CN112409335B - 一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种1,2,3,4‑四氢吖啶‑9‑胺类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物以他克林为母核，具有式Ⅰ、Ⅱ所示结构式或者式Ⅰ、Ⅱ所述化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，该化合物具有在制备抗阿尔兹海默病药物方面、在制备延缓神经退行性疾病药物方面、在制备体外修复胆碱能神经元药物方面、在制备体外抗氧化应激损伤活性药物方面、在制备体内外减轻β‑淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性药物方面以及在通过CREB‑ERK通路改善认知障碍中或者在通过降低Tau蛋白磷酸化改善认知障碍中的用途，优点是该化合物在抗阿尔茨海默病方面有优良活性。
Description
技术领域
本发明涉及属于医药领域，尤其是涉及一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物及其制备方法和在抗阿尔兹海默病中的应用。
背景技术
神经退行性疾病是一类以大脑和脊髓神经元进行性损失为主要特征的疾病。阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是老年人群中发病率最高的神经退行性疾病。目前全球AD患者已超5000万，据世界卫生组织预估2030年全球AD患者将达8200万，2050年将达1.52亿。同时，AD将成为仅次于心血管疾病，死亡率第二高的疾病。据阿尔兹海默协会报道，2018年AD患者终生护理费用高达350174美元，给社会家庭带来严重经济负担。
关于AD致病机制存在众多假说，其中“胆碱能假说”、“β-淀粉样蛋白假说”认可度较高。“胆碱能假说”是第一个被提出的相关假说，其依据为患者大脑中观察到胆碱能纤维损失及乙酰胆碱含量下降。乙酰胆碱是一种重要神经递质，其丢失将严重影响神经细胞功能及信号传递。β-淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)是老年斑的主要成分，被认为是AD病理过程中最重要的标志物。实际上Aβ是由40或42个氨基酸所组成的肽段，由APP前体蛋白经β-或γ-分泌酶断裂形成，可聚集成为寡聚体、多聚体或纤维。其中寡聚体被视为毒性最强的片段，可破坏突触结构和功能，因而被视为引起AD的主要毒性物质。
药物疗法是目前AD治疗的主要手段。临床药物包括美金刚、多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明等，这些药物对早期AD患者有一定疗效。然而，这些药物靶点单一，无法适应AD复杂的病理环境。因此，多靶点药物设计被视为抗AD药物开发的新方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗阿尔茨海默病方面有优良活性的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物，所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物以他克林为母核，具有式Ⅰ、Ⅱ所示结构式或者式Ⅰ、Ⅱ所述化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，具体如下：
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数位1-5的直链烷烃，R2和R3为H、
n＝1，2，3，4或5，m＝1，2，3，4或5，盐为无机酸盐或有机酸盐；无机酸盐为盐酸、硫酸或磷酸形成的盐；有机酸盐为乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸或对苯甲磺酸形成的盐。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)使式III化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式IV化合物；
(2)使式IV化合物与式V化合物在三氯氧磷中反应，获得式VI化合物；
(3)使式VI化合物与式VII化合物在苯酚中反应，获得式VIII化合物；
(4)使式IX化合物与式X所示化合物在氮气保护下反应，获得式XI所示化合物；
(5)使式XI化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式XII化合物；
(6)使式XII化合物、式VIII化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应后，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，获得式I化合物；
(7)使式VI化合物与式X化合物在苯酚或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，获得式Ⅱ化合物、或使式VI化合物与XIII化合物在苯酚或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，获得式Ⅱ化合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数位1-5的直链烷烃，R2，R3为H、
n＝1，2，3，4或5，m＝1，2，3，4或5，上述式Ⅰ、Ⅱ所述化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中盐为无机酸盐或有机酸盐；无机酸盐为盐酸、硫酸或磷酸形成的盐；有机酸盐为乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸或对苯甲磺酸形成的盐。
步骤(1)具体为：于40℃下，将式III所示化合物、氢氧化钠按照1:1.3摩尔比溶于等体积比混合的甲醇水溶液中反应6小时，即获得式IV所示化合物；
步骤(2)具体为：于0℃下，将式IV所示化合物和式V所示化合物按照1:1.2摩尔比加入三氯氧磷中，转移到110℃下反应6小时，获得式VI所示化合物；
步骤(3)具体为：于170℃下，以碘化钾为催化剂，将式VI所示化合物和式VII所示化合物按照1:2.1摩尔比加入苯酚中反应4小时，获得式VIII所示化合物；
步骤(4)具体为：于60℃下，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，将式IX所示化合物与式X所示化合物按照1.1:1摩尔比加入DMF中，在氮气保护下过夜反应，获得式XI所示化合物；
步骤(5)具体为：于50℃下，将式XI所示化合物与氢氧化钠按照1:1.5摩尔比溶于由体积比4:1混合成的甲醇水溶液中，过夜反应，获得式XII所示化合物；
步骤(6)具体为：于室温下，将式XII所示化合物、式VIII所示化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)按照1：1：1.5摩尔比混合后加入DMF中反应20分钟后，加入式XII所示化合物2倍摩尔比的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应6-8小时，获得式I所示化合物；
