CN112415206A - 外泌体中的cd171蛋白作为肿瘤转移诊断标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学诊断学领域,具体而言,涉及一种外泌体中的CD171蛋白作为肿瘤转移诊断标志物的应用。本发明提供了一种用于预测肿瘤转移及其转移部位的方法。本发明具体涉及的外泌体中CD171蛋白可作为肿瘤转移预测的标志物,针对于组织特异性来源外泌体中的CD171蛋白的检测可用于预测肿瘤转移部位。本发明提供的方法不仅可应用于肿瘤转移的预测,也对肿瘤预后评估以及肿瘤治疗方案的选择提供重要参考。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断学领域,具体而言,涉及一种外泌体中的CD171蛋白作为肿瘤转移诊断标志物的应用。
背景技术
肿瘤的发生是一个多因素、多阶段的演进过程。近年来研究发现,CD171在癌症中的表达水平与转移能力呈现正相关,CD171蛋白能增加肿瘤细胞的迁移。缺乏CD171的转移肿瘤细胞是可以透过血液循环到达并钻出毛细血管,但却失去了沿着血管外壁移动和长成肿瘤的能力。正常的癌细胞沿着毛细血管运动,并可以挤开沿途的血管周细胞,但是敲除CD171后,癌细胞则挤不动拦路周细胞;相反,在一种低表达CD171的癌细胞中,过表达CD171增加了癌细胞沿血管网迁移的能力。CD171蛋白是肿瘤种植的关键。
本领域迫切需要可以进行有效的肿瘤转移的预测,肿瘤预后评估以及肿瘤治疗方案的选择的方法。
发明内容
本发明涉及检测剂在制备试剂盒中的应用;
所述检测剂包括外泌体中的CD171蛋白的定量检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种;
所述外泌体来自生物样品中的组织特异性外泌体;
所述组织特异性外泌体选自肠组织特异性外泌体、胃组织特异性外泌体、肝组织特异性外泌体、肺组织特异性外泌体、淋巴组织特异性外泌体中的至少一种。
可选的,如上所述的应用,所述检测剂中还含有选自如下组织特异性标志物的定性检测剂中的至少一种:
肠组织特异性标志物MS4A12、胃组织特异性标志物SLC9A4、肝组织特异性标志物SLCO1B3、肺组织特异性标志物AGER以及淋巴组织特异性标志物CD8A。
可选的,如上所述的应用,所述检测剂用于执行如下任一种方法:
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
可选的,如上所述的应用,所述检测剂为针对待检测物的特异性抗体。
可选的,如上所述的应用,所述生物样品选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、***、***分泌物、黏液、唾液、痰以及从生物组织样品得到的澄清的裂解液中的至少一种。
本发明还设计试剂盒,所述试剂盒含有外泌体富集纯化试剂以及如上所定义的检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种。
可选的,如上所述的试剂盒,还含有固相载体、蛋白酶抑制剂、封闭液、显色剂以及洗涤缓冲液中的至少一种。
可选的,如上所述的试剂盒,所述固相载体为化学发光板。
本发明还涉及一种***,其包括信息获取模块和数据分析报告模块;
所述信息获取模块的作用包括:获取外泌体中的CD171蛋白的浓度,并将结果提供给所述数据分析模块;
数据分析报告模块的作用包括:判断所述浓度是否≥150pg/mL,若为是,则输出发生肿瘤转移风险高;若为否,则输出发生肿瘤转移风险低。
本发明的有益效果为:
本发明提供了一种用于预测肿瘤转移及其转移部位的方法。本发明具体涉及的外泌体中CD171蛋白可作为肿瘤转移预测的标志物,针对于组织特异性来源外泌体中的CD171蛋白的检测可用于预测肿瘤转移部位。本发明提供的方法不仅可应用于肿瘤转移的预测,也对肿瘤预后评估以及肿瘤治疗方案的选择提供重要参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中转移和非转移癌症样本的总外泌体CD171蛋白检测结果;
图2为本发明一个实施例中胃癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果;
图3为本发明一个实施例中肠癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果;
图4为本发明一个实施例中肝癌肺转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及检测剂在制备试剂盒中的应用;
所述检测剂包括外泌体中的CD171蛋白的定量检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种;
所述外泌体来自生物样品中的组织特异性外泌体;
所述组织特异性外泌体选自肠组织特异性外泌体、胃组织特异性外泌体、肝组织特异性外泌体、肺组织特异性外泌体、淋巴组织特异性外泌体中的至少一种。
本发明提供了一种用于诊断的新标志物:外泌体中的CD171蛋白。
其中,与来自没有所述肿瘤转移的受试者的对照水平比较,在受试者外泌体的CD171蛋白水平升高表明所述受试者可能存在肿瘤转移,且在所述受试者中组织特异性来源外泌体中CD171水平的升高表明了对应的肿瘤转移部位。
本文使用的术语“标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段,特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到,由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害(例如,在炎症过程中),且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成,其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的,蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外,或在替代方案中,标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
