CN111926100B - 一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用。本发明提供由如SEQ ID NO.1‑3所示的引物扩增得到的水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记以及包括SEQ ID NO.1‑3所示引物的xa5基因特异性引物组合。该标记实现了只需将简易提取的DNA样品通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对xa5的基因分型，预测水稻白叶枯病抗性，具有基因分型准确、成本更低廉、检测通量和检测效率更高等优势，为水稻抗白叶枯病新种质的筛选和xa5基因在种质资源抗性改良中的应用提供了高效的方法。

Description

一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用。

背景技术

水稻白叶枯病是一种严重的细菌性病害，它由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)所引起，病菌通常从水孔或伤口侵入水稻，沿叶脉维管束产生灰白色病斑(翟文学,等.水稻白叶枯抗性基因的研究和分子育种.生物工程进展,1999,19(6):9-15.)。水稻遭受白叶枯病后，一般减产20％-30％，严重时达50％，甚至颗粒无收。

白叶枯病通常在潮湿和低洼地区较易发生，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻，粘稻重于糯稻(Gnanamanickam,et al.An overview ofbacterial blight disease of rice and strategies for its management.Curr SciIndia,1999,77(11):1435-1444；曾列先,等.水稻对白叶枯病强毒菌系V型菌的抗性研究.植物保护学报,1997,24(4):289-292.)。

鉴于水稻白叶枯病巨大的危害性，长久以来，众多科研工作者对该病进行了广泛的研究。目前普遍认为，发掘抗病基因并培育抗病新品种是控制水稻白叶枯病最经济有效的途径。截至目前，从不同水稻品种中已鉴定出数十个白叶枯病抗性基因，已被克隆的有9个，即Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23和Xa27(国家水稻数据中心，http://www.ricedata.cn/index.htm)。

xa5位于水稻5号染色体，为隐性抗白叶枯病基因，同时对细菌性条斑病可能也具有抗性。xa5的cDNA全长906bp，包含3个外显子，编码一个由106个氨基酸组成的蛋白产物，该蛋白产物是一个转录因子IIA的γ亚基(TFIIAγ)。研究发现，xa5在抗病品种IRBB5和感病品种日本晴及IR24中有两个碱基的差异(编码区由碱基AG突变成TC)，导致IRBB5中的第39位的缬氨酸在日本晴及IR24中为谷氨酸。而该氨基酸位点刚好位于蛋白三维结构的表面，因此认为可能与蛋白的相互作用有关(Iyer,et al.The Rice Bacterial BlightResistance Gene xa5Encodes a Novel Form of Disease Resistance.MolecularPlant-Microbe Interactions,2004,17(12):1348-1354；Jiang,et al.Testifying therice bacterial blight resistance gene xa5 by genetic complementation andfurther analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homolog TFIIAγ1.MolecularGenetics and Genomics,2006,275(4):354-366；Xie,et al.Toward the PositionalCloning of qBlsr5a,a QTL Underlying Resistance to Bacterial Leaf Streak,UsingOverlapping Sub-CSSLs in Rice.PLoS ONE,2014,9(4):e95751)。

目前已报道的用于xa5基因型筛选的标记有dCAPS标记(夏志辉,等.利用功能标记鉴定普通野生稻中的白叶枯病抗性基因.中国水稻科学,2009,23(6):653-656.)、CAPS标记(Iyer,et al.Functional markers for xa5-mediated resistance in rice(Oryzasativa,L.).Mol Breeding,2007,19:291-296；鲍永美,等.水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记及其应用；CN106939346A)、基于KASP开发的分子标记(江南,等.水稻抗白叶枯基因xa5的SNP标记开发和应用；CN109628629A)以及四引物标记(刘毅,等.一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记及其应用；CN109207631A)，这些标记虽然均能对xa5基因进行鉴定，但均存在诸多不足，例如：CAPS和dCAPS标记需要较高质量的DNA，并且需要在PCR后进行酶切，操作繁琐，成本较高；KASP标记技术的应用需要配置荧光标记和荧光检测设备，其检测成本比较高；四引物标记同样需要较高质量的DNA，并配备琼脂糖胶进行检测，且不易有效发挥选择性扩增/抑制非特异性扩增的能力，检测准确性和可重复性有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用，本发明的另一目的在于提供用于检测水稻抗白叶枯病基因xa5的特异性引物组合及其应用。

为实现上述目的，本发明基于水稻抗白叶枯病基因xa5与感病基因Xa5等位基因之间存在的两个碱基的差异(导致xa5基因编码蛋白的第39位的缬氨酸在Xa5蛋白中变成谷氨酸)，经大量设计、摸索、筛选和验证得到了水稻抗白叶枯病基因xa5的三引物InDel分子标记及其特异性引物组合。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记，其由如SEQ ID NO.1-3所示的引物扩增得到。

