CN112387262B - 一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固定相及应用 - Google Patents

一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固定相及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固定相及应用，所述基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法包括，光催化交联，向蛋白溶液中依次加入三(2，2'‑联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和过硫酸铵，光照下进行光催化交联反应；固载，取经过修饰偶联的硅胶，加入经过光催化交联的蛋白溶液，充分搅拌、抽滤、烘干，得到本发明的手性固定相。本发明的BSA‑CSP是一类全新结构的手性分离固定相，可适用于包括氨基酸在内的、与蛋白序列有一定结合能力的化学品的手性拆分。

Description

一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固 定相及应用
技术领域
本发明属于手性分离技术领域，具体涉及到一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固定相及应用。
背景技术
手性，表述为物体与其镜像不同，是一种广泛存在于自然界中的特殊对称形式。手性物体与其镜像被称为对映体，这些对映体的基团空间排列顺序不同，往往会对其生理活性产生差异，构型不同的对映体在药理活性和毒副作用等方面也会表现出很大的差异。
单一对映体在自然界中含量有限，当生活中大量需要这种物质时，往往需要由人工合成。然而，单一对映体的不对称合成比较困难，工业上往往首先得到的是外消旋体，即是两种对映体同比例的混合物。这导致，一方面没有价值的无生理活性的对映体同时被合成出来会造成原材料的浪费，增加整个产品的生产成本；另一方面两种对映体的生理活性甚至毒性往往有着明显差异，不加以区分往往带来毁灭性后果，比如1969年的沙利度胺(Thalidomide)事件，导致约1.3万海豹儿的诞生，数以万计的孕妇深受其害。因此，手性分离在化学工业，特别是制药产业中非常重要。
手性拆分的方法有多种，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管电泳法(CE)、毛细管电色谱法(CEC)、模拟移动床色谱技术(SMB)和高效液相色谱法(HPLC)等。其中，HPLC法由于具有测定对映体速度快、柱效高、分离能力强和应用范围广等特点，是目前手性分离中应用最多的方法。
手性固定相法作为高效液相色谱最常用的方法，手性固定相的开发与制备是其核心所在。手性固定相的合成按照合成思路主要可分为键合型和涂敷型两种方式。按照分离的机理可将其分为独立型固定相和协同型固定相两种，其更具体的分类主要分为刷型、环糊精型、大环抗生素型、冠醚型、配体交换型、多糖型和蛋白质型等。
蛋白质类手性固定相是指将蛋白质类物质固定到适合的载体上，获得手性色谱固定相填料柱或手性整体柱。蛋白质是生物体内重要的组成物质，是一类天然生物聚合物，它们是由氨基酸或者氨基酸和糖组成，这些都是具有手性的，因此所有的蛋白质都具有手性识别能力。然而，由于蛋白质大多稳定性较差，且活性反应基团众多，难以将其均一性地键合在适当的载体上，目前仅有很少一部分的蛋白被用于手性分析，如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、糖蛋白(Glycoproteins)、卵类粘蛋白(Ovomucoid)、抗生物素蛋白(Avidin)等。制备基于蛋白质的CSP的固定化方法包括物理吸附、共价固定化和包封。物理吸附的主要优点是简单，这种方法通常是在适当的pH值和溶液条件下通过柱泵输送蛋白质溶液进行吸附。这种技术可用于快速评估CSPs中使用的新候选蛋白质。但其缺点是，通过物理吸附制备的CSP由于吸附蛋白与载体之间存在弱相互作用而可能存在稳定性问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法、手性固定相及应用，通过光诱导未修饰蛋白(PICUP)交联新技术获得富含β折叠结构的BSA聚集体，这些聚集体结构相对单一，在与载体硅胶交联后，可改善BSA直接交联导致的活性中心结构不均一的问题，同时可增大疏水表面以及与化合物接触的面积，预期可制备出对包括氨基酸在内的多种与蛋白有交互作用的化学品有较强分离性能的手性固定相。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法，包括，
光催化交联，向蛋白溶液中依次加入三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和过硫酸铵，光照下进行光催化交联反应；