在一些实施方式中,所述肿瘤为实体瘤。
在一些实施方式中,所述定量检测剂中还含有选自如下组织特异性标志物的检测剂中的至少一种:
肠组织特异性标志物MS4A12、胃组织特异性标志物SLC9A4、肝组织特异性标志物SLCO1B3、肺组织特异性标志物AGER以及淋巴组织特异性标志物CD8A。
在一些实施方式中,所述定量检测剂用于执行如下任一种方法:
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
定量检测剂通常是特异性地检测外泌体中的CD171蛋白以及任选的组织特异性标志物的试剂,例如,特异性结合它们中其中一个的凝集素、特异性结合它们中其中一个的适配体或特异性结合它们中其中一个的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有108l/mol、或更优选109l/mol的亲和力。
在一些实施方式中,所述定量检测剂为针对待检测物的特异性抗体。
在一些实施方式中,所述特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些实施方式中,所述生物样品选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、***、***分泌物、黏液、唾液、痰以及从生物组织样品得到的澄清的裂解液中的至少一种。
本发明还提供试剂盒,所述试剂盒含有外泌体富集纯化试剂以及如上所定义的定量检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种。
在一些实施方式中,所述试剂盒还含有固相载体、蛋白酶抑制剂、封闭液、显色剂以及洗涤缓冲液中的至少一种。
蛋白酶抑制剂可以为Indinavir、Saquinavir、Ritonavir、Nelfinavir、Amprenavir等成分中的一种或多种。
封闭液可以为BSA、牛血清、脱脂牛奶、TBST等成分中的一种或多种。
显色液可根据抗体上标记的物质进行确定,例如当标记的物质为辣根过氧化物酶时,显色剂可以为鲁米诺。
洗涤缓冲液可为PBS、TBS等成分。
其中,蛋白酶抑制剂、封闭液、显色液、洗涤缓冲液可以工作浓度的形式包装于试剂盒中,也可以它们的浓缩母液的形式被包装(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50倍浓缩的母液)。
固相载体通常用于包被抗体,用于包被抗体的固相载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质,载体的形式可以是试管、EP管、多孔板(特别是化学发光板)、微量反应板凹孔、小珠(特别是磁珠)、小圆片等。
优选的固相载体为化学发光板。其含有的孔位可以为16、32、48、64、96或更多。
根据本发明的再一方面,还涉及一种***,所述***包括信息获取模块和数据分析报告模块;
所述信息获取模块的作用包括:获取外泌体中的CD171蛋白的浓度,并将结果提供给所述数据分析模块;
数据分析报告模块的作用包括:判断所述浓度是否≥150pg/mL,若为是,则输出发生肿瘤转移风险高;若为否,则输出发生肿瘤转移风险低。
在一些实施方式中,所述外泌体来已确诊的癌组织(记为A)。
在一些实施方式中,所述外泌体还可以来自可能发生转移的组织(记为B);进一步地,若B的CD171蛋白的浓度≥150pg/mL,则说明A的肿瘤细胞转移到B的风险高。
本发明还涉及一种诊断肿瘤是否发生转移的方法,所述方法包括:
a)富集纯化外泌体;
b)检测所述外泌体中CD171蛋白的浓度;
c)若所述浓度是否≥150pg/mL,则发生转移的概率较高。
在一些实施方式中,步骤a)中依据分子筛层析原理(例如使用CL-6B填料)从受试者生物样品中分离富集总外泌体。
在一些实施方式中,步骤b)同时检测肠组织特异性外泌体、胃组织特异性外泌体、肝组织特异性外泌体、肺组织特异性外泌体、淋巴组织特异性外泌体中的至少一种的标志物。
在一些实施方式中,所述标志物选自下述至少一种:肠组织特异性标志物MS4A12、胃组织特异性标志物SLC9A4、肝组织特异性标志物SLCO1B3、肺组织特异性标志物AGER以及淋巴组织特异性标志物CD8A。
受试者通常为哺乳动物,优选为灵长类动物,再优选为人。
需要说明的是,诊断的理想场景是这样的情形,其中单一事件或过程会造成各种疾病。在所有其它情况下,正确的诊断可能非常困难,尤其当疾病的病因学不能完全理解时,如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的,对于给定的多因子病,没有生化标志物的诊断是100%特异性且同100%灵敏度。相反地,可使用生化标志物(例如本文证实的外泌体中的CD171蛋白浓度)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此,在常规的临床诊断中,通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1血清组织特异性来源的外泌体分离