对于抗病品种IRBB5和感病品种日本晴，所述分子标记为序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的DNA片段。

本发明进一步提供用于检测水稻抗白叶枯病基因xa5的特异性引物组合，其包括如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

具体地，所述引物组合包括SEQ ID NO.1所示的正向引物xa5-F1:ATACTGTAGCTCGCCATTCAAGTTGTCGTC，SEQ ID NO.2所示的正向引物xa5-F2：AGCTCGCCATTCATGTTCTTGAG，和SEQ ID NO.3所示的反向引物xa5-R:AGATGATAACAAACAAAATGAGGAGTCG。

以上所述的引物组合中，xa5-F1和xa5-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为GTC和GAG，只能分别与感病基因Xa5和抗病基因xa5进行碱基配对。此外，xa5-F1的5’端增加了特异序列ATACTGT用以引入扩增片段长度多态性，xa5-F1的3’端第4和6个碱基引入了T→C和C→G的突变，xa5-F2的3’端第10个碱基引入了A→T的突变用以扩大xa5-F1和xa5-F2对目标序列识别能力的差异及避免引物间产生互补配对。xa5-R可以分别与xa5-F1和xa5-F2配对扩增出126bp和119bp的PCR产物。

本发明提供含有所述引物组合的试剂盒。该试剂盒可用于检测水稻抗白叶枯病基因xa5。

本发明提供所述分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在水稻抗白叶枯病基因xa5检测中的应用。

以上所述的水稻抗白叶枯病基因xa5检测具体可为判断水稻是否含有水稻抗白叶枯病基因xa5和/或水稻抗白叶枯病基因xa5的基因型。

本发明还提供所述分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在水稻水稻白叶枯病抗性预测中的应用。

以上所述的水稻水稻白叶枯病抗性预测具体可为判断水稻是否含有水稻抗白叶枯病基因xa5和/或水稻抗白叶枯病基因xa5的基因型，若水稻含有抗白叶枯病基因xa5，则预测具有白叶枯病抗性。

本发明提供所述分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在抗白叶枯病水稻育种或水稻种质资源白叶枯病抗性改良中的应用。

进一步地，本发明提供一种检测水稻抗白叶枯病基因xa5的方法，以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物大小判断水稻是否含有抗白叶枯病基因xa5以及xa5的基因型。

以上所述的方法中，PCR扩增的反应程序为：94℃，4～5min；94℃，20～40s，54-60℃，20～40s，72℃，20～30s，共30～40个循环；72℃，5～10min。

PCR扩增的10μL反应体系为：2×PCR反应mix 5μL，10μM的2个正向、1个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 1-1.5μL，补灭菌ddH₂O至10μL。

在本发明的一个优选实例中，所述的2×PCR反应mix可以为Biomiga的2×BenchTop^TM Taq master mix。

以上PCR反应体系中模板DNA可采用常规方法提取得到。特别地，相比于现有技术的检测方法，本发明提供的检测引物和检测方法可实现以简易法提取得到的DNA为模板进行高效扩增和检测。

优选地，所述水稻基因组DNA模板采用简易法提取得到。

简易法提取水稻基因组DNA的方法可采用如下方法：

(1)取1cm左右的水稻叶片放入多孔PCR板中；

(2)加入70μL缓冲液A(20％Tween20:800μL，5mol/L NaOH：160μL，ddH₂O 7.04mL，用硅胶盖封口，立刻将PCR板放入PCR仪中，95℃，保持10min；

(3)取出PCR板，迅速加入等体积缓冲液B(1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：40μL，ddH₂O 8.96mL)得到的提取液可直接用于作为模板DNA。

以上所述的方法中，可采用PAGE胶电泳检测PCR扩增产物大小，PAGE胶电泳条件可为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳60min。

以上所述的方法中，根据扩增产物大小判断水稻是否含有抗白叶枯病基因xa5的具体方法如下：若扩增产物只出现126bp条带，则待测样品为纯合显性Xa5感病基因型；若只出现119bp条带，则待测样品为纯合隐性xa5抗病基因型；若同时出现126bp和119bp条带，则待测样品为杂合基因型。

以上所述的126bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，119bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

本发明还提供一种预测水稻白叶枯病抗性的方法，以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物大小判断水稻是否具有白叶枯病抗性。

以上方法中，PCR扩增的反应程序为：94℃，4～5min；94℃，20～40s，54-60℃，20～40s，72℃，20～30s，共30～40个循环；72℃，5～10min。