步骤(7)具体为：于90-170℃下，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，将式VI化合物与式X化合物、或使式VI化合物与XIII化合物分别按照摩尔比为1:(1.1-1.5)混合后在氮气保护下于苯酚或DMF中反应4-17小时，获得式Ⅱ所示化合物。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备抗阿尔兹海默病药物方面的应用。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备延缓神经退行性疾病药物方面的应用。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体外修复胆碱能神经元药物方面的应用。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体外抗氧化应激损伤活性药物方面的应用。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体内外减轻β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性药物方面的应用。
上述1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在通过CREB-ERK通路改善认知障碍中或者在通过降低Tau蛋白磷酸化改善认知障碍中的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物(新型他克林类化合物)及其制备方法和用途，该化合物是一种潜在的抗AD多靶点药物，能够高效抑制AChE，还可在体内外减弱Aβ神经毒性，显示出多靶点协同抗AD作用。本发明提供的化合物经过体外抑制AChE活性测定与其作用方式探究实验、点印记实验、分子对接实验、酶联免疫吸附试验、MTT法检测药物毒性试验、实时聚合酶链反应实验、ThT荧光实验、Y迷宫和Morris水迷宫实验，证明本发明的化合物是一种潜在的抗AD活性药物。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，设计并合成出一系列新型他克林化合物，实验证明其有良好的活性，在抗阿尔兹海默症药物设计研发领域有着良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例中化合物3体外AChE抑制结果；
图2为本发明的实施例中化合物3对AChE体外抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数图；
图3为本发明的实施例中化合物3的浓度与双倒数直线斜率的关系；
图4为本发明的实施例中化合物3在体外抑制Aβ寡聚化的作用结果：(A)5mM、10mM化合物3抑制Aβ寡聚体形成(B)量化结果；
图5为本发明的实施例中化合物3与Aβ分子对接方式；
图6为本发明的实施例中化合物3在体内对小鼠海马IL-1β(A)、TNF-α(B)表达影响结果；
图7为本发明的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4体外细胞毒性测试结果；
图8为本发明的实施例中化合物3体外抑制nNOS酶活结果；
图9为本发明的实施例中化合物3对Aβ寡聚体诱导的小鼠认知障碍的影响结果；(A)旷场实验小鼠跨线次数，(B)旷场实验小鼠站立次数，(C)Y迷宫实验小鼠进入新异臂时间占总时间的百分比，(D)新物体认知实验中小鼠的认知指数，(E)Morris水迷宫实验训练期小鼠登上平台的时间，(F)Morris水迷宫实验中测试期小鼠在平台所在象限游动时间占总时间百分比，(G)Morris水迷宫实验中测试期小鼠登上平台次数，(H)Morris水迷宫实验中小鼠的运动轨迹；
图10为不同处理组小鼠海马中ERK磷酸化程度及量化结果；实验组别包括：Control组、Aβ组、Aβ+0.2μM化合物3组、Aβ+0.4μM化合物3组及Aβ+0.4μM他克林组；
图11为不同处理组小鼠海马中CREB磷酸化程度及量化结果；Control组、Aβ组、Aβ+0.2μM化合物3组、Aβ+0.4μM化合物3组及Aβ+0.4μM他克林组；
图12为不同处理组小鼠海马中Tau磷酸化程度及量化结果。Control组、Aβ组、Aβ+0.2μM化合物3组、Aβ+0.4μM化合物3组及Aβ+0.4μM他克林组。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本文中，“式N所示化合物”在本文中有时也称为“化合物N”，在本文中N为1-14的任意整数，例如“式2所示化合物”在本文中也可以称为“化合物2”。
具体实施例一
一种新型1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物，该化合物为具有式Ⅰ、Ⅱ所示结构式的化合物，或具有式Ⅰ、Ⅱ所示结构式的化合物的药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数位1-5的直链烷烃，R2，R3为H、
n＝1，2，3，4或5，m＝1，2，3，4或5，上述式Ⅰ、Ⅱ所述化合物药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，其中盐为无机酸盐或有机酸盐；无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸和磷酸；有机酸选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对苯甲磺酸。
上述式Ⅰ、Ⅱ所示新型1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物优选为下述任意一种：
该化合物能够高效抑制AChE，还可在体内外减弱Aβ神经毒性，显示出多靶点协同抗AD作用，为此该化合物存在抗AD潜力。本发明提供的化合物经过体外抑制AchE活性测定与其作用方式探究实验、点印记实验、分子对接实验、酶联免疫吸附试验、MTT法检测药物毒性试验、实时聚合酶链式反应实验、ThT荧光实验、Y-迷宫和Morris水迷宫实验，证明本发明的化合物是一种潜在的抗AD活性药物。
具体实施例二
上述具体实施例一种新型1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)使式III化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式IV化合物；具体为于40℃下，将式III所示化合物、氢氧化钠按照1:1.3摩尔比溶于等体积比混合的甲醇水溶液中反应6小时，即获得式IV所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(2)使式IV化合物与式V化合物在三氯氧磷中反应，获得式VI化合物；具体为于0℃下，将式IV所示化合物、式V所示化合物按照1:1.2摩尔比加入三氯氧磷中，转移到110℃下反应6小时，获得式VI所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(3)使式VI化合物与式VII化合物在苯酚中反应，获得式VIII化合物；具体为于170℃下，以碘化钾为催化剂，将式VI所示化合物、式VII所示化合物按照1:2.1摩尔比加入苯酚中反应4小时，获得式VIII所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(4)使式IX化合物与式X所示化合物在氮气保护下反应，获得式XI所示化合物；具体为：于60℃下，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，将式IX所示化合物与式X所示化合物按照1.1:1摩尔比在DMF中，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，在氮气保护下过夜反应，获得式XI所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(5)使式XI化