CN112367975A - 用于制备包含抗凝血因子XIa（FXIa）抗体的冷冻干燥微丸的方法 - Google Patents
用于制备包含抗凝血因子XIa（FXIa）抗体的冷冻干燥微丸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
用于制备包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的方法，其包括以下步骤：a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；b)冷冻干燥微丸；其中在步骤a)中，微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔形成微滴来形成，该冷却塔具有温度可控的内壁表面和低于溶液的冷冻温度的内部温度，以及其中在步骤b)中，在位于真空室内的旋转容器中冷冻干燥微丸。
Description
本发明涉及用于制备包含抗凝血因子XIa(FXIa)抗体的冷冻干燥微丸(pellet)的方法，所述方法包括以下步骤：a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸，以及b)冷冻干燥微丸。本发明还涉及一种用于减少包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的重构时间的方法，并涉及可通过本发明的方法获得的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸。
1964年，Macfarlane和Davie&Ratnoff[Macfarlane RG.An enzyme cascade inthe blood clotting mechanism,and its function as a biochemicalamplifier.Nature 1964；202:498-9.；Davie EW,Ratnoff OD.Waterfall sequence forintrinsic blood clotting.Science 1964；145:1310-2.]引入了他们对于血液凝固过程的级联假设。从那时起，我们对体内凝血功能的认识不断增长。在过去几年间，已经修正了两种不同途径的理论，所述两种不同途径即所谓的外在和内在途径，其引发凝血并汇聚在共同途径中，最终导致凝血酶生成和纤维蛋白沉积。在当前的模型中，凝血的引发发生于血浆蛋白酶激活因子VII与组织因子(TF)接触并由此与其形成复合物的时候。该组织因子-FVIIa复合物可以将酶原FX激活成其活性形式FXa，FXa自身可以将凝血酶原(凝血因子II)转化为凝血酶(IIa)。凝血酶——凝血的关键参与者——又可以催化纤维蛋白原到纤维蛋白的转化。另外，凝血酶激活血小板所表达的特异性受体，这导致血小板的激活。激活的血小板结合纤维蛋白对于血块形成至关重要，因此是正常止血的重要参与者。
第二个扩增途径是由凝血因子XI(FXI)形成的。充分证实了，FXI与凝血级联的其他成员一样，是一种血浆丝氨酸蛋白酶酶原，其在桥接体内血液凝固的起始阶段和扩增阶段中起重要作用[Davie EW,Fujikawa K,Kisiel W.The coagulation cascade:initiation,maintenance,and regulation.Biochemistry 1991；30:10363-70；GailaniD,Broze Jr GJ.Factor XI activation in a revised model of bloodcoagulation.Science 1991；253:909-12；Kravtsov DV,Matafonov A,Tucker El,Sun MF,Walsh PN,Gruber A,et al.Factor XI contributes to thrombin generation in theabsence of factor XI I.Blood 2009；1 14:452-8.3-5]。凝血因子XI(FXI)在肝脏中合成，并作为与高分子量激肽原(HMWK)络合的二硫键连接的二聚体在血浆中循环。该二聚体的每个多肽链为约80kD。经由血液凝固的接触阶段或通过凝血酶介导的血小板表面激活，酶原因子XI被转化为其活性形式凝血因子Xla(FXIa)。在该因子XI的激活过程中，内部肽键在两条链的每条中均被切割，得到了激活因子Xla，一种由通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链组成的丝氨酸蛋白酶。该丝氨酸蛋白酶FXIa将凝血因子IX转化为IXa，其随后激活凝血因子X(Xa)。然后Xa可以介导凝血因子II/凝血酶激活。
FXI缺乏通常不会导致自发性出血，但是与止血困难的出血风险提高有关，尽管出血的严重程度与FXI的血浆水平相关性不大。人类中严重FXI缺乏对于血栓形成性疾病具有一定的保护作用。然而，高水平的FXI与血栓形成性事件相关。因此，已经提出在新的抗血栓药的开发中，将抑制FXI作为一种新的方法以实现提高的受益风险比。
WO 2013/167669公开了能够选择性结合至血浆因子XI、FXIa的活化形式，由此抑制血小板聚集和相关血栓形成的抗体。发现这些抗体不影响止血。
和许多其他生物药物一样，免疫球蛋白在更长的时期内在溶液中不稳定。冷冻干燥(也称为冻干)是通过将冰晶升华成水蒸气(即通过将水从固相直接转变为气相)来干燥热敏感和/或水解敏感材料的方法。