固载，取经过修饰偶联的硅胶，加入经过光催化交联的蛋白溶液，充分搅拌、抽滤、烘干，得到本发明的手性固定相。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述蛋白，包括牛血清白蛋白、血清白蛋白、溶菌酶、胰岛素中的一种。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述蛋白溶液的浓度为0.5～15mg/ml。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述蛋白溶液、所述三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和所述过硫酸铵的摩尔比为1:3～5:60～100。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述光照，置于200W的白炽灯下，光照时间5～60s。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述经过修饰偶联的硅胶与所述经过光催化交联的蛋白溶液的质量体积比为1:1～10。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述经过修饰偶联的硅胶，为经过巯基化修饰、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联的硅胶。
作为本发明所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法的一种优选方案，其中：所述抽滤，抽滤后采用PBS缓冲液多次清洗并抽滤。
本发明还提供了如下技术方案：一种基于光催化交联蛋白的手性固定相，其经过如上述任一项所述的基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备方法所制备得到，包括键合在固体载体上的手性拆分剂，所述固体载体为经过修饰偶联的硅胶，所述手性拆分剂为经过光催化交联的蛋白，所述蛋白包括牛血清白蛋白、血清白蛋白、溶菌酶、胰岛素中的一种。
本发明还提供了如下技术方案：一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的应用，所述基于光催化交联蛋白的手性固定相，用于色谱法的固定相，用以分离含氨基酸的化合物，特别是手性氨基酸的拆分。
本发明有益效果：
本发明利用γ-巯丙基三甲氧基硅烷活化修饰的硅胶与4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯反应偶联，并加入光催化交联的牛血清白蛋白，获得了富含β折叠结构的牛血清白蛋白固定相(BSA-CSP)。该聚集体结构相对单一，在与载体硅胶交联后，可改善BSA直接交联导致的活性中心结构不均一的问题，同时可增大疏水表面以及与化合物接触的面积，本发明所得固定相是由富含β折叠的纤维化蛋白作为疏水相，硅胶及蛋白的亲水部分为亲水相，其疏水面积大；由于是由氨基酸组成的蛋白作为疏水相，故而对氨基酸、多肽、蛋白质等具有更好地相互作用；所形成的β折叠结构，结构单一具有较好的均一性及稳定性；由于蛋白是由左旋氨基酸组成故而对手性氨基酸有不同的作用力，适合手性氨基酸的分离，因而可以对氨基酸的手性拆分有优异的效果。鉴于此，本发明的BSA-CSP是一类全新结构的手性分离固定相，可适用于包括氨基酸在内的、与蛋白序列有一定结合能力的化学品的手性拆分。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明BSA-CSP的合成路线图；
图2为本发明的BSA-CSP与硅胶的对比图；
图3为本发明光催化交联蛋白反应的时间条件对比图；
图4为本发明SDS-PAGE试验电泳图；
图5为本发明FTIR分别测量硅胶、修饰硅胶、修饰硅胶固载BSA的对比图；
图6为本发明FTIR分别测量BSA、光交联BSA的对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
光催化交联牛血清白蛋白试验，取一50mL离心管，向其中加入10mg/mL的牛血清白蛋白溶液，再依次加入0.0125M的三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和0.25M的过硫酸铵(APS)，然后置于200W的白炽灯下，进行光催化交联反应。并进行如下试验。
SDS-PAGE试验
参照《分子克隆实验指南》，配制电泳试剂、分离胶、积层胶。首先组装玻璃板确定制作1mm厚的10孔梳齿凝胶，按照表1中分离胶配方依次加入试剂混匀。将混匀的丙烯酰胺溶液倒入电泳设备玻璃板的间隙内，小心加入去离子水覆盖丙烯酰胺溶液，等待聚合完成。聚合后用去离子水冲洗未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸吸去残留的去离子水。接着配制积层胶溶液，向分离胶上方倒入积层胶混合液，立即***10孔的梳子，注意避免引入气泡，等待积层胶聚合。聚合完成后取下梳子，用去离子水洗去孔内残留的丙烯酰胺，将制成的凝胶放入电泳设备，向电泳槽的上槽与下槽加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
表1电泳胶配方表
Figure BDA0002769414550000051
取7个离心管(10mL)按照表2配制好试样，用旋涡混合仪充分混匀，温水浴50℃半小时变性，待冷却至室温后，用微量进样器按照表中进样量依次加样到胶孔底部；另外取3个离心管(10mL)，加入电泳缓冲液作为空白对照组。将电泳设备连接到电泳仪电源上，设置电压为80V，电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后从装置中小心取下凝胶，将凝胶浸没在5倍体积的考马斯亮蓝染色液中，置于低速摇床室温染色至少4h。染色完成后，弃去染色液，用水简单冲洗凝胶，将凝胶置于脱色液中脱色4～8小时。脱色结束后拍照观察分析，结果如图3、图4所示。
表2光催化交联蛋白电泳条件对比表