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式XII化合物；具体为：于50℃下，将式XI所示化合物与氢氧化钠按照1:1.5摩尔比溶于由体积比4:1混合成的甲醇水溶液中，过夜反应，获得式XII所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(6)使式XII化合物和式VIII化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)在DMF中反应后，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，获得式I化合物；具体为：于室温下，将式XII所示化合物、式VIII所示化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)按照1：1：1.5摩尔比后加入DMF中反应20分钟后，加入式XII所示化合物2倍摩尔比的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应6-8小时，获得式I所示化合物；由此，有利于提高反应效率，减少副反应，提高产率；
(7)使式VI化合物与式X化合物、或使式VI化合物与XIII化合物在苯酚或DMF中反应，获得式Ⅱ化合物，具体为：于90-170℃下，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，将式VI化合物与式X化合物、或使式VI化合物与XIII化合物分别按照摩尔比为1:(1.1-1.5)混合后在氮气保护下于苯酚或DMF中反应4-17小时，获得式Ⅱ所示化合物。
其中，R1为H、CH3、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数位1-5的直链烷烃，R2，R3为H、
n＝1，2，3，4或5，m＝1，2，3，4或5。利用上述制备方法能够快速有效地制备获得前面所述的化合物，且该方法操作简单、方便快捷、适于规模化生产。
实施例1：化合物1
的制备
1、制备2-氨基苯甲酸
将2-氨基苯甲酸乙酯(6.06mmol)和氢氧化钠(7.878mmol)在甲醇(5mL)和水(5mL)中搅拌，混合物在40℃搅拌6小时。反应完成后，旋蒸除去甲醇，所得溶液用盐酸酸化至pH3-4。将所得悬浮液搅拌10分钟，过滤沉淀物，干燥，得到白色固体粉末，产率95％，化合物结构数据表征为：1H NMR(600MHz,CDCl3):7.69(d,J＝7.8,1H),6.93(t,J＝7.6,1H),6.45(d,J＝8.1,1H),6.37(t,J＝6.4,1H),3.17(s,1H)。
2、制备9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶
将上一步得到的中间体2-氨基苯甲酸(3.6mmol)和环己酮(4.32mmol)在0℃下加入到三氯氧磷(10mL)中，然后在110℃下回流反应6小时。冷却至室温后，在冰浴条件下快速搅拌下将碳酸钠溶液缓慢加入到反应体系中，并将PH值调节至8。向反应溶液中加入二氯甲烷(40mL)。用水(30mL×3)洗涤有机层，用硫酸镁干燥，减压除去二氯甲烷，得到粗产物。粗产物用热丙酮(5mL)溶解，然后在4℃放置过夜并过滤，得到黄色固体粉末，产率74.3％，熔点64～65℃，化合物结构数据表征为：1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.89(d,J＝8.6Hz,1H),8.30(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.92(ddd,J＝8.4,6.9,1.3Hz,1H),7.80(ddd,J＝8.3,7.0,1.1Hz,1H),3.63(t,J＝6.0Hz,2H),3.07(t,J＝6.0Hz,2H),1.98(dt,J＝8.8,5.4Hz,4H)。
3、制备N1-(1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)丙烷-1,3-二胺
将上一步得到的中间体9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶(1.15mmol)、1,3-丙二胺(2.415mmol)和KI(催化量)加入苯酚(10.35mmol)中，然后在170℃回流反应4小时。通过向反应溶液中缓慢加入氢氧化钾溶液来中和苯酚。混合物在二氯甲烷(30mL)和水(30mL)之间分配。用水(30mL×3)洗涤有机提取物，干燥(硫酸镁)，减压除去二氯甲烷，得到粗产物。石油醚/乙酸乙酯在柱色谱中用作洗脱剂，得到棕色油状液体，产率：90.5％，化合物结构数据表征为：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.17(dd,J＝8.6,1.3Hz,1H),7.71(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),7.52(ddd,J＝8.2,6.8,1.4Hz,1H),7.34(ddd,J＝8.3,6.8,1.4Hz,1H),3.47(t,J＝6.9Hz,2H),2.90(t,J＝6.5Hz,2H),2.72(dt,J＝13.5,6.7Hz,4H),1.83(m,2H),1.81(m,2H),1.76(m,2H)。
4、制备
将3-溴丙酸甲酯(3.531mmol)、二甲基吡啶胺(3.21mmol)、催化量的碘化钾和三乙胺(0.1mL)加入到DMF(10mL)中。在氮气保护下，反应在60℃搅拌过夜。冷却至室温后，混合物在二氯甲烷(30mL)和水(30mL)之间分配。用水(30mL×5)洗涤有机提取物，干燥(硫酸镁)，减压除去二氯甲烷，得到粗产物。石油醚/乙酸乙酯在柱色谱中用作洗脱剂，得到黄色油状液体，产率43.2％，化合物结构数据表征：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.55–8.50(m,2H),7.67(td,J＝7.7,1.8Hz,2H),7.50(d,J＝7.8Hz,2H),7.19–7.15(m,2H),3.85(s,4H),3.63(s,3H),2.96–2.91(m,2H),2.57(t,J＝7.1Hz,2H)。
5、制备
将中间体
(2.24mmol)、氢氧化钠(3.36mmol)加入甲醇(8mL)和水(2mL)中。混合物在50℃搅拌过夜。反应完成后，向反应溶液中加入二氯甲烷(10mL)，提取1-2次以除去一些杂质。所得溶液用盐酸酸化至pH 7，减压除去水，得到粗产物。残留物溶于甲醇后，过滤除去无机盐。减压除去甲醇，得到产物，无需进一步纯化直接进行下一步反应。
6、制备化合物1
将中间体N1-(1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)丙烷-1,3-二胺(1.85mmol)、中间体