在常规方法中，冷冻干燥通常在标准冷冻干燥室中进行，该标准冷冻干燥室包括在(真空)干燥室内的一个或多个托盘或架子。可将小瓶装满待冷冻干燥的产品，并放在这些托盘上。这些干燥机通常不具有温度可控的壁，并且向放置在干燥室中的小瓶提供不均匀的热传递。尤其是位于边缘的那些小瓶由于在室壁和板/架子堆之间的间隙中的辐射热传递和气体传导而比位于板中心的那些小瓶更集中地交换能量。这种不均匀的能量分布导致在边缘处的小瓶和在中心处的那些小瓶之间的冷冻和干燥动力学的变化，并可能导致各个小瓶中活性内容物的活性变化和产品产率损失。为确保最终产品的一致性，有必要在实验室和生产规模上都进行广泛的开发和验证工作。
WO 2006/008006 A1涉及用于无菌制造的方法，包括冷冻干燥、储存、测定和填充微丸状的生物药物产品到最终容器例如小瓶中。所描述的方法结合了喷雾冷冻和冷冻干燥，并且包括以下步骤：a)冷冻产品的微滴以形成微丸，其中通过使产品的溶液穿过频率辅助喷嘴(frequency assisted nozzle)而形成微滴，以及通过使所述微滴穿过低温气体的逆流从所述微滴形成微丸；b)冷冻干燥微丸；c)储存并均质化冷冻干燥微丸；d)在储存和均质化冷冻干燥微丸时测定冷冻干燥微丸；e)将冷冻干燥微丸装载到所述容器中。
WO 2013/050156 A1描述了一种用于在封闭条件下制备冷冻干燥颗粒的生产线，其包括至少一个用于液滴产生和冷冻凝结液滴以形成颗粒的喷射室和用于冷冻干燥颗粒的大容量冷冻干燥机，该冷冻干燥机包括用于接收颗粒的滚筒。此外，提供传送部分用于将产品从喷射室传送到冷冻干燥机。为了在端对端封闭条件下生产颗粒，每个装置和传送部分单独适于保持待冷冻干燥的产品无菌性和/或密闭的操作。
WO 2013/050161 A1公开了一种用于在封闭条件下生产冷冻干燥颗粒的生产线，该生产线包括用于在封闭条件下批量生产冷冻干燥颗粒的冷冻干燥机，该冷冻干燥机包括用于接收冷冻颗粒的滚筒和容纳滚筒的固定真空室，其中为了在封闭条件下生产颗粒，真空室适于在颗粒加工期间进行封闭操作。筒与真空室开放式连通，并且提供至少一个传送部分用于在生产线的单独装置与冷冻干燥机之间传送产品，冷冻干燥机和传送部分单独适于封闭操作，其中传送部分包括温度可控的内壁表面。
治疗性抗体可能需要在有限的体积中大剂量给药，因此需要待给药的最终溶液中的抗体浓度高，这对于常规冷冻干燥产品而言，导致长达数小时的不切实际的长的重构时间，在此类情况下限制了冷冻干燥的适用性。用于制备包含重构时间缩短了的冷冻干燥微丸的抗FXIa抗体的方法将是有利的。此外，将需要一种用于制备包含冷冻干燥微丸的抗FXIa抗体的冷冻干燥方法，该方法避免了在加工过程中对抗FXIa抗体的损害，因此避免了结合亲和力的损失。具体而言，应避免各个微丸之间的活性(例如结合亲和力)变化。优选地，应该有可能进行这样的冷冻干燥方法：在严格与外界隔离的条件下制备包含微丸的抗FXIa抗体以确保无菌——这意指将需要避免通过低温气体(例如液氮)的逆流或并行冷却流进行冷却。最后，一种产生粒度和重量分布窄的均质冷冻干燥微丸的可重复方法，将为进一步处理提供了主要优势。本发明的目的是提供这样的方法。所引用的现有技术参考文献中均未公开这样的方法。
根据本发明，上述目的通过用于制备包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的方法来实现，该方法包括以下步骤：
a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；
b)冷冻干燥微丸。
其中在步骤a)中，微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔形成微滴来形成，该冷却塔具有温度可控的内壁表面和低于溶液的冷冻温度的内部温度，以及在步骤b)中，在位于真空室内的旋转容器中冷冻干燥微丸。
本发明的方法的操作原理具有几个明显的优势。第一，应注意的是，在本发明的方法中，包含抗FXIa抗体的溶液的喷射微滴不接触以逆流方式的低温气体，例如WO 2006/008006 A1中所述。不需要引入低温气体到冷却塔的内部空间，因此可以省略针对低温气体的所有处理和灭菌步骤。本发明的方法的所有步骤可以在无菌条件下进行，并且不损害各个步骤之间的无菌性。
第二，实验发现本发明的方法不会对抗FXIa抗体造成显著的损害，因此避免了最终产品中结合亲和力的损失。事实上，如通过间接ELISA所评估的，与通过常规冷冻干燥或根据WO 2006/008006的冷冻干燥方法获得的包含抗FXIa抗体的冻干物相比，通过本发明的方法获得的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸，显示出对FXIa抗原的增加的结合亲和力。避免对抗FXIa抗体的损害，可以在窄的特定范围内精确填充所需量的活性抗FXIa抗体。此外，与标准冻干法相比，本发明的方法使得在不同体积和施用体系中填充冷冻干燥微丸时灵活性更大。
第三，通过在真空室内部的旋转容器中进行冷冻干燥步骤，每个单独微丸的空间位置随时间均匀分布。这确保了均一的干燥条件，并因此消除了架子上的冷冻干燥小瓶会存在的抗体活性(例如结合亲和力)的空间变化。
最后，出人意料地发现，本发明制备的包含抗FXIa抗体的微丸显示出重构时间的显著缩短，特别是与通过常规冷冻干燥获得的包含抗FXIa抗体的冻干物的相比，以及与通过WO 2006/008006 A1中所公开的方法获得的微丸相比。