Figure BDA0002769414550000061
图3为光催化条件时间对比，A～E依次为牛血清白蛋白溶液加入光交联物质光照0s、5s、10s、30s、60s、90s。实验观察得D、E、F管光照超过30s管内溶液颜色由黄转为淡绿色；A管未光照无蛋白絮状物，其余管经光照反应的均产生蛋白絮状物，且光照时长在10s内的产生较多蛋白絮状物。
图4为电泳图，其中1～7孔所加样品分别对应表2内的1～7样品，8～10孔进的试样为SDS凝胶加样缓冲液。由图4可以看出，空白对照1与交联未光照对照2的孔内均未有蛋白多聚体残留，牛血清白蛋白在电泳图上有明显蛋白条带显示且孔1与孔2蛋白条带基本相持平。3～7孔为PICUP蛋白时间组，明显可见牛血清白蛋白经光催化交联后明显产生蛋白多聚体，且光照时间在10s内的3孔(5s)、4孔(10s)产生较多的蛋白多聚体。因此进行光催化交联时间应控制在10s完成，以期获得较好的光催化交联蛋白手性固定相。
实施例2
基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备：
(1)活化硅胶的制备
称取20g硅胶，溶于60ml HCl中(6.0M)，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性。最后，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用。
(2)巯基化修饰：
首先，将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中。加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h。取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净。
(3)4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的偶联
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出，放置阴凉通风处风干。
(4)光催化交联牛血清白蛋白
取一50mL离心管(用锡纸包裹避光)，向其中加入30ml浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液，再依次加入1mL的0.0125M的三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和1mL的0.25M的过硫酸铵(APS)，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s。
(5)活化修饰硅胶固载牛血清白蛋白
取10g修饰过偶联的硅胶放入20mL小烧杯中，加入光催化交联后的牛血清白蛋白溶液，用玻璃棒充分搅拌使交联的牛血清白蛋白尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用PBS缓液(PH＝7.4)多次清洗，抽滤。最后37℃烘干制得牛血清白蛋白手性固定相(BSA-CSP)。
图1为本发明BSA-CSP的合成路线图；图2显示了硅胶与BSA-CSP的宏观对比，将样品进行如下试验。
傅里叶变换红外光谱试验
傅里叶变换红外光谱(FTIR)可以对牛血清白蛋白所含有的特征基团进行定性分析，本实验对牛血清白蛋白手性固定相、修饰硅胶、未做处理硅胶、牛血清白蛋白溶液、经PICUP处理的BSA溶液进行红外表征。BSA-CSP、修饰硅胶、未做处理硅胶为固体组，实验步骤为：取适量溴化钾固体，加入待表征的样品(按照样品：溴化钾＝1:100比例混合)。一同研磨至粉末状，倒入模具中然后使用压片机压成能够顺利透过光路的透明薄片，取出模具放入FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪中扫描(扫描前先测空气背景)，扫描次数设置为4次，扫描范围设置为4500cm-1～400cm-1。牛血清白蛋白溶液与经PICUP处理的BSA为液体组，实验步骤为：直接用纯溴化钾制成薄片，将待测溶液滴一滴至薄片中央，迅速进行扫描，扫描条件与固体组相同。结果如图5、图6所示。
图5为FTIR分别测量硅胶、修饰硅胶、修饰硅胶固载BSA。由图5可知，硅胶在3500cm-1出现伸缩振动，判断为硅胶的羟基伸缩振动吸收，硅胶经修饰处理与修饰硅胶固载BSA羟基的伸缩振动明显向右偏移，说明γ-巯丙基三甲氧基硅烷与GMBS成功键合在硅胶上。
图6为FTIR分别测量BSA、光交联BSA。从图6中可看出在1700cm-1～1600cm-1酰胺带之间出现C＝O的伸缩振动，并且光催化交联的BSA出现蛋白二级结构增多的现象，表明光催化交联技术的运用使得BSA得到富含β折叠的二级结构。
实施例3
基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备：
(1)活化硅胶的制备
称取20g硅胶，溶于60ml HCl中(6.0M)，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性。最后，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用。
(2)巯基化修饰：
首先，将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中。加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h。取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净。