(1.85mmol)和2-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(2.775mmol)在二甲基甲酰胺(5mL)中室温搅拌20分钟，然后加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，3.65mmol)，在室温下搅拌反应6-8小时，直到薄层色谱(乙酸乙酯/三乙胺＝10/1)反应完成后，将混合物在二甲基甲酰胺(40mL)和水(40mL)之间分配。用水(40mL×5)洗涤有机提取物，干燥(硫酸镁)，处理有机层，得到残留物，用乙酸乙酯/石油醚/三乙胺洗脱，用柱色谱法纯化，得到目标化合物1为黄褐色粘性固体，产率63.5％，化合物结构数据表征：1HNMR(600MHz,CDCl3):δ8.50(dddd,J＝13.2,4.9,1.9,0.9Hz,2H),8.00(ddd,J＝13.3,8.5,1.3Hz,1H),7.92(m,1H),7.63(td,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.56(m,2H),7.50(m,1H),7.35(m,2H),7.12(dddd,J＝13.7,7.5,4.8,1.2Hz,2H),3.82(s,2H),3.77(s,2H),3.50(m,2H),3.46(m,2H),3.06(q,J＝9.7,7.6Hz,2H),2.92(d,J＝31.1Hz,2H),2.74(dd,J＝12.8,6.1Hz,2H),2.60(m,2H),2.28(td,J＝8.0,7.5,6.1Hz,2H),1.87(m,2H),1.83(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ23.2,23.8,25.2,29.8,31.2,31.7,34.5,36.6,54.0,60.3,60.6,122.0,122.2,122.6,122.7,122.8,123.1,123.5,124.0,124.1,124.1,128.6,136.4,136.5,149.1,149.2,159.4,160.0,162.0,174.5.HR-MS(ESI):C31H36N6O,Calcd for[M+H]+509.3029；Found:509.3021。
实施例2：化合物2
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,4-丙二胺进行反应，最终得到目标化合物2为黄褐色粘性固体，产率70.3％，化合物结构数据表征：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,J＝4.8Hz,2H),8.11(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(td,J＝7.7,1.9Hz,2H),7.43(s,1H),7.36(d,J＝7.8Hz,2H),7.21(s,1H),7.18(m,2H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),3.98(s,4H),3.48(dt,J＝11.1,5.4Hz,2H),3.29(d,J＝6.2Hz,2H),2.75(t,J＝6.0Hz,2H),2.51(t,J＝8.1Hz,2H),2.18(dt,J＝33.3,7.6Hz,4H),2.05(m,2H),2.00(m,2H),1.90(m,2H),1.86(m,2H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ21.7,22.5,24.5,26.9,27.1,28.6,29.8,37.6,39.0,48.5,48.5,54.9,122.1,122.5,123.8,123.8,124.5,124.7,124.7,130.0,130.7,135.2,136.7,136.9,149.4,152.4,153.6,154.6,159.7,161.8,170.8.HR-MS(ESI):C32H38N6O,Calcd for[M+H]+523.3185；Found:523.3168。
实施例3：化合物3
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成4-溴丁酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物3为黄褐色粘性固体，产率62.1％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48–8.42(m,2H),8.25(d,J＝8.6Hz,1H),7.91(t,J＝5.9Hz,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.73(td,J＝7.6,1.8Hz,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),7.46(t,J＝7.6Hz,1H),7.21(ddd,J＝7.5,4.8,1.1Hz,2H),3.69(s,4H),3.64–3.56(m,2H),3.09(q,J＝6.3Hz,2H),2.95(t,J＝5.6Hz,2H),2.67(d,J＝5.7Hz,2H),2.41(t,J＝7.1Hz,2H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.81(d,J＝5.5Hz,4H),1.71(dt,J＝14.9,7.1Hz,4H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ22.8,24.9,27.2,29.0,34.1,37.9,39.1,48.9,53.9,54.0,60.3,60.5,116.5,120.4,122.1,122.8,123.0,123.4,123.8,128.4,128.7,136.4,147.4,149.1,150.6,158.6,159.4,159.9,161.4,164.6,173.5.HR-MS(ESI):C32H38N6O,Calcd for[M+H]+523.3185；Found:523.3165。
实施例4：化合物4
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,4-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成4-溴丁酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物4为黄褐色粘性固体，产率68.4％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝1.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.7Hz,2H),7.94(t,J＝8.4Hz,4H),7.57(ddd,J＝8.4,6.7,1.5Hz,2H),7.38(dd,J＝8.6,6.9Hz,2H),3.64(m,4H),3.46(d,J＝6.3Hz,2H),3.40(d,J＝6.2Hz,4H),3.07(m,6H),2.74(m,6H),2.04(s,4H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ22.1,22.8,23.3,24.8,29.8,31.3,31.5,31.7,35.3,36.5,44.8,44.9,46.6,114.6,118.7,122.0,123.1,123.2,123.4,124.3,124.5,125.1,125.7,129.9,130.1,135.2,144.1,153.0,155.7,156.2,162.6,171.9.HR-MS(ESI):C33H40N6O,Calcd for[M+H]+537.3342；Found:537.3327。
实施例5：化合物5
