolumab)(上图)或TY101-04-T3-05(下图)抗体与重组hPD-1的结合。
具体实施方式
定义
应注意到，术语“一个/种(a/an)”实体是指一或多个/种所述实体；例如，可以理解为“抗体”代表一或多个/种抗体。因此，术语“一个/种(a/an)”、“一或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。
如本文所用，术语“多肽”旨在包括单个的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由酰胺键(也称肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或两个以上氨基酸的任何一条或多条链，并不指该产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语均包含在“多肽”的定义内，且该术语“多肽”可以用于代替这些术语中的任何术语，或与这些术语互换。术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰的产物，包括无限制的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然的生物来源或由重组技术生产，但不一定是从指定的核酸序列转化而来的。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成生成。
如本文所用，术语“分离的”涉及细胞、核酸如DNA或RNA，分别是指与其他DNA或RNA分离的分子，它们存在于天然来源的大分子中。如本文所用，术语“分离的”在使用重组DNA技术生产时，也指基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或在用化学方法合成时，也指化学前体或其他化学物质。此外，“分离的核酸”意味着包括不是天然存在为片段且不会在自然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也指与其他细胞蛋白或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽的意义涵盖既有纯化的多肽也有重组的多肽。
如本文所用，术语“重组”与多肽或多核苷酸有关，是指并非天然存在的多肽或多核苷酸形式，其非限制性实例是通过将通常不会在一起的多肽或多核苷酸组合在一起产生的。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，可以为了比较的目的而将这些序列进行比对。当被比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这两个分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性程度是由所述序列共享的匹配或同源位置数目的函数。“不相关”或“非同源”序列与本公开序列中的一个序列具有少于40％同一性，尽管优选少于25％同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指在比对时，比较的这两个序列中碱基(或氨基酸)百分比相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定这种比对以及同源性百分比或序列同一性，例如，描述于以下文献中的那些软件：Ausubeletal.eds.(2007)CurrentProtocols inMolecularBiology。优选地，使用默认参数进行比对。一个比对程序是BLAST，使用默认参数。具体地，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传代码(Genetic code)＝标准；过滤器(filter)＝无；链(strand)＝两者；截断值(cutoff)＝60；期望值(expect)＝10；矩阵(Matrix)＝BLOSUM62；描述(Descriptions)＝50个序列；分类依据(sortby)＝高分；数据库(Databases)＝非冗余，GenBank+EMCBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。具有生物等效性的多核苷酸是下述那些：其具有上述指定的同源性百分比，并且编码具有相同或相似生物活性的多肽。
术语“等效核酸或多核苷酸”是指含有与该核酸的核苷酸序列或其互补序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物旨在包括含有与该核酸的核苷酸序列或其互补序列具有一定程度的同源性的核苷酸序列的核酸。在一个方面中，核酸的同源物能够与该核酸或其互补杂交。同样，“等效多肽”是指与参比多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，所述序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参比多肽或多核苷酸相比，该等效多肽或多核苷酸具有一、二、三、四或五个添加、缺失、替换及其组合。在某些方面，该等效序列保留参比序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。
杂交反应可以在不同的“严谨度”条件下进行。通常，在约40℃、约10x SSC或等效离子强度/温度的溶液中进行低严谨度的杂交反应。通常在约50℃、约6x SSC进行中严谨度的杂交，通常在约60℃、约1x SSC进行高严谨度的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性实例是温度、离子强度，pH和通常在细胞中发现的Mg2+浓度。
多核苷酸由四个核苷酸的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及当多核苷酸是RNA时为尿嘧啶(U)替换胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示形式。可以将这种字母表示形式输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指基因或其部分的多于一种形式的共存。基因的一部分至少有两种不同的形式，即两种不同的核苷酸序列，被称为一个“基因的多态性区域”。一个多态性区域可为下述单核苷酸，其在不同等位基因上有不同的身份。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何已知或未知的三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在组装多核苷酸之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。聚合后可以对多核苷酸进行进一步修饰，如通过与标记组分缀合。该术语也指双链和单链分子两者。除非另有规定或要求，本公开任何实施方案的多核苷酸包含双链形式的多核苷酸和已知或预测将构成双链形式的两个互补单链形式的每一条链。
术语“编码”应用于多核苷酸时是指这样一种多核苷酸，如果是在其原始状态下或按照本领域技术人员已知的方法操作后，则称其为“编码”一种多肽，其为可以被转录和/或翻译以产生所述多肽和/或其片段的mRNA。反义链是该核酸的互补链，因此可以由其推导出编码序列。
如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可为完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括任何蛋白或多肽，其含有包含具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的分子。此类实例包括但不限于：重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不论结构如何，抗体片段都与完整抗体可识别的相同抗原结合在一起。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体(spiegelmers)和双抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起抗体作用的任何合成或基因工程的蛋白。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在某些方面，这些区域连接有10至约25个氨基酸的短接头肽。接头可以富含甘氨酸以增强柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增强溶解度，并且可以将VH的N端与VL的C端相连，或者反过来。该蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子在现有技术中是已知的，其描述于例如，美国专利US5,892,019。
术语抗体涵盖可以生物化学地区分的各种多肽。本领域技术人员应理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γl-4)。这条链的性质分别将抗体的“类别”确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被很好地表征，并且已知可以赋予功能特异性。从本公开的角度，对于本领域技术人员来说，可以容易地分辨出这些类别和同种型的每个修饰的形式，并且相应地在本公开的范围内。所有免疫球蛋白类别均明确地在本公开的范围内，以下讨论通常将针对IgG类的免疫球蛋白分子。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个分子量为约23,000道尔顿的相同轻链多肽，以及两个分子量为53,000-70,000的相同重链多肽。这四个链通常以“Y”构型通过二硫键连接在一起，其中轻链从“Y”口开始括住(bracket)重链并持续穿过可变区。
本公开的抗体、抗原结合多肽及其变体或衍生物包括但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人的、人源化、灵长类源的(primatized)或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VK或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如本文公开的针对LIGHT抗体的抗-Id抗体)。本公开的免疫球蛋白或抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚型。
轻链分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类型都可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，且两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键彼此结合，或者当由杂交瘤、B细胞或基因工程的宿主细胞产生免疫球蛋白时通过非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N端延伸到每条链底部的C端。
轻链和重链都分为结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”均用于功能上表示。在此方面，应理解轻(VK)和重(VH)链部分的可变结构域决定了抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，如分泌、经胎盘迁移率、Fc受体结合、补体结合等。惯例地，恒定区结构域的编号随着与抗原结合位点或抗体氨基末端的距离越来越远而增加。N端部分是可变区，而C端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)下位概念组合起来形成了限定出三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成了Y的各臂末端的抗原结合位点。更具体地说，所述抗原结合位点是由VH和VK链各自的三个CDR定义的(即，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在某些情况下，例如来自骆驼科物种或基于骆驼科免疫球蛋白进行工程化的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而没有轻链。参见例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，每个抗原结合域中存在的六个“互补决定区”或“CDRs”是短的、非连续的氨基酸序列，这些序列被具体地定位以形成所述抗原结合域(因所述抗体在水性环境中呈现其三维构型)。抗原结合域中的其余氨基酸被称为“框架”区，其分子间变异性较小。框架区在很大程度上采用了β-折叠结构，并且这些CDR形成的环连接了β-折叠结构或在一些情况下形成所述β-折叠结构的一部分。因此，框架区的作用是形成一个骨架，该骨架通过链间非共价相互作用以正确的方向提供CDR的定位。由定位的CDR形成的抗原结合域限定了与免疫反应性抗原的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地针对任何给定的重链或轻链可变区分别确定包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被精确定义(参见，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”Kabat,E.,et al.,美国卫生和公众服务部(U.S.DepartmentofHealth and Human Services),(1983)；以及Chothia andLesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。
在技术领域中使用和/或接受一个术语有两个或更多个定义的情况下，本文中所使用的术语定义旨在包括所有这些含义，除非明确地有相反的说明。一个具体的实例是，使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。该特定区已描述于Kabat,E.,et al.,美国卫生和公众服务部(U.S.DepartmentofHealth and Human Services),“Sequences ofProteins ofImmunological Interest”(1983)，以及Chothia etal.,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987)，其全部内容通过引用整体并入本文。根据Kabat和Chothia，当相互比较时CDR的定义包括氨基酸残基的彼此重叠或包含。但是，应在本文定义和使用的术语范围内应用任一定义来提及抗体或其变体的CDR。下表中列出了根据上述各参考文献定义的包含CDR的合适氨基酸残基作为比较。包含特定CDR的确切残基数会随CDR的序列和大小而有所变化。那些本领域的技术人员可以常规地确定哪些残基包含给定的抗体可变区氨基酸序列的特定CDR。
可以将重链和轻链可变结构域组合成各种成对组合，以产生许多抗PD-L1抗体部分。表1和表3C中提供了抗PD-L1抗体的示例性序列。表1中所示的示例性CDR、VH和VK序列是根据《国际免疫遗传信息***(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION
Figure BDA0002900261730000151
(IMGT))》定义的。参见例如，Lefranc,MP et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015)，其公开的全部内容通过引用整体并入本文。那些本领域技术人员将认识到，已知许多算法可预测抗体重链和轻链可变区中的CDR位置，以及含有来自本文所述的抗体的CDR的抗体试剂(但基于除IMGT以外的预测算法)均在本发明的保护范围内。表3C列出了各种其他编号方案和/或定义下的示例性CDR序列。
Kabat Chothia Contact Abm
CDR-H1 31-35 26-32 30-35 26-35
CDR-H2 50-65 52-56 47-58 50-58
CDR-H3 95-102 95-102 93-101 95-102
CDR-L1 24-34 26-32 30-36 24-34
CDR-L2 50-56 52-56 46-55 50-56
CDR-L3 89-97 89-97 89-96 89-97
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号***。本领域普通技术人员能够明确地将“Kabat编号”***分配给任何可变结构域序列，而无需依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指Kabat,E.,et al.,美国卫生和公众服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services),“Sequences ofProteinsofImmunological Interest”(1983)中所描述的编号***。
除上述表格外，Kabat编号***还描述了如下所示的CDR区：CDR-H1开始于约氨基酸31(即在第一个半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸残基，并结束于下一个色氨酸残基。CDR-H2开始于CDR-H1末端后第15个残基，包括约16-19个氨基酸，并结束于下一个精氨酸或赖氨酸残基。CDR-H3开始于约CDR-H2末端后约第33个氨基酸残基；包括3-25个氨基酸；并结束于序列W-G-X-G，其中X是任意氨基酸。CDR-L1开始于约残基24(即在半胱氨酸残基以后)；包括约10-17个残基；并结束于下一个色氨酸残基。CDR-L2开始于CDR-L1末端后约第16个残基，并且包括约7个残基。CDR-L3开始于CDR-L2末端后约第33个残基开始(即，在半胱氨酸残基以后)；包括约7-11个残基，并结束于序列F或W-G-X-G，其中X是任意氨基酸。
本文公开的抗体可来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，所述抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，可变区可源自软骨鱼类(例如来自鲨鱼)。
如本文所用，术语“重链恒定区”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一个：CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，在本公开中使用的抗原结合多肽可包含含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH2域的多肽链；含有CH1结构域和CH3域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本公开的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，在本公开中使用的抗体可缺少至少一部分CH2结构域(例如，CH2结构域的全部或部分)。综上所述，本领域普通技术人员应理解，可以对重链恒定区进行修饰，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
本公开的抗体的重链恒定区可来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链恒定区可包含部分来自IgG1分子和部分来自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来自IgG1分子和部分来自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链恒定区”包括衍生自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，轻链恒定区包含至少一个恒定κ结构域或恒定λ结构域。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可以通过二硫键在轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间形成二聚体。