(3)4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的偶联
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出，放置阴凉通风处风干。
(4)光催化交联牛血清白蛋白
取一50mL离心管(用锡纸包裹避光)，向其中加入30ml浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液，再依次加入1mL的0.0125M的三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和1mL的0.25M的过硫酸铵(APS)，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s。
(5)活化修饰硅胶固载牛血清白蛋白
取10g修饰过偶联的硅胶放入20mL小烧杯中，加入光催化交联后的牛血清白蛋白溶液10ml，用玻璃棒充分搅拌使交联的牛血清白蛋白尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用PBS缓液(PH＝7.4)多次清洗，抽滤。最后37℃烘干制得牛血清白蛋白手性固定相(BSA-CSP)。
柱层析对氨基酸的拆分试验
选用小孔径的层析柱(内径为1cm，长为20cm)，分别填装未做处理硅胶与制备好的牛血清白蛋白手性固定相，填柱高度为7cm。将D、L-色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸分别配成0.03mol/L的样品溶液,向层析柱上加入混合的外旋体氨基酸1.0mL,洗脱液使用无水乙醇，流速控制在1mL/min,。取10mL规格离心管收集层析液，每管收集2mL,收集的层析液后使用无水乙醇稀释5倍,使用自动旋光仪测定旋光α值、紫外分光光度仪测定紫外吸收A值(色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸紫外吸收波长均设置为280nm)。结果如表3、表4所示。
表3硅胶对D、L-酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的手性拆分
Figure BDA0002769414550000091
Figure BDA0002769414550000101
表3中旋光α值表征对映体的拆分率,紫外吸收A值表征溶液中氨基酸的浓度。由表3看出硅胶对D、L-酪氨酸无拆分效果，对D、L-半胱氨酸与D、L-色氨酸的外消旋体有一定的拆分能力。
表4 BSA-CSP对D、L-酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的手性拆分
Figure BDA0002769414550000102
表4中旋光α值表征对映体的拆分率,紫外吸收A值表征溶液中氨基酸的浓度。由表4可明显看出酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸在BSA-CSP上得到了较好的拆分效果。
将0.03mol/L的L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸分别取1mL上柱(硅胶柱、BSA-CSP柱)洗脱，测定收集液浓度最大时对应的旋光值，将其与D、L-酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸上柱洗脱测定的旋光度最大负值相除，即得到对氨基酸的拆分率。在BSA-CSP柱洗脱测定的最大浓度旋光值依次为-0.028、-0.074、-0.030，得到拆分率分别为57％、70％、53％；在硅胶柱洗脱测定的最大浓度旋光值分别为0.000、-0.034、-0.031，得到的拆分率为0％、35％、25％。可见制备的牛血清白蛋白手性固定相对氨基酸的拆分效果较好。
实施例4
基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备：
(1)活化硅胶的制备
称取20g硅胶，溶于60ml HCl中(6.0M)，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性。最后，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用。
(2)巯基化修饰：
首先，将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中。加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h。取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净。
(3)4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的偶联
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出,放置阴凉通风处风干。
(4)光催化交联牛血清白蛋白