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,5-丙二胺，最终得到目标化合物5为黄褐色粘性固体，产率74.9％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝4.5Hz,2H),8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.73–7.67(m,3H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),7.47(d,J＝7.8Hz,2H),7.33(t,J＝7.6Hz,1H),7.20(dd,J＝7.1,5.2Hz,2H),3.71(s,4H),3.01–2.98(m,2H),2.88(s,2H),2.72–2.66(m,4H),2.53(d,J＝6.9Hz,2H),2.30(t,J＝7.0Hz,2H),1.79(dt,J＝12.6,5.5Hz,4H),1.55(p,J＝7.5Hz,2H),1.36(p,J＝7.1Hz,2H),1.27(q,J＝8.2Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ172.4,158.4,149.2,149.0,136.6,136.4,130.9,124.5,124.0,123.4,123.0,122.3,122.0,120.8,117.3,112.9,60.2,59.7,50.5,50.1,48.9,38.7,33.4,30.5,29.4,24.1,23.8,22.2,21.4.HR-MS(ESI):C33H40N6O,Calcd for[M+H]+537.3342；Found:537.3336。
实施例6：化合物6
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,5-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成4-溴丁酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物6为黄褐色粘性固体，产率70.1％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.47–8.44(m,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,0H),7.77–7.72(m,1H),7.69(q,J＝8.4,6.9Hz,1H),7.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.45(t,J＝7.4Hz,0H),7.24–7.20(m,1H),3.70(s,1H),3.64–3.57(m,1H),2.99–2.95(m,1H),2.94(t,J＝6.6Hz,1H),2.67(t,J＝5.5Hz,1H),2.41(t,J＝7.1Hz,1H),1.81(d,J＝5.5Hz,1H),1.70(p,J＝7.4Hz,1H),1.63(p,J＝7.5Hz,1H),1.34(p,J＝7.0Hz,1H),1.27(q,J＝8.0Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.7,165.1,162.6,159.2,155.0,152.0,148.8,140.1,136.6,131.7,124.9,124.4,123.4,122.1,121.4,116.4,112.0,77.3,60.1,53.8,48.6,38.8,36.5,34.1,30.2,29.2,29.1,23.8,23.5,23.3,22.0,21.0.HR-MS(ESI):C34H42N6O,Calcd for[M+H]+551.3498；Found:551.3478。
实施例7：化合物7
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成5-溴戊酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物7为黄褐色粘性固体，产率56.2％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48–8.44(m,1H),8.19(d,J＝8.5Hz,0H),7.84(t,J＝5.7Hz,0H),7.73(td,J＝7.6,1.7Hz,1H),7.63(t,J＝7.5Hz,0H),7.48(d,J＝7.8Hz,1H),7.40(t,J＝7.3Hz,0H),7.24–7.20(m,1H),3.69(s,1H),3.54(q,J＝6.2Hz,1H),3.11(q,J＝6.4Hz,1H),2.92(t,J＝6.0Hz,1H),2.67(d,J＝5.7Hz,1H),2.41(s,1H),1.99(t,J＝6.4Hz,1H),1.84–1.75(m,2H),1.74–1.67(m,1H),1.44(s,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ175.5,172.8,162.6,156.3,150.5,148.8,138.3,137.1,132.6,125.3,124.4,123.5,122.7,119.9,115.6,111.5,59.5,53.7,46.3,44.0,35.7,35.6,30.8,29.7,28.3,25.3,23.4,21.9,20.6.HR-MS(ESI):C33H40N6O,Calcd for[M+H]+537.3342；Found:537.3326。
实施例8：化合物8
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,4-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成5-溴戊酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物8为黄褐色粘性固体，产率61.5％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48–8.44(m,1H),8.28(d,J＝8.6Hz,0H),7.78–7.69(m,2H),7.48(d,J＝7.8Hz,1H),7.25–7.20(m,1H),3.68(s,1H),3.02(q,J＝6.7Hz,1H),2.94(t,J＝5.5Hz,1H),2.66(d,J＝5.7Hz,1H),2.40(t,J＝6.4Hz,1H),1.96(t,J＝6.6Hz,1H),1.81(d,J＝5.4Hz,1H),1.64(p,J＝7.4Hz,1H),1.43(q,J＝8.6,8.0Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.9,162.5,159.2,155.4,151.3,148.8,139.3,136.7,132.1,125.0,124.5,123.4,122.2,120.6,116.0,111.8,60.0,53.6,48.1,38.5,35.9,29.7,28.8,27.8,26.6,25.7,23.4,23.4,21.8,20.8.HR-MS(ESI):C34H42N6O,Calcd for[M+H]+551.3498；Found:551.3487。
实施例9：化合物9