PCR扩增的10μL反应体系为：2×PCR反应mix 5μL，10μM的2个正向、1个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 1-1.5μL，补灭菌ddH₂O至10μL。

以上所述的方法中，根据扩增产物大小判断水稻白叶枯病抗性的具体方法如下：若扩增产物只出现126bp条带，则待测样品为纯合显性Xa5感病基因型，待测样品为白叶枯病感病品种；若只出现119bp条带，则待测样品为纯合隐性xa5抗病基因型，待测样品为白叶枯病抗病品种；若同时出现126bp和119bp条带，则待测样品为杂合基因型，待测样品为白叶枯病感病品种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于水稻白叶枯病抗病基因xa5和感病基因Xa5的等位基因之间两个功能性碱基的差异，设计开发了一种扩增片段短，特异性强的三引物分子标记。利用该标记，只需将简易提取的DNA样品通过简单的PCR和PAGE凝胶电泳检测即可完成对xa5的基因分型，预测水稻白叶枯病抗性。本发明的分子标记及其特异性引物组合克服了现有xa5分子标记的不足，具有基因分型准确、成本更低廉、检测通量和检测效率更高等优势，在提高检测效率的同时保证了检测的准确性，同时对模板DNA质量的要求也非常低，更适合在大规模分子标记辅助选择中运用，为水稻抗白叶枯病新种质的筛选和xa5基因在种质资源抗性改良中的应用提供了高效的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中引物设计示意图，其中，A为Jiang等发表文献(Jiang,etal.Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5by geneticcomplementation and further analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homologTFIIAγ1.Molecular Genetics and Genomics,2006,275(4):354-366)中抗性品种xa5和感病品种Xa5的基因结构及功能碱基序列差异；B为本发明分子标记的引物设计示意图，包括两条正向引物xa5-F1和xa5-F2，一条公共反向引物xa5-R，其中，xa5-F1和xa5-F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为GTC和GAG，只能分别与感病和抗病品种进行碱基配对，xa5-F1的5’端增加了特异序列ATACTGT用以引入扩增片段长度多态性，xa5-F1的3’端第4和6个碱基引入了T→C和C→G的突变，xa5-F2的3’端第10个碱基引入了A→T的突变用以扩大xa5-F1和xa5-F2对目标序列识别能力的差异及避免引物间产生互补配对；碱基缺失位点用黑色方框标出，引入的碱基突变用下划线标出。

图2为本发明实施例2中用本发明分子标记检测12个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图；其中，泳道1-12分别为IRBB64(含xa5)、五丰B、华占、中香黄占、R51084、青丰1号B、南H197、福丰恢1658、元丰9918S、9311、岳4B、H28B；PCR产物大小标记在胶图右侧。

图3为本发明实施例3中用本发明分子标记检测简易法提取2245(为9311突变体)/IRBB64(含xa5)的BC₁F₁代单株DNA的PAGE胶电泳图，泳道1-20为简易法提取BC₁F₁单株DNA样品，21为2245，22为IRBB64；PCR产物大小标记在胶图右侧。

图4为本发明实施例3中2245(为9311突变体)/IRBB64(含xa5)的BC₁F₁代中纯合xa5基因型和纯合Xa5基因型单株与IRBB64、日本晴、9311测序序列比对结果；箭头所指处为功能碱基突变位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1水稻xa5基因分子标记的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

通过对水稻抗病基因xa5和感病基因Xa5进行序列比对，得到了引起抗病品种IRBB5第39位的缬氨酸在感病品种日本晴及IR24中变成谷氨酸的两个功能性碱基差异。根据该碱基位点上下游的序列设计引物组合(图1)：

xa5-F1:ATACTGTAGCTCGCCATTCAAGTTGTCGTC(SEQ ID NO.1)，

xa5-F2:AGCTCGCCATTCATGTTCTTGAG(SEQ ID NO.2)，

和xa5-R:AGATGATAACAAACAAAATGAGGAGTCG(SEQ ID NO.3)。

2、扩增片段分析

用上述引物组合对水稻抗白叶枯病基因xa5进行扩增，感病材料只能扩出一条126bp条带，抗病材料只能扩出一条119bp条带。126bp和119bp条带的核苷酸序列分别如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2用本发明分子标记鉴定水稻品种/品系的xa5基因型

1、水稻基因组DNA的提取

用IRBB64(含xa5)、五丰B、华占、中香黄占、R51084、青丰1号B、南H197、福丰恢1658、元丰9918S、9311、岳4B、H28B等12个水稻品种/品系为材料，在苗期提取叶片基因组DNA。DNA提取在赵国珍等(赵国珍,贾育林,严宗卜等.一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用.中国水稻科学,2012,26(4)：495-499)建立方法基础上稍作改进，具体方法如下：