如前所述，各种免疫球蛋白类型的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且处于免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括重链分子的一部分，该部分使用常规的编号方案例如从抗体的约残基244延伸至残基360(残基244-360，Kabat编号***；以及残基231-340，EU编号***)；请参见Kabat,E.,etal.,美国卫生和公众服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services),“Sequences ofProteins ofImmunological Interest”(1983)。CH2结构域的唯一性在于，它与另一个结构域没有紧密配对。而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间***了两条N-连接的分支碳水化合物链。也有文件证明CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C端，并包含约有108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接到CH2结构域的重链分子部分。所述铰链区约包含25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。铰链区域可分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域(Roux etal.,J.Immunol161:4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸含有一个硫醇基团，其可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥联。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区通过二硫键相连，并且两条重链通过两个二硫键相连，其采用Kabat编号***的相应位置为239和242(EU编号***的位置为226或229)。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中免疫反应区或位点获自或源自第一物种，而恒定区(根据本公开其可为完整的、部分的或经修饰的)获自或源自第二物种。在一些实施方案中，靶标结合区或位点将来自非人类来源(例如鼠类或灵长类)，而恒定区则是人类的。
如本文所用，通过如下步骤来计算“人源化百分比”：确定人源化结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差异的数目(即非CDR差异)，从氨基酸总数中减去该数目，然后除以氨基酸总数并乘以100。
一般说来，“特异性结合”或“对…具有特异性”是指抗体通过其抗原结合域结合到表位上，并且该结合要求所述抗原结合域与表位之间具有一定的互补性。根据该定义，抗体在通过其抗原结合域结合到该表位时，要比结合至随机的不相关表位上要容易得多，则该抗体被称为“特异性结合”至该表位。本文使用术语“特异性”来确定相对亲和力，即某些抗体通过相对亲和力结合到某些表位。例如，对于给定的表位，抗体“A”可能被认为具有比抗体“B”更高的特异性，或者相比相关表位“D”，可以说抗体“A”与表位“C”的结合具有更高的特异性。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment)”是指治疗性处理和预防性(prophylactic/preventative)措施，其中目的是防止或减慢(减轻)不良的生理变化或病症，诸如癌症进展。有益或理想的临床结果包括但不限于：症状缓解、疾病程度减轻、病情稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或减轻以及缓解(部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可以指与未接受治疗的预期生存期相比，延长了生存期。那些需要治疗的个体包括那些已经处于病况或病症的，以及那些易于患有病况或病症的，或者那些其病况或病症有待预防的个体。
“受试者”或“个体”、或“动物”或“哺乳动物”用来指代任何受试者，尤其是哺乳动物受试者，其需要进行诊断、预后或治疗。哺乳动物受试者包括：人类、家畜、农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
如本文所用，短语如“针对需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”包括诸如哺乳动物受试者的受试者，其可以从施用(例如用于检测、诊断过程和/或治疗的)本公开抗体或组合物中受益。
抗PD-1抗体
本公开提供了对人PD-1蛋白具有高亲和力的抗PD-1抗体。经测试的抗体具有有效的结合和抑制活性，并可用于治疗和诊断用途。此外，一种经过测试的人源化抗体(TY101)具有比两种FDA批准的抗hPD-1抗体明显更高的结合亲和力。
因此，本公开的一个实施方案提供了抗PD-1抗体或其片段，该抗体或其片段可以特异性结合人程序性死亡1(PD-1)蛋白。
根据本公开的一个实施方案，提供了一种抗体，其包括具有重链和轻链可变结构域的抗体，所述可变结构域具有表1的CDR组之一的CDR区。
表1：CDR区的序列
Figure BDA0002900261730000191
Figure BDA0002900261730000201
例如，在一个实施方案中，提供了对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，且其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3为：HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)。
例如，在一个实施方案中，提供了对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，且其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3为：HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)。
例如，在一个实施方案中，提供了对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，且其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3为：HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO:18)。
实验实施例证明，包含这些CDR区的抗体，无论是小鼠的、人源化还是嵌合的，都具有有效的PD-1结合和抑制活性。进一步的计算机建模表明，可以修饰CDR中的某些残基以保留或改善抗体的性能。在一些实施方案中，本公开的抗PD-1抗体包括表1所列的VH和VLCDR，具有一个、两个或三个进一步的修饰。此类修饰可以为氨基酸添加、缺失或替换。
在一些实施方案中，所述修饰为在每个CDR的不超过一个热点位置的替换。在一些实施方案中，所述修饰为在一个、两个或三个这种热点位置的替换。在一个实施方案中，所述修饰为在一个这种热点位置的替换。在某些实施方案中，此类替换是保守的替换。
“保守氨基酸替换”是用具有相似侧链的氨基酸残基代替其中的氨基酸残基。在现有技术中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选地，将免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的、结构相似的氨基酸串来代替一串氨基酸。
下表提供了保守氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示两个氨基酸之间的保守性氨基酸替换。
氨基酸相似度矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
保守氨基酸替换
Figure BDA0002900261730000221
SEQ ID NO:27、SEQ ID ID NO：31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39中提供了VH的非限制性实例。SEQ ID NO:27是鼠VH。SEQ ID NO:31是嵌合抗体的VH，而SEQID ID NO：35、SEQ ID ID NO：37和SEQ ID NO:39是人源化的。
SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45提供了VL的非限制性实例。SEQ ID NO:29是鼠VL。SEQ ID NO:33是嵌合抗体的VL，而SEQ ID IDNO：41、SEQ ID ID NO：43和SEQ ID NO:45是人源化的。
在一些实施方案中，本公开的抗PD-1抗体包括：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:39的VH，SEQ ID NO:29、SEQ ID ID NO：33、SEQ IDID NO：41、SEQ ID ID NO：43或SEQ ID NO:45的VL，或它们各自的生物学等效物。VH或VL的生物学等效物是这样的序列，其包括指定的氨基酸同时具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。例如，SEQ ID NO:27的生物学等效物可为这样的VH，其与SEQ IDNO:27具有总体80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，但保留了CDR。
本领域技术人员还应理解，在本文中公开的抗体可以经过修饰以使得它们的氨基酸序列不同于其所源自的天然存在的结合多肽。例如，源自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可能相似，例如与起始序列具有一定的同一性百分比，例如，可与起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
在某些实施方案中，所述抗体包含通常不与该抗体相连接的氨基酸序列或一个或多个部分。以下将详细说明示例性修饰。例如，本公开的抗体可以包括柔性接头序列，或者可以经过修饰以添加功能部分(例如PEG、药物、毒素或标签)。
本公开的抗体、变体或其衍生物包括经修饰的衍生物，即通过将下述类型的分子共价连接到所述抗体上，其使得共价连接不阻止抗体与表位的结合。例举地但并非限制性地，可以修饰抗体，例如通过已知的保护/阻断基团进行糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、衍生化，蛋白水解裂解和连接至细胞配体或其他蛋白等。可以通过已知技术进行任何多种化学修饰，其包括但不限于：特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述抗体可包含一种或多种非典型氨基酸。
在某些实施方案中，所述抗体可与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物或PEG缀合。
所述抗体可以与治疗剂缀合或融合，其中可以包括可检测的标记物，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、细胞毒性试剂，其可为药物或毒素、超声波增强剂、非放射性标记和它们的组合，以及本领域已知的其他此类试剂。
可以通过将其与化学发光化合物结合来对抗体进行可检测的标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的荧光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例有：鲁米诺、异鲁米诺、Theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
还可以使用荧光发射金属如152Eu或镧系的其他元素对抗体进行可检测的标记。可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团来将这些金属连接到抗体上。将各种部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见例如：Arnon etal.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,inControlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.,(eds.),Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,“Antibody Carriers OfCytotoxicAgents In CancerTherapy:A Review”,in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pincheraet al.(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,AndFuture Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin etal.(eds.),Academic Press pp.303-16(1985),以及Thorpe et al.,“The PreparationAnd Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.(52:119-58(1982))。
双功能分子
PD-1是一种免疫检查点分子，也是一种肿瘤抗原。作为靶向肿瘤抗原的分子，可以将对PD-1具有特异性的抗体或抗原结合片段与对免疫细胞具有特异性的第二抗原结合片段结合，以生成双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、吞噬细胞、天然杀伤细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞。免疫细胞上可以被靶向的分子包括：例如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。其他实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG-3(也称为CD223)、CD28、CD122、4-1BB(也称为CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称为CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和CD47。双特异性的具体实例包括但不限于：PD-L1/PD-1、PD-1/LAG3、PD-1/TIGIT和PD-1/CD47。
作为免疫检查点抑制剂，可以将对PD-1具有特异性的抗体或抗原结合片段与对肿瘤抗原具有特异性的第二抗原结合片段结合，以生成双特异性抗体。“肿瘤抗原”是在肿瘤细胞中产生的一种抗原物质，即它触发了宿主的免疫反应。肿瘤抗原可用于识别肿瘤细胞，是用于癌症治疗的潜在候选物。体内的正常蛋白质不是抗原。但是，某些蛋白质是在肿瘤发生过程中产生或过表达的，因此会在人体中显示为“异物”。这可能包括：与免疫***很好地隔离的正常蛋白质，通常以极小的数量产生的蛋白质，通常仅在特定的发育阶段产生的蛋白质，或由于突变而改变了其结构的蛋白质。
在现有技术中已知有大量的肿瘤抗原，并且可以通过筛选容易地鉴别出新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合蛋白、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和腱生蛋白。
在某些方面，与在相应的非肿瘤细胞中相比，单价单元对在肿瘤细胞中过表达的蛋白质具有特异性。本文所用的“相应的非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞起源相同的细胞类型的非肿瘤细胞。注意到这些蛋白质不一定与肿瘤抗原不同。非限制性实例包括：癌胚抗原(CEA)，其在大多数结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过表达；调蛋白受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、***癌和***中经常过度表达；表皮生长因子受体(EGFR)，其在一系列实体瘤中高度表达，包括乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌和***癌；去唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；在肝细胞上表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合受体；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰腺导管腺癌细胞中过表达；用于抗血管生成基因治疗的血管内皮生长因子受体(VEGFR)；叶酸受体，其在90％的非粘液性卵巢癌中选择性过表达；细胞表面的多糖蛋白复合物；碳水化合物受体；以及聚合免疫球蛋白受体，其可用于对呼吸道上皮细胞作基因转移，并且有潜力治疗囊性纤维化等肺部疾病。就此而言，双特异性的非限制性实例包括：PD-1/EGFR、PD-1/Her2、PD-1/CD33、PD-1/CD133、PD-1/CEA和PD-1/VEGF。
还提供了不同格式的双特异性抗体。在一些实施方案中，抗PD-1片段和第二片段各自独立地选自下组：Fab片段，单链可变片段(scFv)或单域抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体还包括Fc片段。
还提供了不仅仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为靶向肿瘤抗原的分子，对PD-1具有特异性的抗体或抗原结合片段(如本文所述的那些)可以可选地通过肽接头与免疫细胞因子或配体结合。所述连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。这种双功能分子可以将免疫检查点阻断作用与肿瘤位点局部免疫调节相结合。
编码所述抗体及其片段的多核苷酸
在一些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码本文所述的抗体或其片段的核苷酸序列。
本申请还提供了编码本文所述的抗体(例如抗PD-1抗体)的一条或多条链的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码抗体(例如抗PD-1抗体)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子既包含编码抗体(例如抗PD-1抗体)的重链的多核苷酸，也包含编码抗体(例如抗PD-1抗体)的轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，而第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。在某些实施方案中，提供了编码片段(例如抗PD-1片段)的核酸分子。
在某些此类实施方案中，所述重链和轻链由一个核酸分子或两个独立的核酸分子表达为两个独立的多肽。因此，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码本文所述的抗体或其片段的重链的核苷酸序列。例如，所述重链可包含选自SEQ IDNo:19、23、27、31、35、37和39或其变体的氨基酸序列。例如，所述核苷酸序列可包含选自SEQ ID No:20、24、28、32、36、38和40或其变体的核苷酸序列。例如，所述重链可包含与选自SEQ ID No:19、23、27、31、35、37和39的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。例如，所述核苷酸序列可包含与选自SEQ ID No:20、24、28、32、36、38和40或其变体的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述变体与本文所述的序列在CDR以外部分有所不同。