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,5-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成5-溴戊酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物9为黄褐色粘性固体，产率57.6％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.49–8.43(m,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,0H),7.77–7.69(m,1H),7.67(t,J＝5.5Hz,0H),7.56(t,J＝7.4Hz,0H),7.49(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(t,J＝7.5Hz,0H),7.25–7.19(m,1H),3.69(s,1H),3.44(q,J＝6.6Hz,1H),2.97(q,J＝6.7Hz,1H),2.91(t,J＝6.2Hz,1H),2.68(t,J＝6.0Hz,1H),2.42(t,J＝6.2Hz,1H),1.96(t,J＝6.5Hz,1H),1.80(dt,J＝10.8,5.9Hz,2H),1.57(p,J＝7.5Hz,1H),1.48–1.40(m,2H),1.34(q,J＝7.1Hz,1H),1.26(p,J＝8.0Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.7,168.2,159.2,155.5,150.9,148.7,139.0,136.7,132.1,125.0,124.6,123.3,122.1,120.2,115.8,111.2,59.9,53.6,48.4,38.7,36.0,30.1,29.0,28.3,25.7,23.8,23.5,23.4,21.8,20.7.HR-MS(ESI):C35H44N6O,Calcd for[M+H]+565.3655；Found:565.3649。
实施例10：化合物10
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成6-溴己酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物10为黄褐色粘性固体，产率66.7％，化合物结构数据表征：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.48(d,J＝4.8Hz,2H),8.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.65(t,J＝7.6Hz,2H),7.58(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,2H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.15–7.11(m,2H),6.76(t,J＝6.1Hz,1H),3.78(s,6H),3.42(q,J＝6.0Hz,2H),3.07(t,J＝5.9Hz,2H),2.70(t,J＝5.8Hz,2H),2.52(t,J＝7.2Hz,2H),2.23(t,J＝7.5Hz,2H),1.95–1.87(m,4H),1.87–1.82(m,2H),1.56(dt,J＝21.1,7.4Hz,4H),1.32–1.28(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ175.4,159.7,155.4,151.7,148.8,139.6,136.5,131.8,125.0,124.0,123.1,122.0,121.2,116.3,112.1,60.3,54.2,44.0,36.4,35.8,30.9,29.7,29.0,26.8,26.6,25.6,23.9,22.1,20.9.HR-MS(ESI):C34H42N6O,Calcdfor[M+H]+551.3498；Found:551.3486。
实施例11：化合物11
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,4-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成6-溴己酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物11为黄褐色粘性固体，产率62.8％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.46(ddd,J＝4.8,1.7,0.9Hz,2H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.78–7.71(m,4H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),7.45(t,J＝7.6Hz,1H),7.22(ddd,J＝7.4,4.9,1.0Hz,2H),3.69(s,4H),3.66–3.56(m,2H),3.01(q,J＝6.7Hz,2H),2.93(t,J＝5.9Hz,2H),2.66(t,J＝5.6Hz,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.96(t,J＝7.4Hz,2H),1.81(d,J＝5.4Hz,4H),1.61(p,J＝7.4Hz,2H),1.43(dq,J＝15.7,7.4Hz,4H),1.36(q,J＝7.5Hz,2H),1.16(q,J＝8.1Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.8,164.9,162.5,159.7,154.5,152.6,148.8,140.7,136.5,131.3,124.8,124.2,123.0,122.0,116.8,112.4,77.3,60.3,54.2,48.2,38.6,36.4,31.4,29.7,28.0,26.8,26.7,26.6,25.5,23.8,22.1,21.1.HR-MS(ESI):C35H44N6O,Calcd for[M+H]+565.3655；Found:565.3654。
实施例12：化合物12
的制备
按照实施例1的步骤制备，不同之处在于：将实施例1中的步骤3中的1,3-丙二胺换成1,5-丙二胺，步骤4中的3-溴丙酸甲酯换成6-溴己酸甲酯进行反应，最终得到目标化合物12为黄褐色粘性固体，产率68.4％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.47–8.44(m,2H),8.15(d,J＝8.5Hz,1H),7.77–7.70(m,3H),7.67(t,J＝5.5Hz,1H),7.58(t,J＝7.4Hz,1H),7.49(d,J＝7.8Hz,2H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),7.22(ddd,J＝7.4,4.9,1.0Hz,2H),3.69(s,4H),3.49–3.43(m,2H),2.97(q,J＝6.7Hz,2H),2.91(d,J＝6.0Hz,2H),2.68(t,J＝6.0Hz,2H),2.43–2.37(m,2H),1.97(t,J＝7.4Hz,2H),1.80(dt,J＝11.9,7.1Hz,4H),1.57(p,J＝7.5Hz,2H),1.45(p,J＝7.4Hz,2H),1.36(ddd,J＝18.0,14.8,7.3Hz,4H),1.26(dt,J＝12.7,6.2Hz,3H),1.17(p,J＝7.6Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.7,162.6,158.9,155.7,150.7,148.7,138.8,136.8,132.3,125.1,124.8,123.2,122.2,120.0,115.7,111.3,77.3,60.1,54.3,48.4,38.7,36.5,36.3,30.0,28.9,28.4,26.7,26.4,25.5,23.7,23.2,21.8,20.6.HR-MS(ESI):C36H46N6O,Calcd for[M+H]+579.3811；Found:579.3801。
实施例13：化合物13
的制备
