CN112375109B - 利用烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚npe-108分离纯化螺旋霉素 - Google Patents

利用烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚npe-108分离纯化螺旋霉素 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分离纯化螺旋霉素的方法，NPE‑108属烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚，可用于形成两水相体系分离螺旋霉素。第一次正萃时，将NPE‑108与螺旋霉素发酵液以1:5的体积比混合，调节pH至9.0，在55℃下诱导形成两水相体系，达到分配平衡后，发酵液中的螺旋霉素分配到NPE‑108相(下相)，分离上相，将其用于第二次正萃。将两次正萃的下相混合，并加入0.25倍体积的纯水，调节pH至5.8，在55℃下进行分配，使富集在NPE‑108相中的螺旋霉素被反萃到水相中，经过两级正萃和一级反萃可将螺旋霉素从发酵液中分离出来，并且通过温度调节可以回收NPE‑108，回收率达到98.8％，具有操作条件温和、高效回收、安全环保等优点。

Description

利用烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚NPE-108分离纯化螺旋霉素
技术领域
本发明涉及两水相萃取技术领域，更具体地，涉及温度诱导可再生两水相萃取技术领域，特别是指利用温度诱导可再生两水相体系分离纯化发酵液中螺旋霉素的过程设计和工艺优化。
背景技术
嵌段聚醚NPE-108是一种热敏感聚合物，是由单体环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)组成的嵌段共聚物经烷基酚修饰而得。聚合物的分子量为0.79kDa，浊点为39℃，通过调节聚醚中EO/PO的比例可以改变聚合物的浊点。NPE-108水溶液加热时，超过聚合物的浊点，溶液出现浑浊，当温度继续升高至超过浊点15℃，聚合物NPE-108与水分离，形成具有清晰界面的两相，利用此两相可执行目标产物的分离，并且利用此方法还可以将NPE-108从相体系中回收出来，进行重复利用，这就是NPE-108/水温度诱导可再生两水相体系。
两水相体系含水量高，操作条件温和，在分离生物活性物质的过程中有利于保持它们的活性。并且，两水相萃取过程操作简单，易于工业上进行大规模分离纯化。NPE-108无爆燃无挥发性。
响应型两水相萃取是一种非常有潜力的分离纯化技术，已被用于分离纯化酶、蛋白质、抗体、抗生素等生物活性物质。但是，该分离纯化手段目前仅停留在实验室阶段，因为利用两种响应型聚合物构建的两水相体系粘度大、成相时间长、聚合物成本高且合成工艺不成熟，从而限制了响应型两水相体系的大规模应用。
因此，开发一种低粘度、成相时间短、成本低、聚合物合成工艺成熟的响应型可再生两水相体系，优化萃取工艺，用于分离纯化生物活性物质成为该领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述问题，提供一种温度诱导可再生两水相体系分离纯化螺旋霉素的工艺方法，仅使用一种热敏聚合物NPE-108，聚合物水溶液经温度诱导30min即可成相，并且可以通过调节温度使聚合物与水溶液分离，从而实现回收再利用，可大大降低螺旋霉素分离纯化成本，操作简单易于工业化应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种分离纯化螺旋霉素的方法，其主要特点是，所述的方法包括：
第一级正向萃取步骤：将NPE-108与螺旋霉素发酵液以1:5体积比混合，调节pH至9.0，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，分离上下相；
第二级正向萃取步骤：加入0.2倍体积的NPE-108于第一级正向萃取步骤分离所得的上相中，混匀后调节pH至9.0，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，分离上下相；
反向萃取步骤：将第一级正向萃取步骤和第二级正向萃取步骤所得的下相混合，加入0.25倍体积的纯水，调节pH至5.8，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，螺旋霉素富集在上相水溶液中。
