CN112375835A - 一种河流弧菌4个o抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及应用 - Google Patents

一种河流弧菌4个o抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对河流弧菌O抗原血清型分型的环介导等温扩增（LAMP）检测方法及应用。本发明以河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原基因簇内的特异基因，即wzy为靶基因，设计并筛选了对河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原血清型分型的各自4条LAMP引物，并建立了对应的检测反应体系。利用本发明的LAMP方法检测河流弧菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效等优点。

Description

一种河流弧菌4个O抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及 应用
技术领域
本发明涉及对河流弧菌O1，O4，O14和O17血清型菌株的环介导等温扩增（LAMP）技术及其制备方法。本发明还涉及利用所述的LAMP技术进行检测的方法。
背景技术
河流弧菌为革兰氏阴性菌，是海洋环境的主要栖息菌之一，广泛存在于河流和出海口环境水域，也是人类与水生生物主要的细菌性病原之一，可以起鱼、虾、贝等多种养殖动物的疾病，给养殖业带来严重的经济损失。河流弧菌还可以通过各种食物导致人类严重的流行性腹泻，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被认为是一种全球性的***共患的新型病原菌。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环等过程具有简单、快速的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
血清学检测方法可有效区分一个种/属中不同致病性的菌株，对于致病菌的鉴定和流行病学调查具有重要意义。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。前期研究中，我们发现，河流弧菌的O抗原基因簇信息已被破译，这使得采用分子生物学方法，以基因簇中的特异基因为目标，实现对河流弧菌的分子血清学检测成为可能。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了一种对河流弧菌O1，O4，O14和O17菌株进行O抗原血清型分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。其特征在于具有从河流弧菌O1，O4，O14和O17的wzy基因中分别选取得到的4个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示。
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3'端的F3c、F2c和Flc区以及 5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
Primer) Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物Primer) Outer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物Primer) Inner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物Primer) Outer (Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
本发明还提供了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系，组成成分如下：
Figure 593516DEST_PATH_IMAGE001
本发明进一步公开了上述环介导等温扩增（LAMP）反应体系在用于河流弧菌菌株O抗原血清型检测方面的应用，所述的河流弧菌指的是分离于任何适合河流弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的DNA粗提液。
实验结果显示，利用本发明的环介导等温扩增（LAMP）反应体系，可以实现对河流弧菌O1，O4，O14和O17血清型菌株的准确检测。
本发明主要提供了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对河流弧菌4个O抗原血清型进行检测的技术手段。其积极效果在于：
（1）首次公开了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对河流弧菌O抗原血清型进行检测的技术手段，对于该菌的临床检测和流行病学监控提供了有效方法。
（2）操作简便，无需昂贵反应设备，在普通水域环境中即可完成反应。
（3）检测时间短：利用该技术手段，自获得基因组DNA粗提液后，可在约1.5小时内完成检测。
附图说明
图1，O1体系LAMP反应特异性检测：在O1的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O1的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O1的LAMP体系特异性良好；
图2，O4体系LAMP反应特异性检测：O4的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O4的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O4的LAMP体系特异性良好。
图3，O14 体系LAMP反应特异性检测：在O14的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O14的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O14的LAMP体系特异性良好。
图4，O17 体系LAMP反应特异性检测：在O17的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O17的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O17的LAMP体系特异性良好。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
引物的设计
1、特异基因的筛选
O抗原加工基因wzy，wzx，wzm和wzt具有高度血清型决定性，因此已被广泛用作许多革兰氏阴性细菌分子血清分型的靶标基因。河流弧菌O1，O4，O14, O17中，选择wzy作为特异基因。
本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计引物。
2、引物的设计
以挑选出来的河流弧菌的特异基因为模板设计 LAMP 的引物。
使用http://primerexplorer.jp/e/wzy基因的序列设计 LAMP引物。Primer)Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同；F3引物：上游外部引物Primer) Outer(Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补；BIP引物：下游内部引物) PrimerInner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同；B3引物：下游外部引物) Primer Outer (Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。每种引物的数量和序列信息列于表2中。
B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt。引物由GENEWIZ（中国天津）合成。
表2LAMP 所用到的引物
Figure 841351DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
样本核酸的提取（分离于任何适合河流弧菌生活的环境中所得到样品的纯培养物的DNA粗提液）
1、将待测样品用无菌水稀释，通常稀释倍数为1：10（例如10g固体样品或10ml液体样品溶于90ml无菌水中），制成菌液母液（只取液体）。
将母液用无菌水再稀释5个梯度：1×10‐1、1×10‐2、1×10‐3、1×10‐4、1×10‐5，将每个梯度菌液分别均匀涂于LB固体培养基上37℃培养。待平板上生长出单个菌落时，将菌落挑起接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养（此步接种操作均在超净台中进行）。
2、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1 min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。
水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；
3、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；
4、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；
5、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；
6、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；
7、重复步骤5一次；
8、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；
9、得到的DNA用50-100 µL ddH2O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；
10、定浓度至300 ng/µL。
实施例3
特异性检测
以实施例2中提取的核酸溶液作为LAMP反应的模板，分别加入O1，O4，O14, O17对应的LAMP反应体系，至于水浴锅中，按如下条件进行反应。
Figure 41388DEST_PATH_IMAGE003
实施例4
琼脂糖凝胶电泳检测
从实施例3的每个反应体系中，吸取2μL反应产物，进行琼脂糖（2%）凝胶电泳，电压120v，电泳时间20min。后至于紫外灯下观察。
检测结果如图1-图4所示：
图1，O1 体系LAMP反应特异性检测：在O1的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O1的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O1的LAMP体系特异性良好；
图2，O4体系LAMP反应特异性检测：O4的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O4的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O4的LAMP体系特异性良好。
图3，O14 体系LAMP反应特异性检测：在O14的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O14的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O14的LAMP体系特异性良好。
图4，O17 体系LAMP反应特异性检测：在O17的LAMP体系中分别加入河流弧菌O1、O4、O9、O10、O12、O14、O17、O18的基因组，除O17的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明河流弧菌O17的LAMP体系特异性良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种河流弧菌4个O抗原血清型的环介导等温扩增检测方法及应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaccaaatcg ggtactgg 18
<210> 2
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<212> DNA
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gcaattaata attctggctg c 21
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<212> DNA
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acaacaagcg aaatcagaga aacttttttt gttttttctt actttcttgg tcc 53
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<212> DNA
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<400> 4
atcagtgtca aggatttgga tgtagttttt cgttagtttg acaaacgtat c 51
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<212> DNA
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aacagacaat atttctgact cat 23
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<212> DNA
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Claims (4)

1.一种对河流弧菌不同O抗原血清型的LAMP引物，其特征在于具有从河流弧菌O1，O4，O14和O17的wzy基因中分别选取得到的4个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:16所示。
2.一种环介导等温扩增LAMP反应体系，其分别含有权利要求1所述的河流弧菌O1，O4，O14和O17的LAMP引物。
3.一种权利要求2所述的环介导等温扩增LAMP反应体系的在用于检测河流弧菌菌株O抗原血清型方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中所述的河流弧菌指的是分离于适合河流弧菌生活的环境中，所得待测样品的纯培养物的DNA粗提液。
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