冷冻微丸的产生可以根据任何已知技术进行。然而，重要的是，应避免将包含抗体的微滴滴入液氮中以在其中形成微丸。
鉴于随后的冷冻干燥步骤，冷冻微丸有利地具有窄的粒度分布。之后，冷冻微丸在无菌和低温条件下被运输至冷冻干燥机。然后通过容器的旋转将微丸分布在干燥室内的整个承载表面上。升华干燥原则上可以在任何类型的适用于微丸的冷冻干燥机中进行。优选提供用于升华蒸气流的空间、可控制的壁温以及干燥室与冷凝器之间合适的横截面积的冷冻干燥机。
下文描述了可用于本发明的方法的抗FXIa抗体变体的细节。
根据本发明所用的抗FXIa抗体能够结合至血浆因子XI、FXIa的活化形式。优选地，抗FXIa抗体特异性结合至FXIa。优选地，抗FXIa抗体能够抑制血小板聚集和相关血栓形成。优选地，抗体介导的血小板聚集的抑制不损害血小板依赖性原发性止血。在本发明的上下文中，术语“不影响止血”意指凝血因子XIa的抑制不会导致不希望的和可测量的出血事件。
如本文所用，“凝血因子XIa”、“因子XIa”或“FXIa”是指来自任何表达酶原因子XI的哺乳动物物种的任何FXIa。例如，FXIa可为人类、非人类灵长类动物(例如狒狒)、小鼠、狗、猫、牛、马、猪、兔和任何其他表达参与调节血流、凝血和/或血栓形成的凝血因子XI的物种。
如本文所用，因为结合特异性不是绝对的性质，而是相对的性质，因此如果抗体能够将抗原(在本文中为FXIa)和一种或多种参考抗原区分开，那么这样的抗体“特异性结合至”所述抗原，是对所述抗原“特异性的”或者“特异性识别”所述抗原。在其最一般的形式中(以及当没有提及所定义的参考时)，“特异性结合”是指按照例如以下方法之一测定的抗体区分目的抗原和不相关抗原的能力。这类方法包括，但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试以及肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物酶的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过例如在450ran下的光密度进行评分。
典型背景(＝阴性反应)可以为0.1OD；典型阳性反应可以为1OD。这意味着阳性/阴性的差异可以大于10倍。通常，通过使用不止单独一种参考抗原而是一组约3-5种不相关的抗原(例如奶粉、BSA、转铁蛋白等)来确定结合特异性。
然而，“特异性结合”也可指抗体区分靶抗原和用作参考点的一种或多种紧密相关抗原(例如同源物)的能力。例如，与参考抗原相比，抗体对于靶抗原的相对亲和力可为至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。此外，“特异性结合”可涉及抗体区分其靶抗原的不同部分(例如FXIa的不同结构域或区域)的能力。
“亲和力”或“结合亲和力”KD通常通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)并计算kd与ka的商(KD＝kd/ka)来确定。术语“免疫特异性”或“特异性结合”优选意指抗体以低于或等于106M(单价亲和力)的亲和力KD结合至凝血因子XIa。术语“高亲和力”意指抗体以低于或等于107M(单价亲和力)的亲和力KD结合至凝血因子XIa。这样的亲和力可使用常规技术容易地测定，例如通过平衡分析；通过使用BIAcore 2000设备，通过使用制造商列出的一般程序；通过使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定法；或通过技术人员已知的另一种方法。亲和力数据可例如通过[Kaufman RJ,Sharp PA.(1982)Amplificationand expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolatereductase complementary dna gene.J Mol Biol.159:601-621]中所记载的方法进行分析。
如本文所用，术语“抗体”包括从自然界分离或通过重组方法制备的免疫球蛋白分子(例如任何类型，包括IgG、IgE1、IgM、IgD、IgA和IgY，和/或任何类，包括IgGI、lgG2、lgG3、lgG4、IgAI和IgA2)，并且包括所有通常已知的抗体及其功能片段。术语“抗体”还延伸至其他蛋白骨架，所述蛋白骨架能够将抗体CDR定向***到天然抗体中存在的相同活性结合构象，使得相对于CDR衍生自其的天然抗体的结合活性，所观察到的靶抗原与这些嵌合蛋白的结合得以维持。
抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合片段”在本文中被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR-I、CDR-2和/或CDR-3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过提供针对CDR的骨架。优选地，所述“抗原结合区”至少包括可变轻(VL)链的氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，并且特别优选完整的VL和VH链(VL的氨基酸第1-109位和VH的氨基酸第1-113位；根据WO97/08320进行编号)。用于本发明的一类优选的免疫球蛋白为IgG。