DNA提取使用的化学试剂：

缓冲液A(现配现用)：20％Tween20:800μL，5mol/L NaOH：160μL，ddH₂O 7.04mL。

缓冲液B：1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：40μL，ddH₂O8.96mL。

DNA提取步骤：

(1)取新鲜水稻叶片或老叶片约1cm左右放入200μL 96孔PCR板中；

(2)每孔加入70μL缓冲液A，用96孔硅胶盖封口，立刻将平板放入PCR仪中，95℃，保持10min；

(3)取出平板，迅速加入等体积缓冲液B得到提取液，该提取液即可直接作为模板DNA进行PCR检测；

(4)若要存留一段时间进行PCR检测，可将剩下的提取液封口保存于-20℃备用，但不宜反复冻融。

2、PCR扩增

利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(xa5-F1，xa5-F2，xa5-R)对步骤1提取的12个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：Biomiga的2×Bench Top^TM Taqmaster mix 5μL，10μM的2个正向、1个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA约1.5μL，补灭菌ddH₂O至10μL；

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，20s，共35个循环；72℃，8min，16℃，1min。

3、PCR产物检测

扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳60min。电泳完成后用0.1％AgNO₃染色，观片灯上观察拍照。

4、结果与分析

用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增上述12个水稻品种/品系，发现只有IRBB64能扩增出了一条119bp的带，为纯合xa5抗病基因型，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条126bp的带，为纯合Xa5感病基因型(见图2)。以上结果表明，隐性纯合抗病xa5基因型在现有水稻栽培品种中分布较少，因此具有极大的育种应用潜力。

实施例3用本发明分子标记鉴定水稻杂交后代的xa5基因型

1、水稻材料

水稻品种2245(为9311突变体)/IRBB64(含xa5)的BC₁F₁代20个不同单株。

2、水稻基因组DNA的提取

在苗期提取叶片基因组DNA，DNA提取方法同实施例2。

3、PCR扩增和产物判断标准参见实施例2。

4、结果与分析

用本发明实施例1的分子标记(特异性引物组合xa5-F1，xa5-F2，xa5-R通过PCR扩增得到)在苗期检测全部20个BC₁F₁单株中xa5的基因型，发现有4个单株只扩增出了126bp条带，有9个单株只扩增出了119bp条带，有7个单株同时扩增出了126bp和119bp条带(见图3)。将BC₁F₁群体中纯合xa5基因型和Xa5基因型单株进行测序，发现纯合xa5基因型单株序列与IRBB64序列一致，纯合Xa5基因型单株序列与9311和日本晴序列一致(见图4)。以上结果表明，本发明分子标记能够在抗感材料杂交后代中有效区分不同基因型，且结果真实准确，利用该分子标记在大规模育种实践中能够较为准确地对水稻抗白叶枯病基因xa5进行辅助选择。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用

<130> KHP201114967.1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atactgtagc tcgccattca agttgtcgtc 30

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agctcgccat tcatgttctt gag 23

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatgataac aaacaaaatg aggagtcg 28

<210> 4

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atactgtagc tcgccattca agttgtcgtc cagtttgata aggtatctac tttaccatat 60

ctccttccac ctattactat ctatactatt gaaaaattcg actcctcatt ttgtttgtta 120

tcatct 126

<210> 5

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctcgccat tcatgttctt gagcagtttg ataaggtatc tactttacca tatctccttc 60

cacctattac tatctatact attgaaaaat tcgactcctc attttgtttg ttatcatct 119

Claims (9)

1.用于检测水稻抗白叶枯病基因xa5的特异性引物组合，其特征在于，其由如SEQ IDNO.1-3所示的引物组成。

2.含有权利要求1所述的引物组合的试剂盒。

3.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在水稻抗白叶枯病基因xa5检测中的应用。

4.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在水稻白叶枯病抗性预测中的应用。

5.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在抗白叶枯病水稻育种或水稻种质资源白叶枯病抗性改良中的应用。

6.一种检测水稻抗白叶枯病基因xa5的方法，其特征在于，以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物带型判断水稻是否含有抗白叶枯病基因xa5以及xa5的基因型。

7.一种预测水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于，以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-3所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物大小预测水稻是否具有白叶枯病抗性。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃，4～5min；94℃，20～40s，54-60℃，20～40s，72℃，20～30s，共30～40个循环；72℃，5～10min。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，若扩增产物只出现126bp条带，则待测样品为纯合显性Xa5感病基因型；若只出现119bp条带，则待测样品为纯合隐性xa5抗病基因型；若同时出现126bp和119bp条带，则待测样品为杂合基因型。