或者，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码本文所述的抗体或其片段的轻链的核苷酸序列。例如，所述轻链可包含选自SEQ ID No:21、25、29、33、41、43和45或其变体的氨基酸序列。例如，所述核苷酸序列可包含选自SEQ ID No:22、26、30、34、42、44和46或其变体的核苷酸序列。例如，所述轻链可能包含与选自SEQ ID No:21、25、29、33、41、43和45的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。例如，所述核苷酸序列可包含与选自SEQ IDNo:22、26、30、34、42、44和46或其变体的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述变体与本文所述的序列在CDR以外部分有所不同。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码CDR的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码选自SEQ ID No:1-18的氨基酸序列或其变体的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码与选自SEQ ID No:1-18的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码抗体(例如抗PD-1抗体)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在被翻译时位于重链或轻链的N末端。所述前导序列可为天然的重链或轻链前导序列，也可为另一异源前导序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸构建体，其包含本文所述的多核苷酸。所述核酸构建体可还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列。
核酸分子可以使用本领域常规的重组DNA技术构建。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定宿主细胞中表达的表达载体。
因此，本公开还提供了包含本文所述的多核苷酸的核酸构建体。可以使用本文所述的任何方法制备所述核酸构建体。
在一些实施方案中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列。在某些实施方案中，所述一个或多个控制序列在适当的宿主中指导本文所述的抗体或其片段的生产。在一些实施方案中，所述一个或多个控制序列选自下组：启动子、增强子、停止信号、信号肽、前导序列、转录终止子和它们的任意组合。例如，所述一个或多个控制序列可为启动子。
在一些实施方案中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸对应于一个基因，其中所述启动子是该基因的野生型启动子。
本公开还提供了包含本文所述的核酸构建体的载体。
提供了包含编码本文所述的任何一种抗体(例如抗PD-1抗体)的重链和/或轻链的多核苷酸的载体。还提供了包含编码本文所述的任何抗体片段的多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，所述载体选自下组：载体、质粒、噬菌体、粘粒、S因子、逆转录因子、逆转录病毒、病毒、人工染色体(YAC、BAC或MAC)和微型染色体和染色体。
在一些实施方案中，载体包括编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述重链和轻链由载体表达为两个独立的多肽。在某些实施方案中，所述重链和轻链是作为单个多肽的一部分表达的，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，所述载体是一种表达载体。在一些实施方案中，含有本文所述的编码多肽的核酸序列(或其活性衍生物或片段)的表达载体，与至少一个调控序列可操作地连接。许多表达载体是可商购的，并且熟练的技术人员可以容易地制备其他合适的载体。“可操作地连接”是指核苷酸序列以某种方式与调控序列相连接，从而可以表达该核酸序列。调控序列是本领域公认的，并被选择以生产多肽或其活性衍生物或片段。因此，术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件，其描述于：Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。例如，可以使用天然调控序列或生物体固有的调控序列。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸，而第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在某些实施方案中，将相似量(例如相似摩尔量或相似质量)的第一载体和第二载体转染到的宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比为5：1至1：5的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，使用质量比为1：1至1：5的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，使用质量比为1：2的编码重链的载体和编码轻链的载体。
在某些实施方案中，选择了优化的载体以在宿主细胞(诸如CHO或源自CHO的细胞、或NSO细胞)中表达多肽。示例性载体描述于例如，Running Deer etal.,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
因此，本公开还提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的核酸构建体或本文所述的载体。
在某些实施方案中，所述核酸构建体或载体被整合到宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，所述核酸构建体或载体是作为染色体外实体存在的。所述宿主细胞可为原核细胞。所述宿主细胞可为真核宿主细胞。例如，所述宿主细胞可为哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞可为人类细胞。
在某些实施方案中，本文所述的抗体(例如抗PD-1抗体)可在原核细胞如细菌细胞中表达；或在真核细胞如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。例如，可以根据本领域已知的方法进行这种表达。可用于表达多肽的示例性真核细胞，包括但不限于：COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；
Figure BDA0002900261730000291
细胞(Crucell)；和NSO细胞。在某些实施方案中，可在酵母中表达本文所述的抗体(例如，抗PD-1抗体)。参见，例如，美国公开文本US2006/0270045A1。在一些实施方案中，根据其对抗体的重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力，选择特定的真核宿主细胞。例如，在某些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞产生的相同多肽的唾液酸化水平。
可通过任何方法将一种或多种核酸引入到所需的宿主细胞中，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性实例性方法描述于例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。可以根据任何合适的方法将核酸瞬时或稳定地转染到所需的宿主细胞中。
本发明还提供了包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含抗PD-1抗体的宿主细胞。任何能够表达过量的异源DNA的宿主细胞都可以用于分离编码所述抗体、目标多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于：COS、HeLa和CHO细胞。另请参见PCT公开WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌(E.coli)、或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母菌(如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。在某些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。
在某些实施方案中，所述抗体是在无细胞***中产生的。非限制性的示例性无细胞***描述于例如，Sitaraman etal.,MethodsMol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo et al.,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
可以通过任何适当的方法纯化抗体(例如抗PD-1抗体)。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱法。合适的亲和配体包括ROR1ECD和与抗体恒定区结合的配体。例如，可以将蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱用于结合到恒定区并纯化包含Fc片段的抗体。疏水性相互作用色谱法，例如丁基或苯基柱，也可适用于纯化某些多肽如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可适用于纯化某些多肽如抗体。混合模式色谱法(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化某些多肽如抗体。在本领域中已知许多纯化多肽的方法。
本公开还提供了包含本文所述的任何抗体或其片段、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在某些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的培养基。
在某些实施方案中，所述培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸腺嘧啶核苷(例如HAT培养基)。在某些实施方案中，所述培养基不包含血清。在某些实施方案中，所述培养基包含血清。在一些实施方案中，所述培养基是D-MEM或RPMI-1640培养基。
制备抗体的方法在现有技术中是众所周知的，并在此描述。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区是全人的。可以使用本领域描述的和本文所述的技术制备全人抗体。例如，可以通过对经过修饰以生产抗体的转基因动物施用抗原来响应所述抗原挑战，以制备针对该特定抗原的全人抗体，该动物的内源基因座已失活。可用于制备此类抗体的示例性技术描述于美国专利US6,150,584、US6,458,592和US6,420,140，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，制备的抗体不会对要治疗的动物(例如人)产生有害的免疫反应。在一个实施方案中，使用本领域公认的技术修饰了本公开的抗原结合多肽、其变体或衍生物，以降低其免疫原性。例如，可以将抗体进行人源化、灵长类化(primatized)、去免疫，或者可制备嵌合抗体。这些类型的抗体来自非人类抗体，通常是鼠类或灵长类动物抗体，它们保留或基本保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人体内的免疫原性较低。这可以通过多种方法来实现，包括：(a)将整个非人类可变结构域移植到人类恒定区上以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区域(CDR)的至少一部分移植到保留或不保留关键框架残基的人类框架和恒定区中；或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过替换表面残基用类人的部分来“遮蔽”它们。此类方法公开于：Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA57:6851-6855(1984)；Morrison et al.,Adv.Immunol.44:65-92(1988)；Verhoeyen etal.,Science 239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.25:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31:169-217(1994)，以及美国专利US5,585,089、US5,693,761、US5,693,762和US6,190,370，上述文献通过引用整体并入本文。
也可以使用去免疫来降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如国际申请公开WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析了来自起始抗体的可变重链和可变轻链序列，并分析了每个V区的人T细胞表位图，显示了与互补决定区(CDR)相关的表位的位置，并在该序列中产生了其他关键残基。分析T细胞表位图中的单个T细胞表位，以鉴别出具有改变最终抗体活性的低风险的替选的氨基酸替换。设计了一系列的替选的可变重链和可变轻链序列，这些序列包含氨基酸替换的组合，这些序列随后被整合到一系列结合多肽中。通常情况下，会生成12-24个变异抗体，并进行结合和/或功能测试。将包含修饰的可变区和人恒定区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并将随后的质粒导入细胞系中，以生产完整的抗体。然后在适当的生化和生物学分析中比较抗体，并确定最佳变体。
可以通过体外测定如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定本发明的抗原结合多肽的结合特异性。
或者，可采用描述了单链单元生产的技术(美国专利US4,694,778；Bird,Science242:423-442(1988)；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)；以及Ward etal.,Nature 334:544-554(1989))来生产本公开的单链单元。通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。
可用于生产单链Fvs(scFvs)和抗体的技术实例包括那些描述于以下文献的技术：美国专利US4,946,778和US5,258,498；Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995-1999(1993)；and Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)。对于某些用途，包括在人体中体内使用抗体和体外检测的测定法，优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分的来自不同的动物物种，如抗体具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi etal.,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；美国专利US5,807,715、US4,816,567和US 4,816397；上述文献通过引用整体并入本文。
人源化抗体是源自非人类物种抗体的抗体分子，该抗体具有结合预期抗原的来自非人类物种一个或多个互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架残基会被来自CDR供体抗体的相应残基替换，以改变(优选地改善)抗原结合。这些框架替换是通过本领域公知的方法来鉴别的，例如，通过CDR和框架残基相互作用的建模来确定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，从而鉴别出在特定位置的异常框架残基。(参见，例如，Queen et al.,U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmannet al.,Nature 332:323(1988)，其通过引用整体并入本文)。可以使用多种现有技术将抗体人源化，例如CDR嫁接(EP239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利US5,225,539、US5,530,101和US5,585,089)，饰面或表面重修饰(EP592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.etal.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))，以及链混排(chain shuffling)(美国专利US5,565,332，其通过引用整体并入本文)。
全人抗体特别适合人类患者的治疗处理。可以使用本领域已知的多种方法来制备人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。另请参见美国专利US4,444,887和US4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其各自通过引用整体并入本文。
也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生产人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体随机引入或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座，可以分别或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因失效。具体地，JH区的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠繁殖出能表达人抗体的纯合子代。将转基因小鼠用选定的抗原，例如全部或一部分所需的靶标多肽进行常规免疫。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。被转基因小鼠接收的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程进行重排，并随后进行类型转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关生产人抗体的这项技术的综述，参见Lonberg and HuszarInt.Rev.Immunol.73:65-93(1995)。有关生产人抗体和人单克隆抗体以及生产此类抗体的方案的详细技术讨论，参见例如，PCT公开WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；美国专利US5,413,923；US5,625,126；US5,633,425；US5,569,825；US5,661,016；US5,545,806；US5,814,318和US5,939,598，其通过引用整体并入本文。此外，诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和GenPharm(San Jose,Calif.)的公司，可以使用与上文所述类似的技术，提供针对选定的抗原的人抗体。
也可以使用称为“指导选择”的技术来生成能够识别选定的表位的全人抗体。在此方法中，使用了选定的非人类单克隆抗体，例如小鼠抗体，以指导选择识别相同表位的全人抗体(Jesperset al.,Bio/Technology 72:899-903(1988)；另请参见美国专利US5,565,332；其通过引用整体并入本文)。