本发明的“功能片段”包括Fab、Fab1、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子(scFv)；和由抗体片段形成的多特异性的抗体、二硫键连接Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段，它们由完整的免疫球蛋白制备或通过重组方法制备。
抗原结合抗体片段可仅包含可变区或包含可变区结合以下区域的全部或部分：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本发明还包括的是抗原结合抗体片段，其包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任何结合。
抗体和/或抗原结合抗体片段可为单特异性的(例如单克隆的)、双特异性的、三特异性的或具有更高的多特异性。优选地，使用单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，该群体所包含的各个抗体除了可以极少量存在的可能天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原位点。此外，与通常包括直接针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆抗体均直接针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们由同质培养物合成，未被其他具有不同特异性和特征的免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群体的抗体的特征，而不应被解释为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。
抗体或抗原结合抗体片段可为例如人、人源化的、鼠类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼科、马或鸡。优选地，使用人或人源化抗FXIa抗体。
如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库、从人B细胞或从一种或多种人免疫球蛋白的转基因的动物中分离的抗体，以及合成人抗体。
“人源化抗体”或功能人源化抗体片段在本文中被定义为：(i)源自非人来源的(例如，携带异源免疫***的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；或(ii)嵌合的，其中可变域源自非人来源，并且恒定域源自人来源；或(iii)CDR移植的，其中可变域的CDR来自非人来源，而可变域的一个或多个框架为人来源的，并且恒定域(如果有的话)为人来源的。
用于本发明的方法的合适抗体为例如WO 2013/167669中所公开的。在具体实施方案中，抗FXIa抗体包含至少一条CDR氨基酸序列，如WO 2013/167669的表9中所示。在具体实施方案中，抗FXIa抗体包含至少一条可变轻链结构域的氨基酸序列和至少一条可变重链结构域的氨基酸序列，如WO 2013/167669的表9中所示。在具体的此类实施方案中，抗FXIa抗体包含：i)SEQ ID NO:19表示的可变轻链结构域的氨基酸序列和SEQ ID NO:20表示的可变重链结构域的氨基酸序列；或ii)SEQ ID NO:29表示的可变轻链结构域的氨基酸序列和SEQID NO:30表示的可变重链结构域的氨基酸序列；或iii)SEQ ID NO:27表示的可变轻链结构域的氨基酸序列和SEQ ID NO:20表示的可变重链结构域的氨基酸序列。在具体的实施方案中，抗FXIa抗体选自WO 2013/167669中公开的抗体076D-M007-H04、076D-M007-H04-CDRL3-N110D和076D-M028-H17。在具体优选的实施方案中，抗FXIa抗体为076D-M007-H04-CDRL3-N110D，在本文中由可变重链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:1表示和由可变轻链结构域的氨基酸序列SEQ ID NO:2表示。
在具体的实施方案中，抗FXIa抗体缀合至其他部分，特别是药物。
下文将描述本发明的实施方案和其他方面。除非上下文另有明确说明，否则它们可以自由结合。
对于本发明，可以加工任何抗FXIa抗体或其功能片段或变体，而无需方法本身的进一步改变。为了实现有利地缩短重构所需的时间周期，然而，这与在本发明的方法中加工的抗FXIa抗体相关。
该加工优选避免对抗FXIa抗体多肽的潜在损害，并因此避免最终产品中活性/亲和力的损失。
在第二方面，本发明涉及与通过常规冷冻干燥获得的包含抗FXIa抗体的冻干物相比，用于减少包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的重构时间的方法，该方法包括以下步骤：
a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；
b)冷冻干燥微丸。
其中在步骤a)中，微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔(100)形成微滴来形成，该冷却塔(100)具有温度可控的内壁表面(110)和低于溶液的冷冻温度的内部温度，以及在步骤b)中，在位于真空室(200)内的旋转容器(210)中冷冻干燥微丸。