在苯酚(23mmol)中加入9-氯-1，2，3，4-四氢吖啶(2.30mmol)、N，N-二甲基吡啶(3.46mmol)、催化量的碘化钾和三乙胺(0.1mL)，在氮气保护下于170℃搅拌反应4h。冷却至室温后，向反应体系中加入氢氧化钾溶液以除去剩余的苯酚。混合物在二氯甲烷(30mL)和水(30mL)之间分配。用水(30mL×3)洗涤有机提取物，干燥(硫酸镁)，减压除去二氯甲烷，得到粗产物。粗产物通过柱色谱纯化，得到目标化合物13为棕色粘性固体，产率45.5％，化合物结构数据表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.40(d,J＝4.1Hz,2H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.76(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(td,J＝7.7,1.6Hz,2H),7.49(t,J＝7.2Hz,1H),7.34(t,J＝7.3Hz,1H),7.20–7.13(m,4H),4.38(s,4H),2.86(t,J＝6.7Hz,2H),2.44(d,J＝6.2Hz,2H),1.67(p,J＝6.5Hz,2H),1.45(q,J＝5.8Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.3,162.6,159.5,158.1,149.4,136.5,129.3,128.1,125.6,125.3,124.6,123.2,122.4,58.8,32.4,26.7,22.5,22.2.HR-MS(ESI):C25H24N4,Calcd for[M+H]+381.2079；Found:381.2059。
实施例14：化合物14
的制备
将9-氯-1，2，3，4-四氢吖啶(2.30mmol)、色胺(2.53mmol)、催化量的碘化钾和三乙胺(0.1mmol)加入到二甲基甲酰胺(5mL)中，在氮气保护下于90℃搅拌反应17小时。冷却至室温后，混合物在二氯甲烷(30mL)和水(30mL)之间分配。用水(30mL×3)洗涤有机提取物，干燥(硫酸镁)，减压除去二氯甲烷，得到粗产物。粗产物通过柱色谱纯化，得到目标化合物14为棕色粘性固体，产率49.2％，化合物结构数据表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.10(dd,J＝8.5,1.3Hz,1H),7.71(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.52(ddd,J＝8.2,6.7,1.3Hz,1H),7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.31(s,0H),7.14(d,J＝2.3Hz,1H),7.06(ddd,J＝8.1,6.9,1.1Hz,1H),6.95(ddd,J＝8.0,6.9,1.0Hz,1H),3.76–3.69(m,2H),2.98(t,J＝7.5Hz,2H),2.89(t,J＝6.4Hz,2H),2.63(t,J＝6.3Hz,2H),1.84–1.78(m,2H),1.78–1.72(m,1H).13C NMR(151MHz,dmso)δ157.76,150.14,146.87,136.25,128.23,127.86,127.10,124.82,123.13,122.95,120.94,120.09,118.23,118.15,115.64,111.38,111.29,48.72,33.49,26.53,24.80,22.69,22.39.HR-MS(ESI):C23H23N3,Calcd for[M+H]+342.1970；Found:342.1955。
具体实施例三
上述实施例一或具体实施例二所制备的化合物在制备药物中的用途。所述药物是一种潜在的抗AD多靶点药物，能够高效抑制AChE，还可在体内外减弱Aβ神经毒性，显示出多靶点协同抗AD作用。
本发明使用小鼠作为阿尔兹海默病动物模型进行新型他克林化合物的治疗作用试验。
通过用Tukey-Kramer分离测试法在多个处理组之间进行比较来分析方差，以确定其统计显著性。可允许的显著性差异为p<0.05。
需要说明的是，本发明的上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体，如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；也可被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。另外，本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
实施例1
体外抑制AChE活性测定实验
处死小鼠，取小鼠大脑开展实验。按组织质量加入10倍体积裂解液充分混合，进行冰浴超声匀浆，3000rpm 4℃离心15分钟，收集上清液。将上清液与0.1M Na2HPO4(pH 7.5)混合，加入化合物3反应5分钟，添加底物碘代乙酰硫代胆碱(AChI,购自Sigma公司)，并在37℃下孵育30分钟。加入二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB,购自Life Science公司)与反应产物发生显色反应，产生黄色物质。使用Varioskan LUX多模式酶标仪(Thermo FisherScientifific,Waltham,MA,USA)测量412nm的吸光度。如图1所示，化合物3对AChE活性半抑制剂量(IC50)为7.13nM。同样条件下阳性对照donepezil的IC50为15nM。该结果表示化合物3(10μM浓度下)可高效抑制AChE且抑制效率强于donepezil。
实施例2
化合物3与AChE作用方式的探究
在上述AChE活性测定体系中，固定底物AChI浓度，改变AChE浓度，测定不同浓度化合物3对酶活力的影响。如图2所示，Lineweaver Burk双倒数作图结果表明化合物3非竞争性抑制AChE。如图3所示，Km＝1.37，抑制剂常数Ki＝2.7。
实施例3
体外抑制Aβ寡聚化实验(点印记)
取2μL加入不同浓度化合物3的Aβ寡聚体以及Aβ寡聚体空白对照，在PDVF膜上依次点样，风干后用5％BSA溶液封闭30分钟，再用抗寡聚物A11抗体或抗Aβ1-17单体6E10抗体孵育1小时。用1％TBST溶液清洗条带3次，再用二抗孵育一小时，用1wt％TBST清洗条带3次。将ECL显色液均匀滴加于条带表面，用曝光机曝光，所得数据用Image J灰度统计分析。如图4所示，实验结果表明，随着浓度的增加，化合物3阻止Aβ寡聚体形成的能力逐渐增强(***p<0.001，**p<0.01(ANOVA and Tukey’s Test))。
实施例4
化合物3与Aβ分子对接实验
使用SYBYL软件进行分子对接。小分子建模使用软件自带的Powell方法优化。使用Surflex-Dock程序模拟配体与受体的对接。使用该方法模拟时，受***置相对固定，受体可自由变化。模拟结束后可得到相应的分数(Surflex-Dock Score)越高，表明预测配体受体间的亲和力越强。如图5所示，化合物3与Aβ结合分数为-7.08，抑制率高达71.08，提示化合物3可能对Aβ有抑制作用。由于β折叠，Aβ五聚体分子结构中存在贯穿五个单体的“谷”，易与小分子化合物结合形成更稳固状态的Aβ，从而抑制其进一步寡聚。分子对接实验结果显示：化合物3可进入Aβ谷中。其中化合物3与Aβ17和34位的Leu之间有相互作用，提示化合物3会有利地结合到上述氨基酸残基，纵向地结合在一个分子组装“谷”的表面。因此，化合物3可通过众多的疏水相互作用与疏水袋(17位和34位的Leu残基)，作用于Aβ，从而产生改变Aβ组装进而稳定并抑制其寡聚的作用。
实施例5
酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠脑内炎症因子表达