在另一个实施方案中，可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码所需单克隆抗体的DNA。分离和亚克隆的杂交瘤细胞是此类DNA的首选来源。分离后，可以将DNA放入表达载体中，然后将其转染到原核或真核宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不再产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。更具体地讲，可以将分离的DNA(可以为如本文所述的合成物)用于克隆恒定区和可变区序列以制备抗体，其描述于1995年1月25日提交的美国专利Newman et al.,U.S.Pat.No.5,658,570，其通过引用整体并入本文。从本质上讲，这要求从选定的细胞中提取RNA，转化为cDNA，并使用Ig特异性引物通过PCR进行扩增。用于此目的的合适引物也描述于美国专利US5,658,570。如将在以下详细讨论的，表达所需抗体的转化细胞可能会以相对较大的数量生长，以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
此外，可以使用常规重组DNA技术，将本公开的抗原结合多肽的一个或多个CDR***框架区内，例如，***人框架区以人源化非人类抗体。框架区可为自然发生或共有框架区，优选为人框架区(人框架区的列表参见例如，Chothiaetal.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998))。优选地，由框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码特异性结合所需多肽(例如，LIGHT)的至少一个表位的抗体。优选地，可以在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，并且优选地，氨基酸替换改善抗体与其抗原的结合。此外，此类方法可用于产生参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸替换或缺失，以生成缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本公开内容和现有技术范围内包括了对所述多核苷酸的其他改变。
此外，也可以使用通过将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因剪接，开发用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:851-855(1984)；Neuberger et al.,Nature 372:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))。如本文所用，嵌合抗体是一种这样的分子，其中不同部分来自不同的动物物种，如具有源自鼠类单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些嵌合抗体。
Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)公开了另一种用于产生重组抗体的高效方法。具体来说，这项技术导致包含猴子可变结构域和人恒定序列的灵长类化抗体的产生。该参考文献通过引用整体并入本文。此外，该技术还描述于通常指定的美国专利US5,658,570、US5,693,780和US5,756,096，其各自通过引用并入本文。
或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术，选择并培养生产抗体的细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中都有描述。在这种情况下，适用于本公开以下描述的技术，描述于Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,Eds.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,NewYork(1991)，其通过引用整体(包括增补内容)并入本文。
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术，在编码本公开的抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于：导致氨基酸替换的定点诱变和PCR-介导的诱变。优选地，相对于参比可变重链区CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3，以及参比可变轻链区CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换，少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。或者，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变并对所得突变体的生物学活性进行筛选，以鉴别保留了活性的突变体。
癌症治疗
如本文所述，可以在某些治疗和诊断方法中使用本公开的抗体、其变体或衍生物。
本公开还针对基于抗体的疗法，其涉及对诸如动物、哺乳动物和人类患者施用本公开的抗体，以治疗一种或多种本文所述的病症或病况。本公开的治疗化合物包括但不限于：本公开的抗体(包括本文所述的变体和衍生物)以及编码本公开的抗体的核酸或多核苷酸(包括本文所述的变体和衍生物)。
本公开的抗体也可以用于治疗或抑制癌症。PD-1可在肿瘤细胞中过表达。肿瘤衍生的PD-1可与免疫细胞上的PD-L1结合，从而限制了抗肿瘤T细胞的免疫力。在鼠肿瘤模型中使用小分子抑制剂或靶向PD-1的单克隆抗体的结果表明，靶向的PD-1治疗是有效控制肿瘤生长的重要替选和现实方法。如在实验性实例中所示，抗PD-1抗体激活了自适应免疫应答机制，可以提高癌症患者的生存率。
因此，在一些实施方案中提供了用于治疗有需要的患者的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法要求向患者施用有效量的本公开的抗体。在某些实施方案中，患者的至少一个癌细胞(例如，基质细胞)表达、过度表达或经诱导表达PD-1。例如可以通过施用肿瘤疫苗或放疗来诱导PD-1的表达。
表达PD-1蛋白的肿瘤包括以下那些：膀胱癌、非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、尿道癌、结直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌和小细胞肺癌。因此，本公开的抗体可用于治疗任何一种或多种此类癌症。
在本公开中还提供了细胞疗法，如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。可以使用适当的细胞，使其与本公开的抗PD-1抗体接触(或工程化以用于表达本公开的抗PD-1抗体)。进行此类接触或工程化后，可以将所述细胞引入需要治疗的癌症患者。癌症患者可能患有本文所述的任何类型的癌症。例如，所述细胞(例如T细胞)可为肿瘤浸润的T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合，而没有限制。
在一些实施方案中，所述细胞分离自癌症患者本人(他或她)。在一些实施方案中，所述细胞由捐赠者提供或来自细胞库。当所述细胞分离自癌症患者时，可以将不必要的免疫反应降至最低。
可用本公开的抗体或其变体或衍生物进行治疗、预防、诊断和/或预后评估的、与增加细胞存活有关的其他疾病或病症包括但不限于：恶性肿瘤的进展和/或转移以及相关病症，如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于：肉瘤和癌如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管性肉瘤、内皮细胞肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑素瘤、***癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***癌、胚胎癌、维尔姆氏肿瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、声神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
感染和免疫紊乱的治疗
如实验性实例所示，本公开的抗体可以激活免疫反应，然后可用于治疗感染。
感染是指导致疾病的病原体、其繁殖以及宿主组织对这些生物体及其产生毒素的反应所引起的对生物体组织的入侵。感染可由感染性病原体如病毒、类病毒、朊病毒、细菌，线虫如寄生性蛔虫和蛲虫，节肢动物如壁虱、螨虫、跳蚤和虱子，真菌如轮癣菌，以及其他大型寄生虫如绦虫和其他蠕虫引起。在一个方面，所述感染性病原体是细菌如革兰氏阴性菌。在一个方面，所述感染性病原体是病毒如DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。病毒的非限制性实例包括：腺病毒、柯萨基病毒、艾普斯登-巴尔(Epstein-Barr)病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒类型1、单纯疱疹病毒类型2、巨细胞病毒、人疱疹病毒类型8、HIV、流行性感冒病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人***瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒。
在某些实施方案中还提供了所述抗体或其片段用于治疗免疫紊乱的方法或用途。免疫紊乱的非限制性实例包括：感染、与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、***性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和周围神经***炎性病症、多发性硬化、狼疮和格林-巴利综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、胰腺炎、创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、缺血性疾病、心肌梗塞、动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和缺乏母胎耐受相关的***症。
本公开的抗体还可以用于治疗由微生物引起的传染病或用于杀灭微生物(通过靶向微生物和免疫细胞以消除微生物)。在一个方面，所述微生物是病毒，包括RNA病毒和DNA病毒、***、革兰氏阴性细菌、原生动物或真菌。
例如，所述微生物是肝炎病毒。肝炎病毒的非限制性实例可包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)。
不希望受到任何特定理论束缚地，本文所述的抗体或其片段可阻断PD-1/PD-L1轴的免疫检查点，从而在肝炎患者中使T细胞免受免疫抑制。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段在患有肝炎病毒感染的受试者中诱导T细胞增殖。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段在患有肝炎病毒感染的受试者中诱导T细胞产生细胞因子。非限制性的可由T细胞产生的细胞因子包括：IL-1、IL-18、TNF-α、CD70、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-6、IL-11、IL-31、IL-10、IL-17和TGF-β。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段在患有肝炎病毒感染的受试者中增加了T细胞的细胞毒性。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段在患有肝炎病毒感染的受试者中减少了一个或多个血清学指标。可以使用任何合适的血清学指标。例如，对于HAV，血清学指标可为抗HAV IgM。对于HBV，血清学指标可为HBsAg、HBeAg或抗HBc IgM。对于HCV，血清学指标可为抗HCV。对于HDV，血清学指标可为抗HDV IgM或抗HDV IgG。对于HEV，血清学指标可为抗HEV IgM。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段减少了患有肝炎病毒感染的受试者的病毒载量。例如，可以按受试者中病毒DNA或RNA的量来衡量病毒载量。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段可减少患有HBV感染的受试者的HBV DNA。在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段可减少患有HCV感染的受试者的HCV RNA。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其片段在患有肝炎病毒感染的受试者中降低了氨基转移酶的活性。所述氨基转移酶可为任何合适的氨基转移酶，只要其增加可表明肝炎或肝炎病毒感染即可。例如，所述氨基转移酶可为丙氨酸氨基转移酶(ALT)。例如，所述氨基转移酶可为天冬氨酸氨基转移酶(AST)。
在一些实施方案中，所述增加可为增加约1％至约50倍。在一些实施方案中，所述增加可为增加至少约1％。在一些实施方案中，所述增加可为增加最多约50倍。在一些实施方案中，所述增加可为增加约1％至约2％，约1％至约5％，约1％至约10％，约1％至约20％，约1％至约50％，约1％至约2倍，约1％至约3倍，约1％至约500％，约1％至约10倍，约1％至约50倍，约2％至约5％，约2％至约10％，约2％至约20％，约2％至约50％，约2％至约2倍，约2％至约3倍，约2％至约5倍，约2％约10倍，约2％到约50倍，约5％到约10％，约5％到约20％，约5％到约50％，约5％到约2倍，约5％到约3倍，约5％至约5倍，约5％至约10倍，约5％至约50倍，约10％至约20％，约10％至约50％，约10％至约2倍，约10％至约3倍，约10％至约5倍，约10％至约10倍，约10％至约50倍，约20％至约50％，约20％至约2倍，约20％至约3倍，约20％至约5倍，约20％至约10倍，约20％至约50倍，约50％至约2倍，约50％至约3倍，约50％约5倍，约50％至约10倍，约50％至约50倍，约2倍至约3倍，约2倍至约5倍，约2倍至约10倍，约2倍50倍，约3倍至约5倍，约3倍至约10倍，约3倍至约50倍，约5倍至约10倍，约5倍至约50倍，或约10至约50倍。在一些实施方案中，所述增加可为增加约1％、约2％、约5％、约10％、约20％、约50％、约2倍、约3倍、约5倍、约10倍或约50倍。在一些实施方案中、所述增加可为增加超过约1％、约2％、约5％、约10％、约20％、约50％、约2倍、约3倍、约5倍、约10倍或约50倍。
在一些实施方案中，所述减少可为减少约1％至约90％。在一些实施方案中，所述减少可为减少至少约1％。在一些实施方案中，所述减少可为减少至少最多约90％。在一些实施方案中，所述减少可为减少约1％至约2％，约1％至约5％，约1％至约10％，约1％至约15％，约1％至约20％，约1％至约30％，约1％至约40％，约1％至约50％，约1％至约70％，约1％至约80％，约1％至约90％，约2％到约5％，约2％到约10％，约2％到约15％，约2％到约20％，约2％到约30％，约2％到约40％，约2％约50％，约2％至约70％，约2％至约80％，约2％至约90％，约5％至约10％，约5％至约15％，约5％至约20％，约5％至约30％，约5％至约40％，约5％至约50％，约5％至约70％，约5％至约80％，约5％至约90％，约10％至约15％，约10％至约20％，约10％至约30％，约10％至约40％，约10％至约50％，约10％至约70％，约10％至约80％，约10％至约90％，约15％至约20％，约15％至约30％，约15％至约40％，约15％至约50％，约15％至约70％，约15％至约80％，约15％至约90％，约20％至约30％，约20％至约40％，约20％至约50％，约20％至约70％，约20％至约80％，约20％至约90％，约30％至约40％，约30％至约50％，约30％至约70％，约30％至约80％，约30％至约90％，约40％至约50％，约40％至约70％，约40％至约80％，约40％至约90％，约50％至约70％，约50％至约80％，约50％至约90％，约70％至约80％，约70％至约90％，或约80％至约90％。在一些实施方案中，所述减少可为减少约1％、约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中、所述减少可为减少超过1％、约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约70％、约80％或约90％。
针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定抗体、其变体或衍生物，患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，以及施用时间、***率、药物组合和治疗中特定疾病的严重程度。医护人员对这些因素的判断在本领域普通技能范围内。用量也将取决于要待治疗的患者个体、施用途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度和所需的效果。可通过本领域公知的药理学和药代动力学原理确定用量。
所述抗体、变体的施用方法包括但不限于：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬脑膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径来施用所述抗原结合多肽或组合物，例如通过输注或推注注射，通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)进行吸收，并且可与其他具有生物学活性的药剂一起施用。因此，包含本公开的抗原结合多肽的药物组合物可以口服、经直肠、经肠胃外、经脑池内、经***内、经腹膜内、外敷地(如通过粉末、药膏、滴剂或透皮贴剂)、经口腔或作为口腔或鼻喷雾剂。
如本文所用，术语“肠胃外”指下述施用方式，即包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
施用可为全身的或局部的。另外，可能需要通过任何合适的途径，包括脑室内和鞘内注射，将本公开的抗体引入中枢神经***；可以通过附在诸如奥马耶(Ommaya)储库的储库上的脑室内导管来促进脑室内注射。也可以通过使用吸入器或雾化器并与气溶胶化药剂一起制剂来进行肺部施用。
可能需要在需要治疗的地方局部施用本公开的抗体多肽或组合物；这可以通过例如但不限于下述来实现：手术过程中局部输注、局部应用，例如与手术后的伤口敷料结合使用，通过注射，通过导管，通过栓剂，或通过植入物，其中所述植入物是多孔的、无孔的、或凝胶状材料，包括诸如硅胶弹性体(sialastic)膜的膜、或纤维。优选地，在施用蛋白质时(包括本公开的抗体)，必须注意使用不会吸收蛋白质的材料。
在另一个实施方案中，可以在囊泡中，特别是在脂质体中递送所述抗体或组合物(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat et al.,in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上,pp.317-327；参见，总体同上)。