从-80℃冰箱中取出血浆,每份血浆样品2mL快速解冻,之后加入0.6mL的促凝血酶原激酶-D在室温下孵育60分钟。加入1.4mL的含有蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液。4℃条件下,3000g离心20分钟。离心后取上清溶液使用CL-6B填料分离富集总外泌体,浓缩至体积2mL。各取200uL外泌体溶液,加入2uL的组织特异性标志物的生物素化的抗体,再加入50uL的3%的BSA,置于4℃冰箱中放置1小时。之后加入25uL的链霉亲和素琼脂糖,再加入50uL的3%的BSA,4℃下放置30分钟。在4℃的条件下,400g离心10分钟,充分去除上清液,保留沉淀。沉淀加入50uL的0.05M的甘氨酸-盐酸(pH=3),涡流10秒。重新悬浮的组织特异性来源的外泌体颗粒,置于-80℃冰箱保存,
实施例2外泌体表达CD171蛋白水平的测定
将提取的外泌体样本从-80℃冰箱中取出,快速解冻,加入0.5mL的M-PER,用pH8.6的1M Tris-HCl将溶液pH值调定至8.0。37℃恒温水浴孵育10分钟,涡流10秒,使外泌体完全裂解。将CD171检测试剂盒从冰箱中取出平衡至室温,待测样本孔分别加校准品和待测样品100uL,设置复孔。37℃恒温箱孵育1小时。洗板3次后加入检测抗体100uL,37℃恒温箱孵育1小时。洗板3次后加入化学发光底物100uL,化学发光仪读取发光值。依据校准品发光值绘制校准曲线,由校准曲线计算出样本的浓度。
实施例3转移和非转移癌症样本的总外泌体CD171蛋白检测
收集癌症转移血浆样本50例,包括10例胃癌样本、10例肠癌样本、10例肺癌样本和10例肝癌样本;收集癌症非转移血浆样本,包括10例胃癌样本、10例肠癌样本、10例肺癌样本和10例肝癌样本。分离富集总外泌体后裂解并检测表面标志物CD171蛋白表达水平。从图1可以看出,非转移癌症样本的CD171表达量大部分低于150pg/mL,转移癌症样本的CD171表达量大部分高于150pg/mL。
表1 转移和非转移癌症样本的总外泌体CD171蛋白检测
实施例4组织特异性来源外泌体中的CD171蛋白的检测预测肿瘤转移部位
收集30例发生转移的癌症患者的血浆样本,其中包括10例胃癌肝转移患者、10例肠癌肝转移患者、10例肝癌肺转移患者。分离并捕获组织特异性来源的外泌体,检测表面标志物CD171蛋白的表达水平。图2胃癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果,从图中可以看出肝组织来源的外泌体CD171蛋白的表达水平明显高于其他组织。图3肠癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果,从图中可以看出肝组织来源的外泌体CD171蛋白的表达水平明显高于其他组织。图4肝癌肺转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测结果,从图中可以看出肺组织来源的外泌体CD171蛋白的表达水平明显高于其他组织。
表2 胃癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测
表3 肠癌肝转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测
表4 肝癌肺转移患者样本组织特异性来源外泌体CD171蛋白检测
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.检测剂在制备试剂盒中的应用;
所述检测剂包括外泌体中的CD171蛋白的定量检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种;
所述外泌体来自生物样品中的组织特异性外泌体;
所述组织特异性外泌体选自肠组织特异性外泌体、胃组织特异性外泌体、肝组织特异性外泌体、肺组织特异性外泌体、淋巴组织特异性外泌体中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述检测剂中还含有选自如下组织特异性标志物的定性检测剂中的至少一种:
肠组织特异性标志物MS4A12、胃组织特异性标志物SLC9A4、肝组织特异性标志物SLCO1B3、肺组织特异性标志物AGER以及淋巴组织特异性标志物CD8A。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述检测剂用于执行如下任一种方法:
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述检测剂为针对待检测物的特异性抗体。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为实体瘤。
6.根据权利要求1、2、4、5任一项所述的应用,其特征在于,所述生物样品选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、***、***分泌物、黏液、唾液、痰以及从生物组织样品得到的澄清的裂解液中的至少一种。
7.试剂盒,其特征在于,含有外泌体富集纯化试剂以及权利要求1~6任意一项中所定义的检测剂;
所述试剂盒用于预测受试者中肿瘤是否发生转移、预测转移部位、肿瘤治疗预后判断、选择肿瘤治疗方案中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,还含有固相载体、蛋白酶抑制剂、封闭液、显色剂以及洗涤缓冲液中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体为化学发光板。
10.一种***,其特征在于,包括信息获取模块和数据分析报告模块;
所述信息获取模块的作用包括:获取外泌体中的CD171蛋白的浓度,并将结果提供给所述数据分析模块;
数据分析报告模块的作用包括:判断所述浓度是否≥150pg/mL,若为是,则输出发生肿瘤转移风险高;若为否,则输出发生肿瘤转移风险低。
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