CN112391441B - 一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物敏感性检测领域，具体为一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，步骤包括：S1、工作液的制备；S2、分别用替代液和利福平工作液对分析菌液处理10天或14天；S3：将经过处理的菌液分别进行染色；S4：对染色后的菌液分别进行检测，记录各菌液的平均荧光强度值，并计算其敏感指数，并根据敏感指数判断其对利福平的敏感性：当敏感指数大于临界值时判断所检结核分枝杆菌为异质性耐药结核分枝杆菌或耐药结核分枝杆菌；当敏感指数低于临界值时判断为敏感菌；临界值范围为0.48或0.37。本发明方法准确度较高，10天即可快速获得结核分枝杆菌利福平异质性耐药的检测结果，高准确率、敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及药物敏感性检测领域，特别是涉及一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法。
背景技术
流式细胞术具有高通量、多参数、高效等优点，越来越多的被应用于微生物药敏检测。检测细菌药物敏感性的本质是监测细菌在药物处理后的活力，流式细胞术正是通过监测不同状态下的细菌与荧光染料作用后荧光值的差异来反应细菌活力的。敏感菌经抗生素作用后活力下降，耐药菌活力则无变化，如果不同活力或功能状态的微生物与特定的荧光染料结合后会发出不同强度的荧光，则通过检测荧光强度的变化即可判断细菌的药敏信息。荧光素双醋酸酯是一种具有细胞膜透性的疏水荧光素衍生物，当进入细胞后可被细胞内的酯酶催化水解生成发绿色荧光的荧光素，不具有完整细胞膜或新陈代谢活性弱的死细胞因酯酶失活而不能水解荧光素双醋酸酯，因此荧光素双醋酸酯常被用于细胞活力的检测。目前基于这类染料的流式细胞术逐渐成为白色念珠菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物药物敏感性快速检测的方法之一。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， MTB)，是结核病的病原体，目前仍是全球最主要的公共卫生问题之一。近年来，由于用药不合理、其他药物使用的副作用或食品安全、环境等因素导致人类群体免疫力下降等原因，MTB快速地表现出了耐药性，且有增强趋势。在尚未有新药问世的情况下，准确的耐药性检测成为了治疗MTB引起的结核病的重要辅助环节。目前也已经有很多学者在做这方面的研究。
异质性耐药是一种特殊的耐药现象。虽然目前耐药性检测技术已经趋于成熟，比如传统的比例法DST是可靠性强和灵敏度高的检测耐药的方法，但是要检测并得到病原菌的异质性耐药情况，就目前的技术而言，则必须依赖基因学检测技术。但基因学检测存在只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，无法识别未明确的耐药基因的缺陷，最终会影响检测准确率，使检测结果的临床参考价值降低。
目前，尚未见其他更准确、便捷的技术手段有效地应用于结核分枝杆菌异质性耐药检测中。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，利用基于荧光素双醋酸酯的流式细胞术，检测结核分枝杆菌的利福平异质性耐药，其原理基于表型，但大大缩短了检测时间，比比例法和绝对浓度法快速、高效，比基因型法准确。而且由于其基于表型，不依赖于耐药基因是否明确，因此除了利福平，也可以拓展应用于结核分枝杆菌其它药物的异质性耐药检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其步骤包括：
S1、工作液的制备：分别制备荧光素双醋酸酯染色液、利福平工作液和结核分枝杆菌分析菌液；
S2、对分析菌液进行药物处理：将分析菌液分为对照组和试验组，分别用替代液和利福平工作液对对照组和实验组的分析菌液处理10～14天；