在另一个实施方案中，所述抗原结合多肽或组合物可以在控释***中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald etal.,1980,Surgery 88:507；Saudek etal.,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,J.,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy et al.,1985,Science 228:190；During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105)。在另一实施方案中，可将控制释放***置于治疗目标即脑的附近，因此仅需要***剂量的一部分(参见例如Goodson,in MedicalApplications ofControlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他的控制释放***在Langer(1990,Science 249:1527-1533)中进行了讨论。
在一个特定的实施方案中，本公开的组合物包含编码蛋白质的核酸或多核苷酸，可以在体内施用所述核酸来促进其编码蛋白的表达，通过将其构建为合适的核酸表达载体一部分并将其施用而使其成为细胞内物质，例如，使用逆转录病毒载体(参见美国专利US4,980,286)，或通过直接注射，或通过采用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入细胞核的同源盒样肽连锁施用(例如参见Joliot etal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)等。或者，可以通过同源重组将核酸导入细胞内并整合入宿主细胞DNA中进行表达。
可以通过标准的临床技术确定在治疗、抑制和预防炎性、免疫或恶性疾病、病症或病况中有效的本公开的抗体量。此外，可以任选地进行体外测定，以帮助确定最佳剂量范围。配方中所使用的精确剂量还取决于给药途径、疾病的严重性、病症或病况的严重性，并应根据从业医生的判断和每个患者的具体情况来确定。有效剂量可以从体外或动物模型测试***得出的剂量反应曲线中推算得出。
在某些方面，提供了治疗有需要的患者的癌症、感染或免疫紊乱的方法，包括向患者施用一个或多个剂量对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中每次给药为约1mg/kg至约10mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约1mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约10mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约3mg/kg。在一些实施方案中，所述对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段包括：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ IDNO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ IDNO:18)；和(d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)所示，但其中至少一个包含一个、两个或三个氨基酸添加、缺失、保守氨基酸替换或它们的组合。
作为一般性建议，向患者施用的本公开的抗原结合多肽的剂量通常为0.1-100mg/kg患者体重，0.1-20mg/kg患者体重，或1-10mg/kg患者体重。
例如，在某些实施方案中，所述剂量为0.1-20mg/kg患者体重，或1-10mg/kg患者体重。在某些实施方案中，所述剂量为约1mg/kg至约2mg/kg，约2mg/kg至约3mg/kg，约3mg/kg至约4mg/kg，约4mg/kg至约5mg/kg，约5mg/kg至约6mg/kg，约6mg/kg至约7mg/kg，约7mg/kg至约8mg/kg，约8mg/kg至约9mg/kg，或约9mg/kg至约10mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约1mg/kg、约3mg/kg或约10mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约3mg/kg。
例如，在某些实施方案中，所述剂量为约0.001mg/kg至约1,000mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量至少为约0.001mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量最高为约1,000mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约0.001mg/kg至约0.01mg/kg，约0.001mg/kg至约0.05mg/kg，约0.001mg/kg至约0.1mg/kg，约0.001mg/kg至约0.5mg/kg，约0.001mg/kg至约1mg/kg，约0.001mg/kg至约5mg/kg，约0.001mg/kg至约10mg/kg，约0.001mg/kg至约50mg/kg，约0.001mg/kg至约100mg/kg，约0.001mg/kg至约500mg/kg，约0.001mg/kg至约1,000mg/kg，约0.01mg/kg至约0.05mg/kg约0.01mg/kg至约0.1mg/kg，约0.01mg/kg至约0.5mg/kg，约0.01mg/kg至约1mg/kg，约0.01mg/kg至约5mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，约0.01mg/kg至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约500mg/kg，约0.01mg/kg至约1,000mg/kg，约0.05mg/kg至约0.1mg/kg，约0.05mg/kg至约0.5mg/kg，约0.05mg/kg至约1mg/kg，约0.05mg/kg约5mg/kg，约0.05mg/kg至约10mg/kg，ab 0.05mg/kg至约50mg/kg，约0.05mg/kg至约100mg/kg，约0.05mg/kg至约500mg/kg，约0.05mg/kg至约1,000mg/kg，约0.1mg/kg至约0.5mg/kg，约0.1mg/kg至约1mg/kg，约0.1mg/kg至约5mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约50mg/kg，约0.1mg/kg至约100mg/kg，约0.1mg/kg至约500mg/kg，约0.1mg/kg至约1,000mg/kg，约0.5mg/kg至约1mg/kg，约0.5mg/kg至约5mg/kg，约0.5mg/kg至约10mg/kg，约0.5mg/kg至约50mg/kg，约0.5mg/kg至约100mg/kg，约0.5mg/kg至约500mg/kg，约0.5mg/kg至约1,000mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg kg，约1mg/kg至约50mg/kg，约1mg/kg至约100mg/kg，约1mg/kg至约500mg/kg，约1mg/kg至约1,000mg/kg，约5mg/kg至约10mg/kg，约5mg/kg至约50mg/kg，约5mg/kg至约100mg/kg，约5mg/kg至约500mg/kg，约5mg/kg至约1,000mg/kg，约10mg/kg至约50mg/kg，约10mg/kg至约100mg/kg，约10mg/kg至约500mg/kg，约10mg/kg至约1,000mg/kg，约50mg/kg至约100mg/kg，约50mg/kg至约500mg/kg，约50mg/kg至约1,000mg/kg kg，约100mg/kg至约500mg/kg，约100mg/kg至约1,000mg/kg，或约500mg/kg至约1,000mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量为约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约500mg/kg或约1,000mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量大于约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约500mg/kg或约1,000mg/kg。
例如，在某些实施方案中，所述剂量为约0.01mg/kg至约100mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量至少为约0.01mg/kg。在某些实施方案中，所述剂量最高为约100mg/kg。在一些实施方案中，所述剂量为约0.01mg/kg至约0.02mg/kg，约0.01mg/kg至约0.05mg/kg，约0.01mg/kg至约0.1mg/kg，约0.01mg/kg至约0.2mg/kg，约0.01mg/kg至约0.5mg/kg，约0.01mg/kg至约1mg/kg，约0.01mg/kg至约2mg/kg，约0.01mg/kg至约5mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，约0.01mg/kg至约100mg/kg，约0.02mg/kg至约0.05mg/kg约0.02mg/kg至约0.1mg/kg，约0.02mg/kg至约0.2mg/kg，约0.02mg/kg至约0.5mg/kg，约0.02mg/kg至约1mg/kg，约0.02至约2mg/kg，约0.02mg/kg至约5mg/kg，约0.02mg/kg至约10mg/kg，约0.02mg/kg至约50mg/kg，约0.02mg/kg至约100mg/kg，约0.05mg/kg至约0.1mg/kg，约0.05mg/kg至约0.2mg/kg，约0.05mg/kg至约0.5mg/kg，约0.05mg/kg约1mg/kg，约0.05mg/kg约2mg/kg，约0.05mg/kg约5mg/kg，约0.05mg/kg至约10mg/kg，约0.05mg/kg至约50mg/kg，约0.05mg/kg至约100mg/kg，约0.1mg/kg至约0.2mg/kg，约0.1mg/kg至约0.5mg/kg，约0.1mg/kg至约1mg/kg，约0.1mg/kg至约2mg/kg，约0.1mg/kg至约5mg/kgkg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约50mg/kg，约0.1mg/kg至约100mg/kg，约0.2mg/kg至约0.5mg/kg，约0.2mg/kg至约1mg/kg，约0.2mg/kg至约2mg/kg，约0.2mg/kg至约5mg/kg，约0.2mg/kg至约10mg/kg，约0.2mg/kg至约50mg/kg，约0.2mg/kg至约100mg/kg，约0.5mg/kg至约1mg/kg，约0.5mg/kg至约2mg/kg，约0.5mg/kg kg至约5mg/kg，约0.5mg/kg至约10mg/kg，约0.5mg/kg至约50mg/kg，约0.5mg/kg至约100mg/kg，约1mg/kg至约2mg/kg，约1mg/kg至约5mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约1mg/kg至约50mg/kg，约1mg/kg至约100mg/kg，约2mg/kg至约5mg/kg，约2mg/kg至约10mg/kg，约2mg/kg至约50mg/kg，约2mg/kg至约100mg/kg，约5mg/kg至约10mg/kg，约5mg/kg至约50mg/kg，约5mg/kg至约100mg/kg，约10mg/kg至约50mg/kg，约10mg/kg至约100mg/kg，或约50mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，所述剂量为约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg或约100mg/kg。在一些实施方案中，所述剂量大于约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约50mg/kg或约100mg/kg。
根据本公开的抗原结合多肽的重量，本公开的抗原结合多肽可以制剂为0.5mg至5000mg，1mg至1000mg，或5mg至100g的单位剂型。
在一些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为约0.1mg至约10,000mg的单位剂型。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为约0.1mg的单位剂型。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为最大剂量约10,000mg的单位剂型。在一些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：约0.1mg至约0.5mg，约0.1mg至约1mg，约0.1mg至约5mg，约0.1mg的单位剂型制剂本公开的抗原结合多肽。约10mg，约0.1mg至约50mg，约0.1mg至约100mg，约0.1mg至约500mg，约0.1mg至约1,000mg，约0.1mg至约5,000mg，约0.1mg至约10,000mg，约0.5mg到约1mg，约0.5mg到约5mg，约0.5mg到约10mg，约0.5mg到约50mg，约0.5mg到约100mg，约0.5mg到约500mg，约0.5mg至约1,000mg，约0.5mg至约5,000mg，约0.5mg至约10,000mg，约1mg至约5mg，约1mg至约10mg，约1mg至约50mg，约1mg至约100mg，约1mg至约1,000mg，约1mg至约5,000mg，约1mg至约10,000mg，约5mg至约10mg，约5mg约50mg，约5mg至约100mg，约5mg至约500mg，约5mg至约1,000mg，约5mg至约5,000mg，约5mg至约10,000mg，约10mg至约50mg，约10mg至约100mg，约10mg至约500mg，约10mg至约1,000mg，约10mg至约5,000mg，约10mg至约10,000mg，约50mg至约100mg，约50mg至约500mg，约50mg mg至约1,000mg，约50mg至约5,000mg，约50mg至约10,000mg，约100mg至约500mg，约100mg至约1,000mg，约100mg至约5,000mg，约100mg约10,000mg，约500mg至约1,000mg，约500mg至约5,000mg，约500mg至约10,000mg，约1,000mg至约5,000mg，约1,000mg至约10,000mg，或约5,000mg至约10,000mg。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约5mg、约10mg、约50mg、约100mg、约500mg、约1,000mg、约5,000mg或约10,000mg。在一些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：大于约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约5mg、约10mg、约50mg、约50mg、约500mg、约1,000mg、约5,000mg或约10,000mg。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：约0.5mg至约5,000mg。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：至少约0.5mg。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：最高约5,000mg。在一些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：约0.5mg至约1mg，约0.5mg至约2mg，约0.5mg至约0.5mg，约0.5mg的单位剂型制剂本公开的抗原结合多肽。约10mg，约0.5mg至约20mg，约0.5mg至约50mg，约0.5mg至约100mg，约0.5mg至约200mg，约0.5mg至约1,000mg，约0.5mg至约2,000mg，约0.5mg至约5,000mg，约1mg至约2mg，约1mg至约5mg，约1mg至约10mg，约1mg至约20mg，约1mg至约50mg，约1mg至约100mg，约1mg至约200mg，约1mg至约1,000mg，约1mg至约2,000mg，约1mg至约5,000mg，约2mg至约5mg，约2mg至约10mg，约2mg至约20mg，约2mg至约50mg，约2mg至约100mg，约2mg至约200mg，约2mg至约1,000mg，约2mg约2,000mg，约2mg至约5,000mg，约5mg至约10mg，约5mg至约20mg，约5mg至约50mg，约5mg至约100mg，约5mg至约200mg，约5mg至约1,000mg，约5mg至约2,000mg，约5mg至约5,000mg，约10mg至约20mg，约10mg至约50mg，约10mg至约100mg，约10mg至约200mg，约10mg至约1,000mg，约10mg至约2,000mg，约10mg至约5,000mg，约20mg至约50mg，约20mg至约100mg，约20mg至约200mg，约20mg至约1,000mg，约20mg至约2,000mg，约20mg至约5,000mg，约50mg至约100mg，约50mg至约200mg，约50mg至约1,000mg，约50mg至约2,000mg，约50mg约5,000mg，约100mg至约200mg，约100mg至约1,000mg，约100mg至约2,000mg，约100mg至约5,000mg，约200mg至约1,000mg，约200mg至约2,000mg mg，约200mg至约5,000mg，约1,000mg至约2,000mg，约1,000mg至约5,000mg，或约2,000mg至约5,000mg。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：约0.5mg、约1mg、约2mg、约5mg、约10mg、约20mg、约50mg、约100mg、约200mg、约1,000mg、约2,000mg或约5,000mg。在某些实施方案中、本公开的抗原结合多肽可制剂为下述的单位剂型：大于约0.5mg、约1mg、约2mg、约5mg、约10mg、约20mg、约50mg、约100mg、约200mg、约1,000mg、约2,000mg或约5,000mg。
可以每天，每两天，每三天，每周两次，每4天，每5天，每6天，每周，每两周，每三周，每个月或更频繁地或不频繁地，或其中两者之间的任何间隔单日施用1次、2次、3次、4次、5次或更多次单位剂型。
通常，由于对异源多肽的免疫反应，在人体内，人抗体半排出期要比其他物种的抗体长。因此，通常可能会降低人抗体的剂量并减少施用的频率。进一步地，可以通过诸如脂化的修饰增加所述抗体的摄取和组织渗透性(例如在脑中)来减少本公开抗体的施用剂量和频率。
治疗传染性或恶性疾病、病况或病症方法，包括施用本公开的抗体、其变体或衍生物，在人体中使用之前针对所需的治疗或预防活性，通常在体外，然后在可接受的动物模型中进行体内测试。合适的动物模型(包括转基因动物)，对本领域技术人员来说是众所周知的。例如，进行体外测定以证明本文所述的抗原结合多肽的治疗效用，包括抗原结合多肽在细胞系或患者组织样本上的治疗效果。所述抗原结合多肽对细胞系和/或组织样本的效果，可以使用本领域技术人员已知的技术来确定，如本文中所公开的分析方法。根据本公开的内容，可以采用体外测定来确定特定抗原结合多肽的施用是否得以显示，包括在体外进行的的细胞培养测定，其中患者的组织样本在培养物中生长，以及接触或施用化合物并观察到该化合物对所述组织样本的效果。
已知各种递送***，可用于施用本公开的抗体或编码其的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微囊、或可表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如，WuandWu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其他载体等一部分的核酸构建体。
诊断方法
在某些肿瘤样本中观察到PD-1的过表达，并且具有PD-1过表达的细胞的患者可能对使用本公开的抗PD-1抗体的治疗有反应。因此，本公开的抗体也可以用于诊断和预后的目的。