取一500mL烧杯(用锡纸包裹避光)，向其中加入300ml浓度为0.5mg/mL的牛血清白蛋白溶液，再依次加入500μL的0.021M的三(2,2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和500μL的0.42M的过硫酸铵(APS)，上述3个反应物的摩尔比为1:5:100，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s。
(5)活化修饰硅胶固载牛血清白蛋白
取10g修饰过偶联的硅胶放入200mL小烧杯中，加入光催化交联后的牛血清白蛋白溶液100ml，用玻璃棒充分搅拌使交联的牛血清白蛋白尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用PBS缓液(PH＝7.4)多次清洗，抽滤。最后37℃烘干制得牛血清白蛋白手性固定相(BSA-CSP)。
对样品进行柱层析对氨基酸的拆分试验，结果如表5所示。
表5 BSA-CSP对D、L-半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸的手性拆分
Figure BDA0002769414550000121
表5中旋光α值表征对映体的拆分率,紫外吸收A值表征溶液中氨基酸的浓度。由表5可明显看出半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸在BSA-CSP上得到了较好的拆分效果。
将0.03mol/L的L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸分别取1mL上BSA-CSP柱洗脱，测定收集液浓度最大时对应的旋光值，将其与D、L-半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸上柱洗脱测定的旋光度最大负值相除，即得到对氨基酸的拆分率。在BSA-CSP柱洗脱测定的最大浓度旋光值依次为-0.033、-0.18、-0.056，得到拆分率分别为17％、80％、23％。可见制备的牛血清白蛋白手性固定相对含羟基的天然氨基酸的拆分效果较好。
实施例5
基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备：
(1)活化硅胶的制备
称取20g硅胶，溶于60ml HCl中(6.0M)，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性。最后，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用。
(2)巯基化修饰：
首先，将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中。加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h。取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净。
(3)4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的偶联
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出,放置阴凉通风处风干。
(4)光催化交联猪胰岛素
取一50mL离心管(用锡纸包裹避光)，向其中加入30ml浓度为5mg/mL的猪胰岛素溶液，再依次加入500μL的0.0125M的三(2,2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和500μL的0.25M的过硫酸铵(APS)，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s。
(5)活化修饰硅胶固载猪胰岛素
取10g修饰过偶联的硅胶放入20mL小烧杯中，加入光催化交联后的猪胰岛素溶液，用玻璃棒充分搅拌使交联的猪胰岛素尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用PBS缓液(PH＝7.4)多次清洗，抽滤。最后37℃烘干制得猪胰岛素手性固定相(INS-CSP)。
对样品进行柱层析对氨基酸的拆分试验，结果如表6所示。
表6 INS-CSP对D、L-酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸的手性拆分
Figure BDA0002769414550000131
Figure BDA0002769414550000141
表6中旋光α值表征对映体的拆分率,紫外吸收A值表征溶液中氨基酸的浓度。由表6可明显看出谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸在INS-CSP上得到了较好的拆分效果。
将0.03mol/L的L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸分别取1mL上柱(硅胶柱、INS-CSP柱)洗脱，测定收集液浓度最大时对应的旋光值，将其与D、L-酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸上柱洗脱测定的旋光度最大负值相除，即得到对氨基酸的拆分率。在INS-CSP柱洗脱测定的最大浓度旋光值依次为-0.046、-0.094、-0.086，得到拆分率分别为29％、43％、33％。可见制备的猪胰岛素手性固定相对氨基酸的拆分效果较好。
实施例6
基于光催化交联蛋白的手性固定相的制备：
(1)活化硅胶的制备