在本发明的上下文中，术语“常规冷冻干燥”和“常规冷冻干燥的”是指在标准冷冻干燥室中进行的小瓶中的标准冷冻干燥方法，所述标准冷冻干燥室包括(真空)干燥室内的一个或多个托盘或架子，且不包括喷射冷冻的工艺步骤。通常，将待冷冻干燥的产品装进小瓶中，然后将小瓶放入(真空)干燥室中。
在本发明的上下文中，术语“与通过常规冷冻干燥获得的冻干物相比，减少冷冻干燥微丸的重构时间”应理解为：与通过常规冷冻干燥获得的冻干物相比，在加入重构介质(例如无菌水)后，通过本发明的方法获得的冷冻干燥微丸完全或接近完全溶解所需的时间周期的减少。重构时间具体减少了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在本发明的上下文中，术语“冷冻干燥微丸完全或接近完全重构/溶解”是指冷冻干燥微丸的固体内容物的至少98％溶解在重构介质中，更具体地，冷冻干燥微丸的固体内容物的至少98.5％，最具体地，冷冻干燥微丸的固体内容物的至少99％、至少99.5％、至少99.75％或至少99.9％溶解在重构介质中。
在本发明方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤b)之后的步骤c)和d)：
c)储存并均质化冷冻干燥微丸；
d)将冷冻干燥微丸装载到容器中。
储存和均质化步骤c)也可以在用于冷冻干燥的真空室内的旋转容器中进行。在步骤d)中，将用户定义量的冷冻干燥微丸填充到最终容器中。将储存容器传送到隔离的填充线并停靠在无菌的转接站(docking station)。将容器的内容物在隔离器内传送到灌装机的存储器。本发明的方法，其对加工的抗FXIa抗体没有或仅有最小的损害，使得在窄的特定范围内精确填充所需的抗体量。本发明的方法使得灵活和个性化地填充到容器中以供最终使用。
在本发明方法的另一个实施方案中，在步骤a)中，微滴借助于使溶液穿过频率辅助喷嘴形成微滴来形成。优选地，振荡频率为≥200Hz至≤5000Hz，更具体地，≥400Hz至≤4000Hz或≥1000Hz至≤2000Hz。
独立于频率辅助的喷嘴，喷嘴开口的直径可以在100μm至500μm的范围内，优选在200μm至400μm的范围内，非常优选在300μm至400μm的范围内。所述喷嘴直径使得微滴尺寸在约200μm至约1000μm的范围内，优选在约400μm至约900μm的范围内，非常优选在约600μm至800μm的范围内。
在本申请上下文中，“约”给定值的尺寸，例如给定尺寸范围的上限或下限被理解为包括与该给定值的偏差不大于±30％的所有微滴尺寸。例如，所得的约400μm的微滴尺寸包括在280μm和520μm之间变化的微滴尺寸。类似地，约100μm至约500μm的范围内的尺寸被理解为包括70mm至650μm的微滴尺寸。
所形成的微滴在中值附近显示某一微滴尺寸分布，其应该大约为上文提及的。
在喷嘴是频率辅助的本发明的实施方案中，中值附近的变化可能更小。鉴于下文描述的效果，因此使微滴穿过频率辅助喷嘴进一步有利于进一步降低对最终冷冻干燥微丸的潜在负面影响。还在本申请上下文中，术语“约”给定值被理解为包括与该给定值的偏差不大于±30％的所有数值。
通常上文给出的尺寸的微滴是有利的，因为发现后续步骤b)至d)可以在很好地维持抗FXIa抗体亲和力的情况下进行。
不受此限制，假设由于过大的表面积体积比，较小的微滴在冷冻干燥步骤a)中过快地冷冻，并且易损的抗FXIa抗体由此被部分破坏。此外，较小的微滴得到具有增加的变为带静电的趋势的较小微丸，而该较小微丸对随后处理这种微丸造成损害。例如，较小的带静电的冷冻微丸从冷却塔中掉落的趋势往往较小，直接导致微丸留在塔中，由此降低了产品产率。较大的微滴不能均匀冷冻。微滴的内芯室的不完全冷冻导致冷冻微丸在塔的底部结块，从而防止了均质微丸块的形成，并因此妨碍了进一步的加工。不均匀冷冻可进一步导致在储存期间部分破坏在冷冻微丸的外壳上的抗FXIa抗体且部分破坏在内部不完全冷冻芯中的抗FXIa抗体。
在本发明方法的另一个实施方案中，在步骤a)中，冷却塔的内表面的温度不高于-120℃，优选≥-180℃至≤-120℃。优选地，温度为≥-160℃至≤-140℃。
对于在约≥600μm至约≤800μm的范围内的微滴尺寸，上述提及的≥-160℃至≤-140℃的温度是最佳的，所述微滴在下降2m至4m，具体约3m的距离时被冷冻。
原则上，关于下降距离没有上限。可适当地选择冷却塔中的内表面温度和下降距离，以使给定尺寸的微滴在所选择的下降距离内完全冷冻。冷却塔中的内表面温度低于-120℃，使得在可行的下降距离内完全冷冻微滴。
在本发明方法的另一个实施方案中，通过使冷却剂穿过与内表面热接触的一个或多个管来冷却冷却塔的内表面。冷却剂可以是期望温度的液氮或氮蒸气。
在本发明方法的另一个实施方案中，步骤a)中获得的微丸的微丸粒度中值(pellet size median)为约≥200μm至约≤1500μm。优选微丸粒度中值为约≥500μm至约≤900μm。
尺寸小于200μm的微丸不太有利，因为在那些微丸中，冷冻会更快，这可能导致冷冻干燥的抗FXIa抗体的损害，并因此导致损失结合亲和力，需要更高的靶剂量。此外，所得粉末的静电影响在尺寸低于200μm时显著增加，导致本工艺产品的操作性能较差，并且可预期由于微丸被截留在水蒸气中而导致的产率损失。
将微丸尺寸增加至超过1500μm可能会危及所述装备中的微丸的完全冷冻，从而损害后续产品的总体质量。