S3：将S2中经过处理的结核分枝杆菌菌液分别进行染色；
S4：分别进行检测，记录各菌液的平均荧光强度值，并计算其敏感指数，再根据敏感指数判断其对利福平的敏感性；
所述敏感指数的计算方法为：敏感指数=实验组平均荧光强度/对照组平均荧光强度；
所述利福平的敏感性的评估标准为：当敏感指数大于临界值时判断所检结核分枝杆菌为异质性耐药结核分枝杆菌；当敏感指数低于临界值时判断为敏感菌；
所述临界值范围为0.48～0.37；所述临界值与处理天数呈反比关系；
所述替代液为不含任何抗结核分枝杆菌物质的液体。
优选的，步骤S2中处理时间为10天时，步骤S4中的临界值为0.48；步骤S2中处理时间为14天时，步骤S4中的临界值为0.37。
进一步的，S1中所述的双醋酸酯工作液的制备，具体操作包括：取出荧光素双醋酸酯荧光染料贮存液，在避光情况下解冻并应用 PBS稀释配制成0.5μg/mL的荧光素双醋酸酯染色液。
进一步的，S1中所述的利福平工作液的制备，具体操作包括：从冰箱内取出利福平贮存液，室温下解冻，用生理盐水稀释成浓度为500μg/mL的利福平工作液，备用。此处利福平工作液的浓度理论上可以使用任意浓度，设置为500μg/mL是兼顾后续操作中药物终浓度和麦氏浊度的可控性而所选择的最佳的利福平工作液浓度，在维持药物终浓度的前提下，尽量减少所加的药物工作液的体积，以使菌液的麦氏浊度更容易被准确控制。
进一步的，S1中所述的结核分枝杆菌分析菌液的制备，具体操作包括：蘸取培养液将结核分枝杆菌菌体研磨成菌液匀浆，加入适量培养液混匀，使用滤网过滤，再配置成1麦氏浊度菌液，备用。
进一步的，所述培养液包括7H9 培养液；在不同培养液中结核分枝杆菌生长速度不同，其对应的敏感指数的临界值也会不同，本发明中的敏感指数临界值适用于7H9 培养液、成分等同于7H9 培养液的培养基质，或者其培养效果等同于7H9 培养液的培养基质；理论上来说，对于其他培养液该方法依然适用，但需要根据结核分枝杆菌的生长速度确定其敏感指数临界值。
进一步的，所述步骤S2中的具体操作方法包括：设置对照组和实验组；其中，实验组的处理方法包括：充分混匀菌液，移取一定量菌液于无菌试管中，加入利福平工作液，配置成含有利福平的终浓度为50μg/mL、麦氏浊度为0.9的菌液，置于恒温中孵育；
对照组的处理方法包括：充分混匀菌液，移取与实验组的菌液体积相同的同一样本的菌液于无菌试管中，再加入替代液将菌液体积补至与实验组的菌液体积相同，充分混匀，置于恒温中孵育。
所述实验组与对照组的孵育温度、孵育时间等孵育环境和孵育条件完全相同。
优选的，所述替代液包括生理盐水、无菌水等。
进一步的，步骤S2中所述的孵育操作的孵育温度为35～37℃，孵育时间为10～14天；优选37℃恒温孵育10天。
进一步的，所述步骤S3中对结核分枝杆菌菌液进行的染色处理，包括：分别移取实验管与对照管中的菌液，分别进行离心处理，去掉上清液，往沉淀中加入生理盐水，用无菌玻璃棒蘸取菌液将菌研磨成菌液匀浆，震荡重悬获得悬液，再用细菌超声分散仪分散，经滤网滤过后，移取所得菌液于流式上样管中，加入与菌液等体积的双醋酸酯工作液，混匀，避光染色30 min。
采用生理盐水稀释沉淀和手工研磨，可是使细菌分散程度更好，避免了因菌体堆积或相互黏连叠加造成染色不完全或不均匀，导致荧光强度值不准确，最终影响敏感指数的计算。手工研磨分散后用超声分散仪分散，可以进一步保证菌液的分散程度，增加整个方法操作的效率和结果的准确性。
进一步的，所述步骤S3中的离心条件为13000 rpm 离心10 min。
进一步的，所述步骤S3中往沉淀中加入生理盐水的量为所移取的菌液等体积的生理盐水。
进一步的，所述步骤S3中的超声分散仪的分散操作方法包括：超声5秒和暂停5 秒两种工序相间进行，共持续30秒。
进一步的，所述步骤S1和步骤S3中所使用的滤网均为300目的滤网。
本发明的有益效果：