较佳地，反向萃取步骤得到的下相，于60℃加热30分钟，除去水相，回收热响应聚合物NPE-108。
本发明中用到的热敏聚合物NPE-108为市售商品，通过加热反萃后NPE-108富集的下相，可以将其与水溶液分开，得到回收的NPE-108。
本发明使用的NPE-108具有无毒无爆燃无挥发性、耐热、可回收、对设备无腐蚀等特点，能大大降低螺旋霉素的分离成本。
本发明的有益效果具体为：本发明设计了NPE-108/水温度诱导可再生两水相体系分离纯化螺旋霉素的工艺过程。此两水相体系是温度响应型的，通过调节温度可以控制成相时间；正萃时，螺旋霉素发酵液和NPE-108可以在30分钟内成相，通过调节体系的pH可以使发酵液中的螺旋霉素分配到NPE-108相中，反萃时，NPE-108和水也能在30分钟内成相，同样地通过调节体系pH使NPE-108相中的螺旋霉素转移到水相中，并通过加热NPE-108相回收NPE-108。因此，通过调节温度形成两水相体系，调节体系pH可以分离纯化发酵液中的螺旋霉素，并能通过温度调节回收NPE-108，从而降低下游纯化成本，且操作简单，易于工业化应用。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。
实施例1NPE-108/水温度诱导可再生两水相体系正萃螺旋霉素的实验
将螺旋霉素发酵液过滤离心后备用，在50mL刻度离心管中加入20mL螺旋霉素发酵液，再加入4mL NPE-108并混匀，调节溶液的pH至9.0，将其置于55℃水浴锅中进行第一次正萃，达到分配平衡后，分离上下相，用移液枪取上下相各50uL，用超纯水稀释至1.0mL，按照公知的螺旋霉素液相检测方法测定上下相中螺旋霉素的浓度。向第一次正萃所得的上相中加入0.2倍体积的NPE-108，混匀后调节pH至9.0，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，分离上下相，用移液枪取上下相各50uL，用超纯水稀释至1.0mL，按照公知的螺旋霉素液相检测方法测定上下相中螺旋霉素的浓度。螺旋霉素在NPE-108/水温度诱导两水相体系中的分配系数为其在上下相中的浓度比，已知在该条件下，正萃分配系数为0.04。
实施例2NPE-108/水温度诱导可再生两水相体系反萃螺旋霉素的实验
将实施例1中两次正萃所得的下相混匀，加入0.25倍体积的纯水，振荡均匀后调节pH至5.8，静置于55℃水浴锅中进行反萃，达到分配平衡后，分离上下相，用移液枪取上下相各50uL，用超纯水稀释至1.0mL，按照公知的螺旋霉素液相检测方法测定上下相中螺旋霉素的浓度。已知在该条件下，螺旋霉素在NPE-108/水温度诱导可再生两水相体系中的反萃分配系数达到35。
实施例3热响应聚合物NPE-108的回收实验
将实施例2中反萃所得的下相置于60℃水浴锅中，静置30分钟后除去上层水溶液，得到的NPE-108回收率为98.8％。
综上所述，本发明的EOPO108/水温度诱导可再生两水相体系具有含水量高、回收率高、成相时间短、操作简单等优点。采用本发明分离纯化发酵液中的螺旋霉素，具有良好的分离效果，适合工业化应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (2)

1.一种利用烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚NPE-108分离纯化螺旋霉素的方法，其特征在于，所述的方法包括：
第一级正向萃取步骤：将NPE-108与螺旋霉素发酵液以1:5体积比混合，调节pH至9.0，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，分离上下相；
第二级正向萃取步骤：加入0.2倍体积的NPE-108于第一级正向萃取步骤分离所得的上相中，混匀后调节pH至9.0，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，分离上下相；
反向萃取步骤：将第一级正向萃取步骤和第二级正向萃取步骤所得的下相混合，加入0.25倍体积的纯水，调节pH至5.8，静置于55℃水浴锅中，达到分配平衡后，螺旋霉素富集在上相水溶液中。
2.根据权利要求1所述的利用烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚NPE-108分离纯化螺旋霉素的方法，其特征在于，NPE-108反向萃取步骤得到的下相，于60℃加热30分钟，除去水相，回收热响应聚合物NPE-108。
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