在本发明方法的另一个实施方案中，步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液的溶解固体含量为≥5重量％至≤30重量％。优选的溶解固体含量为≥10重量％至≤20重量％。
在本发明方法的另一个实施方案中，步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液的抗体浓度为≥5mg/ml至≤300mg/ml，具体地，≥50mg/ml至≤250mg/ml，更具体地，≥100mg/ml至≤200mg/ml。
给药所需的抗FXIa抗体的浓度可能相对较高，这通常引起常规获得的包含抗FXIa抗体的冻干物的重构时间不切实际地长的问题。实验发现，本发明的方法产生了包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸，这些微丸显著更快地溶解在重构介质中。这一发现是完全预料不到的。
在本发明方法的另一个实施方案中，步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液就100ml溶液而言具有以下组成，其余为注射用水：
在另一方面，本发明涉及包含可通过本发明的方法获得的抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸。如上所述，与通过常规冷冻干燥获得的冻干物或通过WO 2006/008006中所公开的类似的基于喷雾冷冻方法获得的冷冻干燥微丸相比，通过本发明的方法获得的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸显示出明显不同的特性。具体地，与通过使包含相同抗FXIa抗体的起始溶液(方法步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液)进行常规冷冻干燥或进行WO 2006/008006中所公开的冷冻干燥方法而产生的包含抗FXIa抗体的等效冻干物相比，通过本发明的方法获得的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸显示出显著更短的重构时间。扫描电子显微镜(SEM)进一步表明了通过三种不同冷冻干燥方法获得的冻干物之间的形态学差异。通过本发明的方法获得的微丸的特征在于特别均匀的表面和低的微崩解(microcollapse)发生率。
在本发明的冷冻干燥微丸的一个实施方案中，与通过常规冷冻干燥获得的包含抗FXIa抗体的冻干物相比，包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸显示出减少的重构时间。
将参照以下附图和实施例进一步描述本发明，但不希望受其限制。
附图说明
图1示意性地显示了用于本发明方法的设备。
图2示意性地描绘了在抗体溶液的常规冷冻干燥(方法1)期间随时间测量的温度和压力曲线。
图3示意性地描绘了根据WO 2006/008006中所记载的方法(方法2)在抗体溶液的冷冻和干燥期间随时间测量的温度和压力曲线。
图4示意性地描绘了本发明的方法(方法3)在抗体溶液的加工期间随时间测量的冷却塔中的温度曲线。
图5示意性地描绘了本发明的方法(方法3)在抗体溶液的冷冻和干燥期间随时间测量的温度和压力曲线。
图6显示了根据本发明的方法(方法3)制备的微丸的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图7显示了根据常规冷冻干燥(方法1)制备的冻干物的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图8显示了根据WO 2006/008006中所公开的冷冻干燥方法(方法2)制备的冻干物的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图1示意性地描绘了用于实施本发明方法的设备。该设备包括作为主要部件的冷却塔100和真空干燥室200。冷却塔包括内壁110和外壁120，由此界定内壁110和外壁120之间的空间130。
该空间130容纳呈管道形式的冷却装置140。冷却剂可以如图中箭头所示进入和离开冷却装置140。
流过冷却装置140的冷却剂导致内壁110的冷却并因此导致冷却塔100内部的冷却。在冷冻微丸(低温微丸(cryopellet))的制备中，经由喷嘴150将液体喷射到冷却塔中。液滴根据参考数字160来表示。
液滴最终在它们的向下路径上凝固(冻结)，这根据参考数字170来表示。冷冻微丸170沿着斜槽180向下移动，其中阀门190允许进入真空干燥室200。
尽管本文未描绘，但当然也可以并且甚至优选的是，斜槽180是温度可控的，以这样的方式使得在关闭阀190之前收集微丸170的同时保持微丸170处于冷冻状态。
在真空干燥室200内部，设置可旋转的筒210以容纳待干燥的冷冻微丸。旋转围绕水平轴发生以实现有效的能量转移到微丸中。热可以通过筒或经由封装的红外加热器引入。作为最终结果，获得由参考数字220表示的冷冻干燥微丸。
具体实施方式
实施例1：通过常规冷冻干燥进行冻干
本实施例描述了包含076D-M007-H04-CDRL3-N110D的液体高浓度组合物的常规冻干(方法1)。该组合物包含组氨酸-甘氨酸-精氨酸缓冲体系。加入海藻糖作为稳定剂。076D-M007-H04-CDRL3-N110D以约150mg/ml配制于：
20mM L-组氨酸、50mM L-精氨酸盐酸盐、50mM甘氨酸、5％海藻糖二水合物、0.10％聚山梨酯80，pH 5.0(组合物32)。