可以从患者那里获得优选包括细胞的样本，该患者可为癌症患者或需要诊断的患者。所述细胞是来自患者的肿瘤组织或肿瘤块的、血液样本、尿液样本或任何样本的细胞。在对样本进行可选的预处理后，可以在允许所述抗体与样本中可能存在的PD-1蛋白相互作用的条件下，将样本与本公开的抗体一起孵育。可以使用诸如ELISA的方法，利用抗PD-1抗体来检测样本中PD-1蛋白的存在。
样本中PD-1蛋白的存在(可选以一定的量或浓度)可用于诊断癌症，以表明患者适合用所述抗体治疗，或表明患者对癌症治疗有响应(或无响应)。至于预后方法，可以在某个阶段进行一次、两次或更多次检测(关于启动癌症治疗)以表明治疗的进展。
组合物
本公开还提供了药物组合物。此类组合物包含有效量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物还包括第二抗肿瘤药剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在特定的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指得到联邦或州政府的监管机构批准，或者在美国药典或其他通常被认可的药典中列出可用于动物，更特别地用于人。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可为无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。经静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还考虑了抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；以及用于调整张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。这些组合物可以采用以下形式：溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等。可以将所述组合物与传统粘合剂和诸如甘油三酯的载体一起制剂成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于：E.W.Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences，其通过引用并入本文。这样的组合物将包含治疗有效量的抗原结合多肽(优选为纯化形式)，以及适当量的载体，以便为患者提供适当的施用形式。所述制剂应匹配施用方式。可以将母制剂封闭在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多次给药小瓶中。
在一个实施方案中，所述组合物根据常规程序制剂为适合于经静脉内施用于人的药物组合物。通常，经静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物还可包括增溶剂和局部***如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，将该成分单独地或与单位剂型(例如以干燥的冻干粉末或无水浓缩剂的形式在经过密封的容器，如显示具有活性药剂的量的安瓿瓶或小袋中)混在一起提供，。如果要通过输注来施用所述组合物，则可配以装有无菌药品级水或生理盐水的输注瓶。如果通过注射来施用所述组合物，则可提供一安瓿瓶用于注射的无菌水或生理盐水，以便在给药前将所述成分混合。
本公开的化合物可以制剂为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生而来的那些，以及与阳离子形成的那些盐，如由钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生而来的那些。
实施例
实施例1：针对人PD-1的人单克隆抗体的产生
全长人PD-1cDNA的克隆
用MACS磁珠(MiltenyiBiotec)从人外周血淋巴细胞(PBMC)中分离出人T淋巴细胞。使用RNeasy小提试剂盒(QIAGEN)从人T细胞中提取总RNA，并通过逆转录PCR(SuperScript First-Strand Synthesis System，Invitrogen)获得cDNA。使用正义引物(5'-CTGTCTAGAATGCAGATCCCACAGGCGCC，SEQ ID NO:47)和反义引物(5'-GGATCCTCAGAGGGGCCAAGAGCAGT，SEQ ID NO:48)，通过RT-PCR从人T细胞mRNA生成编码hPD-1的全长cDNA。通过DNA测序验证该序列，并与NCBI数据库(NM-005018.2)进行比较。
建立hPD-1稳定表达细胞系：用Xbal和BamH I消化后，将hPD-1PCR片段克隆到pcDNA3.1(-)载体(Invitrogen)中。然后用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将pcDNA-hPD-1全长质粒转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。通过G418选择稳定表达hPD-1(CHO/hPD-1)的细胞系，并通过流式细胞术进行筛选。
人PD-1Ig融合蛋白的生产：通过PCR从pcDNA-hPD-1的全长扩增包含hPD-1胞外域的hPD-1mIg和hPD-1hIg融合蛋白的cDNA。将用EcoR I和Bgl II消化的PCR片段融合到表达质粒pmIgG的小鼠IgG2a重链或表达质粒phIgG的人IgG1重链的CH2-CH3结构域中(H Donget al.NatMed.1999；5:1365-1369)。培养物上清液中的蛋白质通过A蛋白质琼脂糖柱(HiTrap Protein A HP,GE Healthcare)纯化。通过SDA-PAGE电泳确认纯化的蛋白质。
单克隆抗体的产生：在多处用200μl包含100μg的hPD-1mI(F)融合蛋白和完整弗氏佐剂(CFA)(Sigma-Aldrich)对8-10周龄的雌性Balb/c小鼠进行了皮下免疫(s.c.)。3周后用含有不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma-Aldrich)的50-100μg蛋白对小鼠进行皮下免疫，总共三次。每次免疫后2周，对小鼠取血以进行血清滴度测试。当滴度足够时，通过腹膜内(i.p.)注射在PBS中的60μg蛋白对小鼠加强免疫。通过融合免疫的小鼠脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系(来自ATCC)获得了杂交瘤。通过二氧化碳处死了加强免疫的小鼠，并无菌地收获了脾脏。将整个脾脏分离成单细胞悬液，并用ACK缓冲液溶解红血细胞。将SP2/0-Ag14骨髓瘤和脾细胞按1：1的比例在50ml锥形离心管中混合。离心后，弃去上清液，并用50％聚乙二醇(Roche)进行细胞融合。在HAT选择培养基中培养融合细胞8-10天，然后采用高通量转染和筛选***针对与表达hPD-1的细胞结合来筛选杂交瘤培养物上清液，并通过流式细胞术分析确认阳性克隆。使用限制性稀释技术对阳性杂交瘤进行至少5次亚克隆，以实现完全单克隆的培养。
实施例2：PD-1单克隆抗体的表征
MAb的同种型：使用小鼠免疫球蛋白同种分型试剂盒(BD Biosciences)鉴别了mAb的同种型。已将所有5个PD-1mAb鉴别为IgG1同种型和κ链。
抗hPD-1的结合特异性：使用在表面表达hPD-1(CHO/hPD-1)的CHO细胞通过流式细胞术确定PD-1mAb的特异性。在冰上孵育CHO/hPD-1细胞和抗PD-1mAb。孵育后，将细胞洗涤并进一步与抗mIgG-APC(eBiosciences)孵育。使用FACSVerse(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。数据显示，所有5个hPD-1mAb都高度特异性地结合hPD-1(图1)。为了排除hPD-1mAb与其他蛋白结合的可能性，通过流式细胞术分析，用抗hPD-1mAb对通过CHO细胞转染的hB7-1、hPD-L1、hB7-H3、hB7-H4、hCD137或其他蛋白分子进行了染色。这些细胞也分别用它们各自的阳性抗体染色作为阳性对照。数据表明，抗PD-1mAb未结合这些测试的蛋白(图2)。
物种交叉反应：为了评估抗hPD-1mAb的物种特异性，使用Ficoll(Sigma-Aldrich)从外周血分离食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)(来自广东省蓝岛生物技术公司)。将PBMC悬浮在含10％FCS的RPMI 1640培养基中，并放入预先包被有1μg/ml抗-hCD3的24孔板中。培养细胞两天。首先用抗hPD-1染色细胞。洗涤后，将细胞用抗mIgG-APC和CD3-FITC染色；CD8-PerCP用于流式细胞术分析。此外，使用小鼠PD-1转染的CHO细胞(CHO/mPD-1)通过流式细胞术确定了所述mAb与鼠PD-1的交叉反应性。
数据表明，抗-hPD-1mAb可以与人和食蟹猴T细胞上的PD-1蛋白结合，未发现与小鼠PD-1有交叉结合(图3)。
配体阻断：为检查配体结合的阻断，将100ng的hPD1hIg融合蛋白与指示剂量的mAb(400、300、200、100、50ng/10ul)或对照Ig于4℃孵育30分钟，然后用于染色CHO/hB7-H1细胞。将细胞洗涤，并用山羊抗-hIgG-APC进一步染色。用流式细胞术评估阻断作用。
数据表明，抗hPD-1mAbs 1和2(Ab1和Ab2)对配体阻断没有影响。Ab3、Ab4和Ab5可以剂量依赖性方式阻断hPD-1融合蛋白与hPD-L1的结合(图4)。
竞争性结合测定：进行竞争性结合测定，以研究这些mAb识别hPD-1蛋白的相同或不同结合位点。将CHO/hPD-1细胞分别与过量(10μg)的5种PD-1mAb于4℃预孵育30分钟。洗涤后，将细胞和50ng不同生物素标记的mAb于4℃孵育20分钟。使用流式细胞术分析测量mAb的结合效果。
流式细胞术分析显示，Ab4和Ab5完全废除了彼此与hPD-1蛋白的结合，饱和剂量的Ab3对Ab4和Ab5结合有部分阻断效果，而Ab1和Ab2对Ab4和Ab5与hPD-1的结合没有阻断效果(图5)。因此，PD-1上与Ab4和Ab5结合的位点可能会重叠。Ab1或Ab2以及Ab4或Ab5通过不同的界面结合到PD-1，并且也通过配体阻断测试进行了验证。
实施例3：产生抗PD-1抗体的杂交瘤的测序和抗体的人源化
产生抗PD-1抗体的杂交瘤的测序：收获1×107个杂交瘤细胞，并用PBS洗涤。使用RAeasy小提试剂盒(Qiagen)从杂交瘤中提取mRNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成了RACE-Ready第一链cDNA。逆转录后，以准备好的cDNA为模板并通过试剂盒提供的5'通用引物(UPM)和3'基因特异性引物(GSP1)进行了5'RACE PCR反应，这些引物是根据小鼠IgG1重链可变区和κ轻链基因序列设计的。通过凝胶电泳分析确定RACE产物(图6)。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆到T载体中。转化后，通过测序分析来验证质粒。通过使用VBASE2(http://www.vbase2.org)来分析抗体基因片段。(表2)中公开了这些序列。
表2：小鼠抗体序列
Figure BDA0002900261730000521
Figure BDA0002900261730000531
重组抗体的蛋白表达和功能测定：为确保重组抗体序列的正确性，将重组抗体重链和轻链的全长序列分别克隆到pcDNA3.1载体，并瞬时转染HEK293T细胞。用蛋白G琼脂糖柱(GE Healthcare)纯化细胞培养物上清液中的蛋白，以进行功能评估。
细胞计数分析数据表明，重组抗体可以结合hPD-1蛋白，并可阻止hPD-1融合蛋白结合至PD-L1蛋白(图7中的图A、B)。
抗人PD-1抗体的人源化：基于抗hPD-1杂交瘤的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列进行人源化。通常，首先构建由亲本小鼠VH和VL序列以及人IgG4-S228P恒定区和人κ链组成的小鼠-人嵌合mAb。鉴别嵌合抗体的特征后，设计并使用了三个VL和三个VL人源化序列以制备9个人源化抗体。(表3A和3B)中列出了这些序列。
表3A：嵌合抗体(人IgG4-S228P骨架)
Figure BDA0002900261730000532
Figure BDA0002900261730000541
表3B：人源化的重链和轻链可变区
Figure BDA0002900261730000542
Figure BDA0002900261730000551
表3C：各种CDR定义下的示例性抗PD-1CDR
Figure BDA0002900261730000552
Figure BDA0002900261730000561
实施例4：人源化抗体的特性和功能
人源化抗体的结合活性：将CHO/hPD-1细胞与经系列稀释的mAb一起孵育。使用流式细胞术分析评估了9种人源化抗体与PD-1蛋白的结合效果，并与嵌合亲本抗体进行了比较。
流式细胞术分析结果表明，某些突变组合的结合活性高于亲本抗体；一些与亲本抗体相同或略低于亲本抗体(图8)。以下表4中列出了突变组合。
Figure BDA0002900261730000562
Figure BDA0002900261730000571
人源化抗体的阻断能力：测量了人源化抗体阻断hPD-1与hPD-L1结合的能力。将100ng的hPD1mIg与不同剂量的人源化抗体在10μl PBS中于4℃预孵育30分钟，然后用于染色CHO/hB7-H1细胞。将细胞洗涤，并用山羊抗mIgG-APC进一步染色。用流式细胞术评估阻断作用。使用相似的方法，测量了人源化抗体阻断hPD-1与hPD-L2结合的能力。
结果表明，所有人源化抗体均以剂量依赖性方式抑制了hPD-1mIg与CHO/hPD-L1细胞的结合。某些突变组合具有比嵌合亲本抗体更高的阻断能力(图9)。结果还显示，hPD-1mIg与CHO/hPD-L2细胞的结合也被阻断(图10A和图10B)。
人源化抗体的结合亲和力和动力学测定：通过Biacore T100(GE HealthcareLife Science)评估了人源化PD-1mAb与hPD-1蛋白相互作用的结合亲和力和动力学。通过胺偶联将hPD-1mIg蛋白固定在传感器芯片CM5上。将已过滤的人源化抗体用HBS-EP缓冲液pH7.4(GE Healthcare Life Science)稀释，然后注射在固定有hPD-1mIg的表面上。每个样品都测试了9种不同的浓度。可以通过完整的动力学分析来确定详细的结合动力学参数(缔合速率Ka，解离速率Kd和亲和常数KD)。
分析数据显示，突变组合与嵌合亲本抗体之间的结合率(Ka)没有显著差异。三种突变体组合(3、6、9)的解离速率(Kd)接近于嵌合亲本抗体。所有的人源化抗体都具有很强的亲和力，其KD值在低纳摩尔范围(10-10M)。两个突变组合(3，6)的KD值接近于嵌合亲本抗体(9.89×10-11M)(表4)。
表4：人源化抗体的结合亲和力和动力学测定
Figure BDA0002900261730000572
Figure BDA0002900261730000581
抗PD-1对同种异体CD8+CTL体外杀死PD-L1阳性肿瘤细胞的增强作用：基于抗PD-1抗体的抗肿瘤机制，本实施例设计了体外模型以确定抗PD-1抗体对通过人的同种异体CD8+细胞毒性淋巴细胞(同种异体CD8+CTL)杀死肿瘤细胞的增强作用。首先，从人PBMC中分离出CD8+淋巴细胞，并与经辐照的人黑素瘤细胞转染的hB7-1细胞(624Mel/B7-1)进行培养，以产生同种异体CD8+细胞CTL。然后在人源化抗体或对照Ig存在下，将同种异体CD8+CTL细胞与过夜培养的624Mel/hPD-L1肿瘤细胞在96孔板中共培养5天。平板孔中的细胞用0.5％结晶紫染色，并用ELISA读取器在540nm处读取。根据肿瘤细胞的存活率计算杀伤活性。
Figure BDA0002900261730000582
结果表明，某些突变组合可以增强同种异体CTL细胞体外杀灭肿瘤细胞的能力(图11)。
选择最佳的突变组合集(变体3)，然后将蛋白的编码序列克隆到合适的表达载体并转移到CHO细胞中，以产生也称为TY101的抗hPD-1抗体。
实施例5：在癌症免疫疗法中TY101的表征
PBMC中细胞因子增强的混合淋巴细胞反应(MRL)。使用Ficoll-Hypaque通过密度梯度离心分离健康个体的人外周血单个核细胞(PBMC)。用40Gy剂量的X射线对来自健康供体1的PBMC进行辐照，作为刺激细胞。使用人PanT细胞分离试剂盒(MiltenylBiotec)从健康供体2分离T淋巴细胞，作为应答细胞。将应答细胞和刺激细胞重悬于含10％FCS的完全RPMI培养基中，并在系列稀释的TY101或hIgG对照存在下，于96孔板的每孔中分别接种2.5×105个应答细胞和1.25×105个刺激细胞(R/S＝2)。将细胞在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃培养5天。在第5天，通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(Dojindo Molecular Technology，Inc.)评估了T细胞的增殖活性。为了检测细胞因子，在第3天和第5天收集培养物上清液。使用人Th1/Th2/Th17细胞计量珠阵列试剂盒(CBA；BD Biosciences)进行细胞因子分析。
结果表明，T细胞对TY101的增殖反应与hIgG相似(图12)。值得注意的是，与hIgG相比，在施用TY101的MLR的培养物上清液中细胞因子IL-2和IFNγ的产生显著增加了(图13)。
阻断PD-1在T淋巴细胞上的表达。PD-L1在肿瘤细胞中的表达可以诱导PD-1在肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的表达，并触发PD-1依赖性免疫抑制。本实施例设计了体外模型以确定TY101是否可以在用hPD-L1转染的肿瘤细胞培养时抑制hPD-1在人淋巴细胞上的表达。将从人PBMC中分离的人T淋巴细胞与人黑素瘤转染的hPD-L1(624/hPD-L1)细胞一起，在10μg/ml的TY101或对照IgG存在下培养4天。通过流式细胞术检测到hPD-1在淋巴细胞上的表达。
结果表明，与仅培养基和hIgG对照相比，添加TY101完全抑制了PD-1在淋巴细胞上的表达(图14)。
人源化PD-1抗体的体内抗肿瘤活性：研究了TY101的体内抗肿瘤作用。将8周龄雌性人PD-1敲入小鼠(购自上海南方模式生物科技有限公司)右侧，在第0天皮下(s.c)植入经MC38转染的hPD-L1(MC38/hPD-L)肿瘤细胞(1×106/小鼠)。在第6天、第9天和第13天通过腹腔(i.p.)注射施用TY101或对照Ig(10mg/kg)。监测肿瘤的大小和存活率。
所有动物最初都可检测到肿瘤(至第6天，4-5mm)。但是，用TY101对MC38/hPD-L1肿瘤荷瘤小鼠进行治疗后，在100％的小鼠中发生了完全响应。到第25天，用TY101治疗的所有5只小鼠的肿瘤均已完全消退。相比之下，经对照IgG治疗的5只小鼠中的两只产生逐渐生长的肿瘤。在另外三只对照IgG治疗的小鼠中，尽管在第32天肿瘤也已消退，但两只小鼠很快又复发了肿瘤(图15)。结果表明TY101可以增强体内抗肿瘤功效。
实施例6：TY101与市售PD-1抗体的功能比较
本实施例选择了目前被批准用于癌症患者临床治疗的两种抗hPD-1抗体，用于与TY101进行比较：默克公司的Keytruda(派姆单抗)和百时美施贵宝(Pristol-MyersSquibbab)的Opdivo(纳武单抗)。
抗体的结合亲和力和动力学：使用Biacore T200仪器(GE Healthcare LifeScience)分析了TY101的亲和力和动力学，并与两种市售抗体进行了比较。将hPD-1mIg蛋白以低浓度(33RU)固定在传感器芯片CM5上，将抗体作为分析物(流动相)以检测相互作用。数据显示，三种抗体的结合率Ka没有显著差异。TY101略低于市售抗体。TY101的解离速率Kd比两种市售抗体要低10倍，而TY101的亲和力KD比市售抗体要强4-7倍。结果表明，TY101显示出更强的结合(图16)。
PD-1/PD-L1阻断中PD-1抗体的比较：使用PD-1/PD-L1阻断生物测定试剂盒(Promega)测定了PD-1/PD-L1阻断生物测定。在不透明的96孔TC板中，于TY101、派姆单抗、纳武单抗或阴性对照hIgG4的系列稀释溶液(0-30μg/ml)存在下，以隔夜培养的CHO-PD-L1细胞(以5×104细胞/孔开始培养)刺激1×105细胞/孔的Jurkat-PD1细胞。孵育5小时后，通过在SpectraMAX L光度计上用ONE-Glo底物(Promega)测定萤光素酶活性来检测Jurkat-PD-1细胞的激活。