异质性耐药是导致DST和基因学耐药检测结果不相符合的主要原因，培养基中所需药物的浓度和效价以及实验室操作人员的熟练程度都会决定药敏试验结果准确性。本发明的方法优化了实验操作标准（比如培养液选择、染色前预处理操作等等），便于实验人员统一执行，同时本发明的检测方法还提供了最佳的数值关系，避免了操作过程中的实验误差累计（比如试剂浓度转换时的误差、麦氏浊度的误差等误差的累计），并体现为对最终评估结果的较大影响。本发明方法对待检的结核分枝杆菌菌液采用利福平终浓度50μg/mL处理10天，基于荧光素双醋酸酯的流式细胞术可有效区分利福平全敏结核分枝杆菌和含25%的利福平耐药结核分枝杆菌的异质菌液样本，其检测的灵敏度和特异度最佳，分别为96.2%和96.7%。本发明方法可在10天快速获得结核分枝杆菌利福平异质性耐药的检测结果，且准确度较高（93.33%），比比例法快速（4-6周），比基因型法准确（66.67%）。
附图说明
图1是含利福平耐药结核分枝杆菌占比为25%（即含75%的敏感菌）、50%（即含50%的敏感菌）的菌液样本与含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%（即含100%的敏感菌）的菌液样本经本发明的检测方法处理10天时得到的敏感指数的分布对比。其中0%、25%、50%、分别代表菌液样本中所含利福平耐药菌株的比例，0.48为该方法检测利福平异质性耐药结核分枝杆菌菌株与利福平敏感结核分枝杆菌菌株的界值。
图2是含利福平耐药结核分枝杆菌占比为75%（即含25%的敏感菌）和100%（即含0%的敏感菌）的菌液样本与含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%（即含100%的敏感菌）的菌液样本经本发明的检测方法处理10天时得到的敏感指数的分布对比。其中0%、75%、100%分别代表菌液样本中所含利福平耐药菌株的比例，0.48为该方法检测利福平异质性耐药结核分枝杆菌菌株与利福平敏感结核分枝杆菌菌株的界值。
图3是含利福平耐药结核分枝杆菌占比为25%（即含75%的敏感菌）、50%（即含50%的敏感菌）的菌液样本与含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%（即含100%的敏感菌）的菌液样本经本发明的检测方法处理14天时得到的敏感指数的分布对比。其中0%、25%、50%分别代表菌液样本中所含利福平耐药菌株的比例，0.37为该方法检测利福平异质性耐药结核分枝杆菌菌株与利福平敏感结核分枝杆菌菌株的界值。
图4是含利福平耐药结核分枝杆菌占比为75%（即含25%的敏感菌）和100%（即含0%的敏感菌）的菌液样本与含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%（即含100%的敏感菌）的菌液样本经本发明的检测方法处理14天时得到的敏感指数的分布对比。其中0%、75%、100%分别代表菌液样本中所含利福平耐药菌株的比例，0.37为该方法检测利福平异质性耐药结核分枝杆菌菌株与利福平敏感结核分枝杆菌菌株的界值。
具体实施方式
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本申请实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例一 本发明的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法
1.1 设备与材料
流式细胞仪 FACSAriaTM Ⅱ为美国BD公司生产，细菌超声分散仪BACspreaderTM1100为广东体必康生物科技有限公司生产；300目不锈钢细胞滤网购自翔博生物科技有限公司，Middlebrook 7H10固体培养基和Middlebrook 7H9液体培养基购自美国BD公司，荧光素双醋酸酯购自美国LIFE公司，PBS（pH 7.4±0.1）购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。
1.2 鉴定方法
S1、工作液的制备：
荧光素双醋酸酯荧光染料：取出荧光素双醋酸酯荧光染料贮存液，在避光情况下解冻并应用PBS稀释配制0.5μg/mL的工作液。