为了开发合适的冻干方法，必须确定崩解温度，该崩解温度决定了可进行初次干燥的温度。使用冷冻显微镜(Lyostat 2,Biopharma)采用以下方法测量崩解温度：将组合物冷冻至-50℃，然后抽真空(0.1mbar)，并将样品以1℃/分钟的速度加热至20.0℃。在加热组合物的同时，拍摄并分析图像，直到可观察到测试体系的崩解为止。
076D-M007-H04-CDRL3-N110D的崩解温度为-14.3℃，是选择以下冻干循环的必要参数。
根据常规冷冻干燥方法(方法1)加工包含抗FXIa抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D的液体组合物32。将含有150mg/ml抗FXIa抗体的溶液填充到10R I型玻璃小瓶中，并在常规小瓶冷冻干燥机中冷冻干燥。以每个小瓶2.25ml溶液填充总计20个小瓶，半加塞并装载到Virtis Genesis冷冻干燥机中。将溶液冷冻至-45℃，并在+10℃下进行初次干燥，然后在40℃下进行二次干燥步骤。完整的冷冻干燥过程需要约38个小时。在冷冻干燥机内将小瓶用塞子塞住，并在卸载后直接密封。
根据常规冷冻干燥法(方法1)对组合物32进行冻干循环的细节总结于表1中。
表1：组合物32的冻干循环(方法1)
在如此进行的常规冷冻干燥方法期间随时间测量的压力和温度曲线示意性地描绘于图2中。
上述的常规冻干方法产生了淡黄色的块或粉末，其随后可被重构。
为了重构冻干物，将2ml注射用无菌水作为重构介质注射到每个小瓶中。然后将小瓶轻轻搅动约10至20秒。通过常规冷冻干燥获得的该冻干物的重构导致137分钟的重构时间。
重构后，观察到澄清的淡黄色溶液，无任何可见的颗粒。未检测到聚集或聚集迹象。
实施例2：通过两种不同的喷雾冷冻干燥方法进行冻干
由于通过实施例1中所述的常规冷冻干燥方法(方法1)获得的冻干物的重构时间超过2小时，不能接受地长，因此应用了两种不同的其他冷冻干燥方法并将其与如上所述的常规冷冻干燥进行比较。
首先，根据WO 2006/008006中所记载的方法(方法2)加工包含抗FXIa抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D的液体组合物32。包含150mg/ml抗FXIa抗体的138ml溶液通过400μm喷嘴进行喷射，并以约19.5g/min的速率和220mbar的压力叠加在470Hz的频率下雾化。将微滴冷冻在填充有液氮的隔离容器中，该隔离容器位于喷嘴下方约25cm处并在整个过程中搅拌。喷射完成后，通过将液氮到入预冷却的筛子中除去冷冻微丸，并将微丸放在VirtisAdvantage Pro冷冻干燥机的预冷却的搁板上的衬有塑料薄膜的钢架上并冻干。初次干燥在0℃的搁板温度下进行，持续了33小时，然后二次干燥在30℃下进行5小时。干燥完成后，将干燥微丸立即转移到玻璃瓶中，将其牢固地封闭。随后，在干燥氮气气氛下，将520mg微丸称量到10R I型玻璃小瓶中。根据WO 2006/008006中所记载的方法，在抗体溶液的冷冻和干燥期间随时间测量的压力和温度曲线示意性地描绘于图3中。
其次，根据用于减少本发明的方法(方法3)的冷冻干燥微丸的重构时间的基于喷雾冷冻干燥方法加工包含抗FXIa抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D的液体组合物32，本发明的方法包括以下步骤：
a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；
b)冷冻干燥微丸。
其中在步骤a)中，微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔形成微滴来形成，该冷却塔具有温度可控的内壁表面和低于溶液的冷冻温度的内部温度，以及在步骤b)中，在位于真空室内的旋转容器中冷冻干燥微丸。
为此目的，通过将溶液喷射到壁冷式(wall-cooled)冷却塔中来冷冻干燥包含150mg/ml抗FXIa抗体的250ml溶液。喷嘴具有一个直径为400μm的孔。这对应于约800μm的微滴尺寸。振荡频率为1445Hz，偏转压力为0.4巴，并且泵以14rpm运转。干燥完成后，将干燥微丸立即转移到牢固封闭的玻璃瓶中。随后，在干燥氮气气氛下，将520mg微丸称量到10R I型玻璃小瓶中。随时间测量的冷却塔中的温度曲线示意性地描绘于图4中。在抗体溶液的冷冻和干燥期间随时间测量的温度和压力曲线示意性地描绘于图5中。
本发明的冷冻干燥方法(方法3)产生均匀的微丸，其显示出窄的尺寸和重量分布以及高的表面积。通过该方法获得的微丸中的残留湿度为0.268％。通过常规冷冻干燥(方法1)获得的冻干物包含0.15％的残留水分。
通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸的尺寸排阻色谱分析列于表2中。
表2：通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸的尺寸排阻色谱分析
总体而言，通过尺寸排阻色谱获得了三种冷冻干燥方法的可比较的分析数据。
为了确定相对于样品中存在的总蛋白质成分的完整抗体的数量，可通过毛细管SDS凝胶电泳(CGE)分析IgG纯度。在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下，使用裸露的熔融石英毛细管通过CGE分离测试样品和参考样品。该测试在非还原条件下进行。通过220nm处的吸光度监测分离的样品。该测定的目的是整合主峰的峰面积并分析还原后的副产物。