分析数据显示，TY101和两种市售抗体可以阻断PD-1/PD-L1通路。TY101的阻断作用类似于派姆单抗，并且优于纳武单抗(图17)。
对体外肿瘤细胞生长抑制作用的比较：如前所述，在不同mAb和对照IgG存在下，将同种异体CD8+CTL细胞与过夜培养的624Mel/PD-L1肿瘤细胞在96孔板内一起培养5天。将细胞用0.5％结晶紫染色，并用ELISA读取器在540nm处读取平板。根据肿瘤细胞的存活率计算杀伤活性。
结果显示，所有三种抗PD-1mAb均可增强同种异体CD8+CTL的肿瘤杀伤能力。TY101的增强效果高于两种市售抗体的增强效果(图18)。
实施例7：针对TY101的克隆的开发及其活性
将TY101的序列克隆到专有的表达载体和经转染的CHO细胞中。通过使用ClonePix和/或有限稀释法建立单克隆细胞系。建立了多个克隆，并表征了由3个这样的克隆(TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1)产生的抗体。
测试抗体与hPD-1或mPD-1蛋白的结合(ELISA)
通过ELISA测试了与hPD-1的抗体结合和与mPD-1蛋白的交叉反应性。向预包被有1μg/ml hPD-1或mPD-1的ELISA板上添加测试抗体的系列稀释溶液。然后加入缀合有HRP的山羊抗人IgG或山羊抗小鼠IgG抗体，然后加入底物四甲基联苯胺(TMB)，并用SpectraMaxPlus 384nm酶标仪(Molecular Device,LLC.,Sunnyvale,CA)在450nm波长进行定量。测试为TY101克隆的TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1显示出与hPD-1蛋白具有良好的结合，EC50为0.01-0.15nM。所述抗体未表现出与mPD-1蛋白的结合(图19)。
测试抗体与表达hPD-1和cPD-1的CHOK1细胞的结合(流式细胞术)
使用表达hPD-1或cPD-1的CHOK1细胞，通过流式细胞术测试了抗体与hPD-1的结合以及与食蟹猴PD-1(cPD-1)的交叉反应性。将CHOK1-hPD-1、CHOK1-cPD-1和CHOK1空白细胞，与测试物的系列稀释溶液一起孵育，然后与缀合有Alexa
Figure BDA0002900261730000611
488的山羊抗人IgG(H+L)抗体一起孵育，并使用FACSCanto II(BD Biosciences,San Jose,CA)进行分析。测试为TY101克隆的TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1显示出与具有次纳摩尔EC50的CHOK1-hPD-1和具有个位数纳摩尔EC50的CHOK1-cPD-1细胞有良好的结合(图20)。
测试抗体对hPD-1/hPD-L1或hPD-1/hPD-L2结合的阻断活性(流式细胞术)
进一步测试了这些抗体阻断hPD-1/hPD-L1以及hPD-1/hPD-L2的结合的能力，这对于癌症患者治疗的潜在有效性至关重要。将CHOK1-hPD-1细胞与混合有生物素-hPD-L1或生物素-hPD-L2的测试样品的系列稀释溶液一起孵育。然后将细胞与标记有Alexa 488的链霉亲和素一起孵育，并使用FACSCanto II进行分析。抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1阻断了hPD-L1与表达hPD-1的CHOK1细胞的结合，其IC50为1.15-1.47nM。它们还阻断了hPD-L2与表达hPD-1的CHOK1细胞的结合，其IC50为1.52-2.33nM(图21)。
人混合白细胞反应(MLR)测定法测试抗体对T细胞的作用
采用从2个供体分离出的T细胞，在人MLR测定法中测试了这些抗体对T细胞功能的影响。粘附的PBMC(主要是单核细胞；从供体1分离，并接种在细胞培养皿中以允许粘附)在100ng/mL重组人(rh)GM-CSF和50ng/mL的rhIL-4存在下培养5天，其中3天后更新半量的培养基，并在第6天添加1μg/mL的LPS。在第7天，收获所得的细胞(主要是成熟的DC)，并用丝裂霉素C处理。通过EasySepTM人T细胞分离试剂盒(反向选择,STEMCELLTechnologies)，从供体2和3中分离出CD3+T细胞。将DC和T细胞在3种浓度(5、0.5、0.05μg/ml)的测试抗体存在下共培养5天。在3天后收集上清液以确定IL-2水平，并在5天后(100μL)确定IFN-γ水平。与同型对照hIgG4相比，抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1以剂量依赖性方式促进了来自两个供体的细胞分泌IL-2和IFN-γ(图22)。
工程化的肿瘤细胞-人T细胞共培养测定法测试抗体对T细胞的作用
还使用从4个不同供体分离的T细胞，在工程化的肿瘤细胞-人类T细胞共培养测定法中测试了这些抗体对T细胞功能的影响。通过EasySepTM人T细胞分离试剂盒从4个供体的PBMC中分离出CD3+T细胞。工程化的肿瘤细胞Hep3B-OS8-hPDL1，其为工程化的Hep3B细胞(KCLB，产品目录号：88064)以稳定地表达OS8(抗CD3单链可变片段(scFv))以及hPD-L1，用丝裂霉素C处理，并在3种浓度(5、0.5、0.05μg/ml)的测试抗体存在下与CD3+T细胞共培养3天，并收集培养物上清液以确定IFN-γ水平。与同型对照hIgG4相比，抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1以剂量依赖性的方式促进了来自所有4个供体的细胞分泌IFN-γ(图23)。
实施例8：与FDA批准的抗hPD-1抗体相比，TY101克隆显示出更好的结合亲和力
竞争性ELISA检测抗体表位重叠
在竞争性ELISA测定中，测试了这些抗体是否与FDA批准的抗PD-1抗体纳武单抗或派姆单抗结合在相同的表位上。将竞争性抗体和生物素-hPD-1的系列稀释溶液添加到预先包被有1μg/ml测试抗体的ELISA板中。然后加入缀合有HRP的链霉亲和素素，接着加入底物TMB，并使用SpectraMax Plus 384酶标仪在450nm波长处进行定量。抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1几乎完全阻断了各自与hPD-1的结合，表明它们共享相似的表位。这3种抗体也几乎完全阻断了纳武单抗和派姆单抗与hPD-1的结合(93％至94％)，而纳武单抗和派姆单抗仅部分阻止了这些抗体与hPD-1的结合(纳武单抗的77％-78％，派姆单抗的46％-49％)。这些数据表明，TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1抗体结合到与纳武单抗和派姆单抗不同的表位，并且它们对hPD-1的亲和力可能高于纳武单抗和派姆单抗。
通过SPR确定测试抗体与hPD-1的结合亲和力
为了准确测量对hPD-1的结合亲和力，通过SPR对抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1以及纳武单抗和派姆单抗进行分析。将人PD-1ECD蛋白经不同的时长在CM5传感器芯片上固定化，以实现流通池3中的低固定化水平(60RU)和流通池4中的高固定化水平(960RU)。将系列稀释的抗体(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25和50nM)注入流通池中。缔合时间为180s，解离时间为600s(针对纳武单抗和派姆单抗)或1500s(针对TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1)。在从样品中减去参比(流通池1)和零浓度的信号后，使用Biacore T200评估软件版本1.0和曲线拟合的1：1结合模型计算结合动力学。对照人IgG4与hPD-1没有结合。基于hPD-1的低固定化水平(～60RU；表3；图23)中的数据，抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1与人PD-1的缔合率比纳武单抗和派姆单抗的缔合率略低(低了2-4倍)。这3种抗体与人PD-1的解离速率比纳武单抗和派姆单抗的解离速率慢12-30倍，使得其亲和力要比纳武单抗和派姆单抗的亲和力高4-8倍(较低的KD对应更好的亲和力，以及反过来；表3)。还在hPD-1的高固定化水平下测试了抗hPD-1抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1对hPD-1的结合亲和力。抗体TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1表现出非常缓慢的解离速率，即使在解离时间1500s之后也仅观察到极小解离(图23)。这些数据表明，TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1的结合亲和力要高于纳武单抗和派姆单抗，主要是由于解离速率慢(图25)。
实施例9：研究食蟹猕猴中TY101的给药剂量和药代动力学。
为评估TY101的药代动力学，将总共18只食蟹猴分为3组，3只/性别/组。TY101分别以1、3、10mg/kg的剂量通过静脉内输注进行注射。每次给药都通过右后肢使用注射泵施用。输注速率为30mL/kg/h。给药体积为10mL/kg。采用验证ELISA方法来定量动物血浆中的TY101。在组1-3中，给药前、刚完成输注后(±1min)以及开始输注后2、6、24(D2)、48(D3)、72(D4)、96(D5)、120(D6)、168(D8)、240(D11)、336(D15)、408(D18)、504(D22)、576(D25)和672(D29)小时，从每只猴子的左后肢皮下静脉收集约1mL的血样和EDTA-K2抗凝剂一起用于药代动力学分析。将血样用于制备血浆以进行药代动力学分析。
下表显示了TY101的药代动力学(PK)参数：
Figure BDA0002900261730000641
Cmax比率＝中等剂量或高剂量时均值Cmax/低剂量时均值Cmax
曲线下面积(AUC)比率＝中等剂量或高剂量时均值AUC(0-672h)/低剂量时均值AUC(0-672h)
以1、3和10mg/kg单次静脉输注后，食蟹猴中TY101基本上呈现线性动态特征。均值Cmax和AUC(0-672h)值通常随着1-10mg/kg的剂量按比例增加。在单次静脉输注后，随着1-10mg/kg的剂量TY101的药代动力学特征没有观察到明显的性别差异。
在类似条件下，我们还比较了TY101和
Figure BDA0002900261730000643
(Bristol-Myers Squibb)在3mg/kg时的PK特性。数据汇总在下表中。
下表中汇总了数据。
Figure BDA0002900261730000642
Cmax比率＝TY101的均值Cmax/
Figure BDA0002900261730000651
的均值Cmax。
AUC比率＝TY101的均值AUC(0-672h)/
Figure BDA0002900261730000652
的均值AUC(0-672h)。
TY101和
Figure BDA0002900261730000653
在3mg/kg时显示出相当的PK特性。
***
本公开的范围不受所描述的特定实施方案的限制，这些特定实施方案仅是对本公开各个方面的举例说明，以及在功能上等效的任何组合物或方法均在本公开的范围内。对于本领域熟练技术人员来说，显然是可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变型，而不背离本公开的精神或范围。因此，本公开旨在涵盖本公开提供的修改和变型，并且它们落入所附权利要求及其等同物的范围。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同分别对每个出版物或专利申请特别和单独地表明其通过引用并入本文。
序列表
<110> 大有华夏生物医药集团有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其剂量和用途
<130> PD01291A
<141> 2021-01-15
<150> PCT/CN2018/096206
<151> 2018-07-19
<160> 67
<170> FastSEQ Windows版本4.0
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<400> 19
Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Lys Ala Asn Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
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tcccaggtcc agctgcagca gtctggggct gaactggcaa gacctggggc ctcagtgaag 60
atgtcctgca aggcttctgg ctacaccttt actagttaca cgatgcactg ggtaaaacag 120
aggcctggac agggtctgga atggattgga tacattaatc ctactactgg ttatactaat 180
tacaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 240
tacatgcaat tgagcagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagagat 300
gatgcttact actcgggcta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
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aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 300
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ile Thr Ile Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
50 55 60
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Arg Tyr Asp Tyr Phe Ala Met Asp
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Glu
1 5 10 15
His Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Asn Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Phe Met Asn Trp Phe Gln His Lys Pro Ala Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Val Ser Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Ser Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagagca cagggccacc 60
atctcctgcc aagccagcga aaatgttgat aattatggca ttaattttat gaactggttc 120
caacacaaac cagcacagcc accccaactc ctcatctatg tttcatccaa cctaggatcc 180
ggggtccctg ccaagtttag tggcagtggg tctggaacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggaag aagatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga cgttccgtgg 300
acgttcagtg gaggcaccaa actggaaatc aaacgg 336
<210> 27
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
gaagtgaagt tggtggagtc tgggggaggt ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttggat tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtcatg gtggtggtga cacctactat 180
ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagggaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacatagt 300
ggttacgaga ggggatatta ctatgttatg gattactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
gacattgtgc tgacccaatt tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat tactatggct ttagttttat aaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccagggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttgg tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 336
<210> 31
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 32
<211> 1357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
cgaagtgaag ttggtggagt ctgggggagg tttagtgcag cctggagggt ccctgaaact 60
ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tagctatacc atgtcttgga ttcgccagac 120
tccagagaag aggctggagt gggtcgcata cattagtcat ggtggtggtg acacctacta 180
tccagacact gtaaagggcc gattcaccat ctccagggac aatgccaaga acaccctgta 240
cctgcaaatg agcagtctga agtctgagga cacggccatg tattactgtg caagacatag 300
tggttacgag aggggatatt actatgttat ggattactgg ggtcaaggaa cctcagtcac 360
cgtctcctca gctagcacca agggccccag cgtgtttcct ctcgctccct gcagccggag 420
cacatccgag agcaccgctg ctctgggctg tctcgtgaag gactacttcc ctgaacccgt 480
caccgtcagc tggaatagcg gcgccctgac atccggcgtc cacacattcc ccgctgtcct 540
gcagagcagc ggcctgtaca gcctgagctc cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg 600
aacaaagacc tacacctgca acgtggacca taagccctcc aacaccaagg tggacaagcg 660
ggtggaatcc aagtatggac ccccctgtcc tccttgccct gctcctgaat ttctcggagg 720