利福平工作液的制备：从-80℃冰箱内取出浓度为2×10 4μg/mL 的利福平贮存液，室温下解冻，待完全溶解之后用生理盐水稀释成浓度为500μg/mL的利福平工作液，备用。
分析菌液的制备：用无菌玻璃棒蘸取7H9培养液将结核分枝杆菌菌体研磨成菌液匀浆，加入适量7H9培养液混匀，使用300目无菌不锈钢滤网过滤，得到菌液；使用细菌超声分散计数仪进行比浊，配置成1麦氏浊度菌悬液，备用。
S2、分析菌液的药物处理：
充分混匀S1的菌液，移取1800μL菌液于无菌试管中，再加入200μL生理盐水，盖紧盖子，充分混匀，置于37℃（可替代为35～37℃之间的任意温度）恒温箱中孵育10天（可替代为10～14天之间的任意天数），即为对照管。充分混匀S1的菌液，移取1800μL菌液于无菌试管中，加入200μL利福平工作液，配置利福平终浓度为50μg/mL的菌液，置于37℃（可替代为35～37℃之间的任意温度）恒温箱中孵育10天（可替代为10～14天之间的任意天数）。
S3、结核分枝杆菌菌悬液样品的染色：从恒温箱中取出实验管与对照管，各移取1000μL菌液于高温灭菌EP管中，进行13000 rpm离心10 min，然后去掉上清液，剩下沉淀，往沉淀中加入1000μL生理盐水，用无菌玻璃棒蘸取无菌生理盐水将菌研磨成菌液匀浆，震荡重悬获得悬液，再用细菌超声分散仪分散（超声5秒和暂停5 秒两种工序相间进行，共持续30秒），经300目不锈钢细胞滤网滤过后，移取300μL菌液于流式上样管中，加入 300μL荧光素双醋酸酯荧光染料工作液，混匀，避光染色30 min。
S4、用流式细胞仪对S3染色后的菌液进行检测，记录其平均荧光强度值，并计算其敏感指数；再根据敏感指数判断其对利福平的敏感性；其中，
敏感指数=实验管平均荧光强度/对照管平均荧光强度；
敏感耐药界值：当敏感指数大于临界值时判断待检结核分枝杆菌为异质性耐药结核分枝杆菌，低于临界值时判断为利福平敏感菌。
临界值的选择范围为0.48～0.37，所述临界值与处理天数呈反比关系。当处理时间在10至14天之间时（含10天和14天），理论上0.48～0.37的范围内的任意临界值均可适用，只是在检测准确度、灵敏度和特异性上会有差别。本发明优选方案为：步骤S2中处理时间为10天时，步骤S4中的临界值为0.48；步骤S2中处理时间为14天时，步骤S4中的临界值为0.37。
实施例二利用本发明方法对利福平异质性耐药的结核分枝杆菌进行检测
取已经确定为利福平异质性耐药的结核分枝杆菌30株和利福平敏感的结核分枝杆菌，每种耐药菌株分别配置5个菌液样本，5个菌液样本分别是包含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%（即含100%的敏感菌）、25%（即含75%的敏感菌）、50%（即含50%的敏感菌）、75%（即含25%的敏感菌）和100%（即含0%的敏感菌）的菌液样本。
按照实施例1的操作方法，将上述配置好的150份菌液样本分别按实施例一的方法进行检测，药物（利福平终浓度为50μg/mL）处理第10天和第14天时，分别取样，染色、检测，计算出各自的敏感指数，并制作分布图（参见图1至图4），其中图1为含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%、25%、50%的浓度组的菌液样本（每个浓度组均含有30株利福平异质性耐药的结核分枝杆菌的样本）处理第10天时各样本的敏感指数分布；图2为含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%、75%、100%的浓度组的菌液样本处理第10天时各样本的敏感指数分布；图3为含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%、25%、50%的浓度组的菌液样本处理第14天时各样本的敏感指数分布；图4为含利福平耐药结核分枝杆菌占比为0%、75%、100%的浓度组的菌液样本处理第14天时各样本的敏感指数分布。再作ROC曲线分析，结果参见表1。
表1：经处理的菌液荧光素双醋酸酯染色敏感指数的ROC曲线分析结果