取小鼠脑组织，加入0.5mL裂解液(10mM HEPES(pH 7.5)，1mM EGTA,1mM EDTA,0.5％Triton X-100and 150mM NaCl))，冰浴匀浆。13400rpm 4℃离心30分钟后取上清。使用ELISA试剂盒检测IL-1β和TNF-α的表达水平。如图6所示，化合物3可显著降低小鼠海马中IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达(***p<0.001，**p<0.01(ANOVA and Tukey’s Test))。
实施例6
MTT检测药物毒性
通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)分析以评估细胞活力。将5μM Aβ寡聚物和添加化合物3的Aβ寡聚物加入96孔板中，在37℃下培养24小时后加入10μL MTT。4小时后，加入100μL 10％SDS。16小时后，使用Varioskan LUX多模式酶标仪(ThermoFisher)在570nm和655nm的波长下测量样品的吸光度。如图7所示，2mM化合物3本身并不影响细胞增殖，也不会在实验浓度的反应过程中表现出细胞毒性效应。
实施例7
实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测iNOS表达
处死小鼠后，用Trizol试剂(购自Sigma公司)提取海马组织mRNA。然后使用逆转录酶将其转录为cDNA。使用Mx3005P多重定量PCR***(Aglient Stratagene,USA)进行定量PCR(qPCR)。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的引物序列为：F：GTTCTCAGCCCAACACATAATACAAGA，R：GTGGACGGGTCGATGTCAC。如图8所示，通过RT-PCR实验表明，化合物3降低了体外iNOS表达水平，提示其可能减轻神经炎症(***p<0.001，**p<0.01(ANOVA andTukey’s Test))。
实施例8
化合物3对Aβ寡聚体诱导的认知障碍小鼠行为影响实验
通过旷场试验我们发现化合物3并未损害小鼠运动能力(图9A-B)。通过Y迷宫检测，我们发现化合物3提高Aβ寡聚体诱导的认知障碍小鼠三维空间认知能力。与Aβ组相比，海马注射0.08mg他克林没有提高小鼠认知能力，海马注射0.1mg化合物3(p<0.05)与0.2mg化合物3(p<0.05)则显著提高认知障碍小鼠三维空间认识能力(图9C)。在新物体认知实验中，化合物3提高Aβ寡聚体诱导的认知障碍小鼠认知指数。与Aβ组相比，海马注射他克林组没有提高小鼠认知指数，海马注射0.1mg化合物3(p<0.05)与0.2mg化合物3(p<0.01)显著提高认知障碍小鼠认知指数(图9D)。与Aβ组相比，海马注射0.08mg他克林组(p<0.01)显著缩短了小鼠寻找平台时间且增加探索期小鼠在平台所在象限停留时间，0.1mg化合物3(p<0.01)与0.2mg化合物3(p<0.01)产生了更佳效果(图9E-H)。
实施例9
蛋白印迹法(Western blotting)检测小鼠海马内蛋白表达实验
小鼠经灌流取脑，加入RIPA-PIC-磷酸酶抑制剂裂解液提取蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将分离的蛋白转移至PDVF膜。加入5％脱脂奶粉封闭1h后，加入CREB、ERK、Tau一抗蛋白4℃孵育过夜。用TBST洗涤4次后加入对应二抗孵育2h，再用TBST洗涤4次。用ECL试剂盒检测蛋白条带，放入曝光机中曝光，分析条带光密度值计算蛋白表达水平，取三次结果求平均值。如图10-12所示，化合物3能明显抑制小鼠海马内CREB蛋白、ERK蛋白和Tau蛋白磷酸化。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物，其特征在于：所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物以他克林为母核，具有式Ⅰ所示结构式，具体如下：
式Ⅰ
其中，R1为H、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数为1-5的直链烷烃，n=1，2，3，4或5，m=1，2，3，4或5。
2.一种权利要求1所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）使式III化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式IV化合物；
（2）使式IV化合物与式V化合物在三氯氧磷中反应，获得式VI化合物；
（3）使式VI化合物与式VII化合物在苯酚中反应，获得式VIII化合物；
（4）使式IX化合物与式X所示化合物在氮气保护下反应，获得式XI所示化合物；
（5）使式XI化合物和氢氧化钠在甲醇水溶液中反应，获得式
化合物；
（6）使式XII化合物、式VIII化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯在N,N-二甲基甲酰胺中反应后，再加入N,N-二异丙基乙胺反应，获得式
化合物，
式Ⅰ
其中，R1为H、OCH3、OCH2CH3、Cl、Br、CF3、NO2、NH2或碳原子数为1-5的直链烷烃，n=1，2，3，4或5，m=1，2，3，4或5。
3.根据权利要求2所述的一种1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：于40℃下，将式III所示化合物、氢氧化钠按照1:1.3摩尔比溶于等体积比混合的甲醇水溶液中反应6小时，即获得式IV所示化合物；
步骤（2）具体为：于0℃下，将式IV所示化合物和式V所示化合物按照1:1.2摩尔比加入三氯氧磷中，转移到110℃下反应6小时，获得式VI所示化合物；
步骤（3）具体为：于170℃下，以碘化钾为催化剂，将式VI所示化合物和式VII所示化合物按照1:2.1摩尔比加入苯酚中反应4小时，获得式VIII所示化合物；
步骤（4）具体为：于60℃下，以碘化钾为催化剂，以三乙胺为碱，将式IX所示化合物与式X所示化合物按照1.1:1摩尔比加入DMF中，在氮气保护下过夜反应，获得式XI所示化合物；
步骤（5）具体为：于50℃下，将式XI所示化合物与氢氧化钠按照1:1.5摩尔比溶于由体积比4:1混合成的甲醇水溶液中，过夜反应，获得式XII所示化合物；
步骤（6）具体为：于室温下，将式XII所示化合物、式VIII所示化合物和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯按照1：1：1.5摩尔比混合后加入DMF中反应20分钟后，加入式XII所示化合物2倍摩尔比的N,N-二异丙基乙胺，反应6-8小时，获得式
所示化合物。
4.权利要求1中所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备抗阿尔兹海默病药物方面的应用。
5.权利要求1中所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备延缓神经退行性疾病药物方面的应用。
6.权利要求1中所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体外修复胆碱能神经元药物方面的应用。
7.权利要求1中所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体外抗氧化应激损伤活性药物方面的应用。
8.权利要求1中所述的1,2,3,4-四氢吖啶-9-胺类化合物在制备体内外减轻β-淀粉样蛋白神经毒性药物方面的应用。
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