称取20g硅胶，溶于60ml HCl中(6.0M)，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性。最后，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用。
(2)巯基化修饰：
首先，将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中。加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h。取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净。
(3)4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的偶联
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出,放置阴凉通风处风干。
(4)光催化交联溶菌酶蛋白
取一50mL离心管，向其中加入30ml浓度为5mg/mL的溶菌酶蛋白溶液，再依次加入500μL的0.0125M的三(2,2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和500μL的0.25M的过硫酸铵(APS)，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s。
(5)活化修饰硅胶固载溶菌酶蛋白
取10g修饰过偶联的硅胶放入20mL小烧杯中，加入光催化交联后的溶菌酶蛋白溶液，用玻璃棒充分搅拌使交联的溶菌酶蛋白尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用PBS缓液(PH＝7.4)多次清洗，抽滤。最后37℃烘干制得溶菌酶手性固定相(Lys-CSP)。
对样品进行柱层析对氨基酸的拆分试验，结果如表7所示。
表7 Lys-CSP对D、L-赖氨酸、精氨酸、亮氨酸的手性拆分
Figure BDA0002769414550000151
Figure BDA0002769414550000161
表7中旋光α值表征对映体的拆分率,紫外吸收A值表征溶液中氨基酸的浓度。由表7可明显看出酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸在Lys-CSP上得到了较好的拆分效果。
将0.03mol/L的L-赖氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸分别取1mL上柱(硅胶柱、Lys-CSP柱)洗脱，测定收集液浓度最大时对应的旋光值，将其与D、L-赖氨酸、精氨酸、亮氨酸上柱洗脱测定的旋光度最大负值相除，即得到对氨基酸的拆分率。在Lys-CSP柱洗脱测定的最大浓度旋光值依次为-0.026、-0.072、-0.032，得到拆分率分别为37％、50％、25％。可见制备的溶菌酶手性固定相对氨基酸具有较好的拆分效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种基于光催化交联蛋白的手性固定相的应用，其特征在于：用以分离混合的外旋体氨基酸，方法为：
选用内径为1cm、长为20cm的层析柱，填装制备好的牛血清白蛋白手性固定相，填柱高度为7cm；将混合的外旋体氨基酸配成0.03mol/L的样品溶液，向层析柱上加入混合的外旋体氨基酸1.0mL，洗脱液使用无水乙醇，流速控制在1mL/min，取10mL规格离心管收集层析液，每管收集2mL，收集的层析液后使用无水乙醇稀释5倍；
其中，所述牛血清白蛋白手性固定相的制备方法为：
称取20g硅胶，溶于60mL6.0M HCl中，150℃搅拌回流8h，将活化后的硅胶抽滤，用蒸馏水洗至中性，将产物70℃干燥8h，装入试剂瓶内备用，得到活化硅胶；
将1.2mL的γ-巯丙基三甲氧基硅烷加入到含有10mL的95％乙醇的20mL的烧杯中，使用旋涡混合仪充分混合，用浓盐酸调节体系的pH值至5，倒入锥形瓶中，加入活化后的硅胶15g，然后将该锥形瓶于恒温摇床中，37℃，150rpm，反应4h，取出后，先用乙醇反复超声振动清洗，之后用去离子水充分清洗，直至表面的乙醇被清洗干净，得到巯基化修饰的硅胶；
取20mL配制好的1mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯溶液放置于50mL的锥形瓶中，之后将巯基化修饰过的硅胶加入到锥形瓶中，然后将锥形瓶放置于恒温摇床中，温度设置为37℃，转速为150rpm，反应1h后取出，放置阴凉通风处风干，得到修饰偶联的硅胶；
取一50mL离心管，离心管用锡纸包裹避光，向其中加入30mL 浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液，再依次加入1mL的0.0125M的三(2，2'-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物和1mL的0.25M的过硫酸铵，然后置于200W的白炽灯下，光照时间控制在10s，得到光催化交联牛血清白蛋白；
取10g修饰偶联的硅胶放入20mL小烧杯中，加入光催化交联后的牛血清白蛋白溶液10mL，用玻璃棒充分搅拌使交联的牛血清白蛋白尽可能地附着在修饰后的硅胶上，抽滤，用pH ＝7.4的PBS缓液多次清洗，抽滤，最后37℃烘干制得牛血清白蛋白手性固定相。
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