说明：“0% vs 25%”指结核分枝杆菌异质菌液样本中利福平耐药结核分枝杆菌比例为0%的菌液与25%菌液之间的比较；余同。
可以看出：处理10天和14天时，基于荧光素双醋酸酯的流式细胞术均可区分含不同比例耐药菌的菌液样本，其中以对含有利福平耐药结核分枝杆菌为0%和25% 的异质菌液样本鉴别效果最好，对其它比例样本之间的检测性能差异不明显。
本发明方法用10天时间即可快速获得结核分枝杆菌利福平异质性耐药的检测结果，用0.48的临界值标准区分利福平全敏结核分枝杆菌和含25%的利福平耐药结核分枝杆菌的异质菌液样本，其检测效果最佳，灵敏度和特异度分别为96.2%和96.7%，准确度较高达93.33%。在14天时，用0.37的界值标准对利福平全敏结核分枝杆菌和含25%的利福平耐药结核分枝杆菌的异质菌液样本进行鉴别，其检测效果也较好，灵敏度和特异度分别为96.7%和93.3%。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：
S1、工作液的制备：包括利福平工作液和结核分枝杆菌分析菌液的配制；
S2、设置对照组和实验组；
所述实验组的处理方法包括：移取一定量的S1中制得的菌液，加入利福平工作液，配置成含有利福平的终浓度为50μg/mL、麦氏浊度为0.9的菌液，于35～37℃恒温孵育10天或14天；
所述对照组的处理方法包括：移取与实验组的菌液体积相同的S1中制得的菌液，加入替代液生理盐水将菌液体积补至与所述实验组的菌液体积相同，于35～37℃恒温孵育10天或14天；
S3：分别移取S2中经过处理的实验组与对照组中的菌液，进行离心处理，去掉上清液，往沉淀中加入生理盐水，用无菌玻璃棒蘸取无菌生理盐水将菌研磨成菌液匀浆，震荡重悬，再分散，经滤网滤过后，移取所得菌液，加入荧光素双醋酸酯染色液，避光染色30 min；
S4：对S3中染色后的菌液分别进行检测，记录各菌液的平均荧光强度值，计算敏感指数，并根据敏感指数判断所检结核分枝杆菌对利福平的敏感性；
所述敏感指数的计算方法为：敏感指数=实验组平均荧光强度/对照组平均荧光强度；
所述利福平的敏感性的评估标准为：当敏感指数大于临界值时判断所检结核分枝杆菌为异质性耐药结核分枝杆菌；当敏感指数低于临界值时判断所检结核分枝杆菌为敏感菌；
所述临界值为0.48或0.37；具体为：所述步骤S2中处理时间为10天时，所述步骤S4中的临界值为0.48；所述步骤S2中处理时间为14天时，所述步骤S4中的临界值为0.37；
所述替代液为不含任何抗结核分枝杆菌的物质的液体。
2.根据权利要求1所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述S1中的利福平工作液的制备，具体操作包括：配制浓度为500μg/mL的利福平工作液。
3.根据权利要求1所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述S1中的结核分枝杆菌分析菌液的制备，具体操作包括：蘸取培养液将结核分枝杆菌菌体研磨成菌液匀浆，加入适量培养液混匀，使用滤网过滤，再配置成1麦氏浊度的菌液。
4.根据权利要求3所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述培养液包括7H9培养液。
5.根据权利要求1所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述步骤S3中的离心条件为13000 rpm 离心10 min。
6.根据权利要求1所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述步骤S3中的再分散操作方法包括：用超声分散仪，超声5秒和暂停5 秒两种工序相间进行，共持续30秒。
7.根据权利要求1或权利要求3所述的基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其特征在于，所述滤网为300目的滤网。
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