毛细管凝胶电泳(CGE)和ELISA分析的结果列于表3中。表3：通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸的毛细管凝胶电泳(CGE)和ELISA分析
通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸的重构时间比较如下。将2ml无菌注射用水作为重构介质注射到每个小瓶中。拍摄图像后，将小瓶轻轻搅动约10至20秒。目视观察微丸随时间的重构，并照相记录。
通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸的重构时间如下给出：
用本发明的方法(方法3)获得的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的重构显著快于通过常规冷冻干燥(方法1)获得的包含抗FXIa抗体的等效冻干物的重构，与根据WO 2006/008006(方法2)获得的冷冻干燥微丸相比也更快。
然后，将通过三种不同的冷冻干燥方法获得的微丸进行扫描电子显微镜(SEM)测量。因此，样品的制备在氮气气氛下在手套袋中进行，每个样品单独制备。将样品放在支架上并用金溅射。随后进行扫描电子显微镜测量。SEM图像如图6至8所示。
可以看出，根据本发明的方法制备的微丸显示出特别均匀的形态，这可以在后面的工艺步骤中改善处理性能。
Claims (13)
1.用于制备包含抗凝血因子XIa(FXIa)抗体的冷冻干燥微丸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；
b)冷冻干燥所述微丸；
其特征在于
在步骤a)中，所述微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔(100)形成微滴来形成，所述冷却塔(100)具有温度可控的内壁表面(110)和低于溶液的冷冻温度的内部温度，
和
在步骤b)中，在位于真空室(200)内的旋转容器(210)中冷冻干燥所述微丸。
2.与通过常规冷冻干燥获得的包含抗FXIa抗体的冻干物相比，用于减少包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸的重构时间的方法，所述方法包括以下步骤：
a)冷冻包含抗FXIa抗体的溶液的微滴以形成微丸；
b)冷冻干燥所述微丸；
其特征在于
在步骤a)中，所述微滴借助于使包含抗FXIa抗体的溶液进入冷却塔(100)形成微滴来形成，所述冷却塔(100)具有温度可控的内壁表面(110)和低于溶液的冷冻温度的内部温度，
和
在步骤b)中，在位于真空室(200)内的旋转容器(210)中冷冻干燥所述微丸。
3.根据权利要求1或2的方法，进一步包括步骤b)之后的步骤c)和d)：
c)储存并均质化冷冻干燥微丸；
d)将冷冻干燥微丸装载到容器中。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤a)中，所述微滴借助于使溶液穿过频率辅助喷嘴形成微滴来制备。
5.根据权利要求4的方法，其中振荡频率为≥200Hz至≤5000Hz，更具体地，≥400Hz至≤4000Hz或为≥1000Hz至≤2000Hz。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中在步骤a)中，冷却塔(100)的内表面(110)的温度≤-120℃。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中通过使冷却剂穿过与内表面(110)热接触的一个或多个管(140)来冷却所述冷却塔(100)的内表面(110)。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中步骤a)中获得的微丸的微丸粒度中值为约≥200μm至约≤1500μm，具体地，约≥500μm至约≤900μm。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液的溶解固体含量为≥5重量％至≤30重量％，具体地，≥10重量％至≤20重量％。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液的抗体浓度为≥5mg/ml至≤300mg/ml，具体地，≥50mg/ml至≤250mg/ml，更具体地，≥100mg/ml至≤200mg/ml。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤a)中包含抗FXIa抗体的溶液就100ml溶液而言具有以下组成，其余为注射用水：
12.包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸，其可通过权利要求1和3-11中任一项的方法获得。
13.根据权利要求12的包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸，其中与通过常规冷冻干燥获得的包含抗FXIa抗体的冻干物相比，包含抗FXIa抗体的冷冻干燥微丸表现出减少的重构时间。
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