cccctccgtc ttcctgtttc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacacc 780
cgaagtcacc tgcgtcgtgg tggatgtcag ccaggaagat cccgaggtgc agttcaactg 840
gtacgtggac ggagtggagg tgcataacgc caaaaccaag cccagggaag agcagttcaa 900
cagcacctat cgggtcgtgt ccgtgctcac cgtcctgcat caggattggc tcaacggcaa 960
ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc tccatcgaga agaccatctc 1020
caaggctaag ggccaacctc gggagcccca agtgtatacc ctccctccca gccaggagga 1080
gatgaccaag aatcaagtga gcctgacctg cctcgtgaag ggattttacc cctccgacat 1140
cgctgtggaa tgggaaagca atggccaacc tgagaacaac tacaagacca caccccccgt 1200
gctggactcc gatggctcct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca aatcccggtg 1260
gcaagaggga aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gctctccaca accactacac 1320
ccagaagagc ctctccctga gcctcggcaa gtagtaa 1357
<210> 33
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Thr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 34
<211> 661
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
agacattgtg ctgacccaat ttccaacttc tttggctgtg tctctagggc agagggccac 60
catctcctgc agagccagcg aaagtgttga ttactatggc tttagtttta taaactggtt 120
ccaacagaaa ccaggacagc cacccaaact cctcatctat gctgcatcca accagggatc 180
cggggtccct gccaggtttg gtggcagtgg gtctgggaca gacttcagcc tcaacatcca 240
tcctatggag gaggatgata ctgcaatgta tttctgtcag caaagtaagg aggttccgtg 300
gacgttcggt ggaggcacca agctggaaat caagcggacc gtggccgccc ccagcgtgtt 360
catcttccct cccagcgacg agcagctgaa gtctggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct 420
gaacaacttc tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag 480
cggcaacagc caggagagcg tgaccgagca acaggactcc aaggacagca cctacagcct 540
gaccagcacc ctgaccctga gcaaggccga ctacgagaag cacaaggtgt acgcctgcga 600
ggtgacccac cagggactgt ctagccccgt gaccaagagc ttcaaccggg gcgagtgcta 660
a 661
<210> 35
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 36
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
cgaagtgcag ctggtggaat ctggcggcgg actggtgcag cctggcggat ctctgagact 60
gtcttgtgcc gcctccggct tcaccttctc cagctacacc atgtcctggg tgcgacaggc 120
tcctggcaag ggcctggaat gggtgtccta catctctcac ggcggaggcg acacctacta 180
cgccgactct gtgaagggcc ggttcaccat ctcccgggac aactccaaga acaccctgta 240
cctgcagatg aactccctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgtg ctcggcactc 300
tggctacgag cggggctact actacgtgat ggactactgg ggccagggca ccctcgtgac 360
cgtgtcatct gct 373
<210> 37
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
cgaagtgcag ctggtggaat ctggcggcgg actggtgcag cctggcggat ctctgagact 60
gtcttgtgcc gcctccggct tcaccttctc cagctacacc atgtcctggg tgcgacaggc 120
tcctggcaag ggcctggaat gggtgtccta catctctcac ggcggaggcg acacctacta 180
ccccgactct gtgaagggcc ggttcaccat ctcccgggac aactccaaga acaccctgta 240
cctgcagatg aactccctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgtg ctcggcactc 300
tggctacgag cggggctact actacgtgat ggactactgg ggccagggca ccctcgtgac 360
cgtgtcatct gct 373
<210> 39
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Gly Gly Asp Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala
145
<210> 40
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
gaagtgaagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacacca tgtcctgggt gcgacaggct 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atctctcacg gcggaggcga cacctactac 180
cccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc tcggcactct 300
ggctacgagc ggggctacta ctacgtgatg gactactggg gcaagggcac caccgtgacc 360
gtgtcatctg ct 372
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 42
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
agacatcgtg atgacccagt cccccgactc cctggctgtg tctctgggcg agagagccac 60
catcaactgc aagtcctccg agtccgtgga ctactacggc ttctccttcc tgaactggtt 120
ccagcagaag cccggccagc cccctaagct gctgatctac gccgcctcca accgcgagtc 180
tggcgtgccc gatagattct ccggctctgg ctctggcacc gactttaccc tgaccatcag 240
ctccctgcag gccgaggatg tggccgtgta ctactgccag cagtccaaag aggtgccctg 300
gaccttcggc cagggcacaa agctggaaat caagcgg 337
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 44
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
agacatcgtg atgacccagt cccccgactc cctggctgtg tctctgggcg agagagccac 60
catcaactgc aaggcctccg agtccgtgga ctactacggc ttctccttcc tgaactggtt 120
ccagcagaag cccggccagc cccctaagct gctgatctac gccgcctcca accgcgagtc 180
tggcgtgccc gatagattct ccggctctgg ctctggcacc gactttaccc tgaccatcag 240
ctccctgcag gccgaggatg tggccgtgta ctactgccag cagtccaaag aggtgccctg 300
gaccttcggc cagggcacaa agctggaaat caagcgg 337
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 46
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
gacatccagc tgacccagtc ccccgactcc ctgtctgtgt ctctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca aggcctccga gtccgtggac tactacggct tctccttcct gaactggttc 120
cagcagaagc ccggccagcc ccctaagctg ctgatctacg ccgcctccaa ccgccagtct 180
ggcgtgcccg atagattctc cggctctggc tctggcaccg actttaccct gaccatcagc 240
tccctgcagg ccgaggatgt ggccgtgtac ttctgccagc agtccaaaga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggcacaaa gctggaaatc aagcgg 336
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
ctgtctagaa tgcagatccc acaggcgcc 29
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
ggatcctcag aggggccaag agcagt 26
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Phe Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Phe Ser Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Ala Ala Ser Asn Arg Gln Ser
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Ser His Gly Gly Gly Asp
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Trp Val Ser Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Asp Tyr Tyr Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gln
1 5 10

Claims (21)

1.治疗有需要的患者的癌症、感染或免疫紊乱的方法，包括以一次或多次给药向患者施用对人细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)具有特异性的分离的抗体或其片段，其中每次给药为约1mg/kg至约10mg/kg。
2.根据权利要求1所述的方法，其中每次给药为约1mg/kg、约3mg/kg或约10mg/kg。
3.根据权利要求2所述的方法，其中每次给药为3mg/kg。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：
(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ IDNO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；
(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；和
(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ IDNO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO:18)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体或其片段还具有重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或它们的组合。
6.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述抗体或其片段包含轻链恒定区，且其中轻链恒定区是κ或λ链恒定区。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同种型。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体或其片段是人源化抗体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID：39的氨基酸序列，或者与SEQID NO:35、SEQ ID ID NO：37或SEQ ID NO:39具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:41、SEQ ID ID NO：43或SEQ ID NO:45具有至少有95％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包含：含有重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，以及含有轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组：
(a)HCDR1:GFTFSSYT(SEQ ID NO:1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO:2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO:3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO:4)，LCDR2：AAS(SEQ IDNO:5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO:6)；
(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO:7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO:8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO:9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO:10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO:11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO:12)；
(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO:13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO:14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO:15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO:16)，LCDR2：VSS(SEQ IDNO:17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO:18)；和
(d)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)所示，但其中至少一个包含一个、两个或三个氨基酸添加、缺失、保守氨基酸替换或它们的组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中一个包括保守氨基酸替换。
15.根据权利要求13所述的方法，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中两个每个都包括保守氨基酸替换。
16.根据权利要求13所述的方法，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中任一个所示，但其中三个每个都包括保守氨基酸替换。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症，且其中所述癌症选自下组：膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、***癌、甲状腺癌。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗感染，且其中所述感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗免疫紊乱，且其中所述免疫紊乱选自下组：感染、与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、***性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、免疫介导的中枢和周围神经***炎性病症、多发性硬化、狼疮和格林-巴利综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫斯病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、胰腺炎、创伤、移植物抗宿主病、移植排斥、缺血性疾病、心肌梗塞、动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少以及与缺乏母胎耐受相关的***症。
20.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗感染，且其中所述感染为肝炎。
21.根据权利要求21所述的方法，其中所述感染选自下组：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。
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