CN112359001B - 一种解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96‑3微生物菌剂及其应用，本发明从新疆库尔勒香梨园香梨花上分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96‑3，利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96‑3制备的微生物菌剂，将其应用于制备防治香梨花腐病的药物中，菌株xl96‑3对棉花香梨枝枯病菌的抑菌圈直径为9.33mm，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96‑3微生物菌剂原液和稀释5000倍的防效最高，对香梨花腐病的防效率分别为96.32％和94.97％，对香梨枝枯病的防效率分别为94.88％和92.79％，进一步统计香梨单果重和产量，单果重和产量明显增加，表明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96‑3及其微生物菌剂对香梨花腐并具有专一和高效性，对于香梨花腐病生物防治具有广泛的应用价值。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂及其在制备防治香梨花病药物中应用的技术领域。
背景技术
我国是世界第一产梨大国,中国梨在世界梨产业发展中有举足轻重的位置。花腐病是引起梨、苹果、山楂、海棠和榅桲等蔷薇科植物的细菌病害，症状表现为花腐、枝枯、大枝及树干枯死，严重的整树枯死。该病害对新疆梨、苹果等产业造成了严重危害，损失巨大。尤其是库尔勒香梨，由于其对该病害极其敏感，17年至今造成大流行，已经影响了香梨产业的安全，政府也正在投入巨大的财力和技术力量积极防控。
花腐病的发病机理主要是病菌在病果、病叶、病枝上形成的菌核越冬。第二年的春季，土壤温度在2℃以上，土壤湿度在30％以上时，菌核产生子囊盘，子囊盘在气温5℃以上，易产生子囊孢子，随风传播，侵入叶、花，引起叶腐、花腐。病叶、病花上产生的分生孢子侵入柱头，通过花粉管达胚囊，再经子房壁到达表面，引起果腐，再由果腐引起枝腐。香梨花腐病在果树的树皮溃疡斑上越冬，春季通过雨水和昆虫传播至花上引起花腐，然后引起枝枯和枝干枯死。花期的防控是该病害的防治关键。
目前多采用化学农药防治田间病害的发生，化学杀菌剂多为人工合成物质，自然界一般无相应的微生物降解途径，因而导致果木及土壤有大量农药降解残毒，在环境中累积并通过物质循环进入生物链。化学杀菌剂在使用一定时间后，往往使病原菌产生抗药性，逼迫人们研发和使用药劲更猛的杀菌剂，但并不能消除病原菌因长期使用农药所产生的抗药性。而在香梨盛花期，化学杀菌剂亦成为蜜蜂的头号杀手，也成为蜜源的安全隐患，造成严重的经济损失。国家大力倡导“两减”政策，如何开发出新一代生态安全的杀菌剂成为亟待解决的问题。目前，很多人开始从生防的角度来寻找答案，并且已经有很多生物农药应用于生产实践中，在苹果、山楂、枇杷花腐病的防治方面取得一定的经济效益和生态效益，但是尚未报道有关香梨花腐病防治方面研究。
发明内容
针对现有技术尚未记载有关解淀粉芽孢杆菌领域在香梨花腐病防治方面应用的技术现状，本发明旨在于提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂及其应用，本发明从新疆库尔勒香梨园香梨花上分离得到的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3，利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3制备的微生物菌剂，将其应用于制备防治香梨花腐病的药物中，菌株xl96-3对棉花香梨枝枯病菌的抑菌圈直径为9.33mm，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂原液和稀释5000倍的防效最高，对香梨花腐病的防效率分别为96.32％和94.97％，对香梨枝枯病的防效率分别为94.88％和92.79％，进一步统计香梨单果重和产量，单果重和产量明显增加，表明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3及其微生物菌剂对香梨花腐并具有专一和高效性，且对蜜蜂没有产生副作用，对于香梨花腐病生物防治具有广泛的应用价值。
为了达到以上技术目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂，该微生物菌剂包括利用新菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3发酵代谢获得，其中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的活菌数不低于108CFU/mL。
本发明中，菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3分离筛选自新疆库尔勒香梨园梨树花上，并经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定及菌种的生理生化***试验验证，证实获得的芽孢杆菌(Bacillus)范畴内属于一种典型的新菌种，该菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No：20561，保藏日期：2020年08月28日。
上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3菌种的基因序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的分离纯化LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂17g，加蒸馏水至1.0L，pH值为7.0；
本发明中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的富集Landy液体培养基：葡萄糖20g，L-谷氨酸5g，MgSO40.5 g，KCl 0.5g，KH2PO41.0g，Fe2SO4·6H2O0.15mg，MnSO4·H2O 5.0mg，CuSO4·5H2O 0.16mg，加蒸馏水至1.0L，pH值为7.0。
同时，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，于28-32℃培养箱培养20-26h，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3菌株。
(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3菌株接种到100mL LB液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为120-140r/min的条件下震荡培养20-26h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液。
(3)将步骤(2)所得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3种子液，按照质量体积比为4-6％的接种量接入到Landy液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，180-220r/min震荡培养32-48h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3发酵液。
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的液体或者固体制剂。
本发明所述一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3种子液的接种量为5％，发酵温度为30℃，发酵时间为40h
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂在制备防治香梨花腐病药物中的应用。
通过实施本发明提供的上述具体技术方案实施本发明内容，可以得到以下有益效果：
(1)本发明提供一种新菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3，经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定及菌种的生理生化***试验验证，证实获得的解淀粉芽孢杆菌范畴内菌种编号为xl96-3属于一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
(2)提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3及其微生物菌剂在制备防治香梨花腐病药物中应用，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3对香梨枝枯病菌的抑菌圈平均直径为9.33mm，在香梨盛花期叶面喷施和释放蜜蜂，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂生防效果可达90％以上，通过产量统计发现产量提高了19.6％～23.5％，对于香梨花腐病生物防治具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为菌株xl96-3基于16S rDNA序列构建***发育树图。
图2为菌株xl96-3基于gyrB基因序列构建***发育树图。
图3为菌株xl96-3对枝枯病菌平板拮抗图。
图4为菌株xl96-3对砀山梨花粉萌发的影响图，其中A为纯花粉，B为花粉+生防菌。
图5为菌株xl96-3盛花期喷施生防菌对花腐病发病率的影响图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的分离纯化LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂17g，加蒸馏水至1.0L，p H值为7.0；
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的富集Landy液体培养基：葡萄糖20g，L-谷氨酸5g，MgSO40.5 g，KCl 0.5g，KH2PO41 g，Fe2SO4·6H2O 0.15mg，MnSO4·H2O 5.0mg，CuSO4·5H2O 0.16mg，加蒸馏水至1.0L，pH值为7.0。
测定方法：
(1)单果重：香梨成熟采收前进行测定，在试验田选取五个点，每个点在香梨树东、西、南、北四个方向随机摘取30个香梨，分别称重，取平均值即为单果重。
(2)产量：准确数出每株树所结的果实总数，以每棵树的结果总数与这棵树的平均单果质量之积计算单株产量，测得单株产量后折合每公顷的总产量。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3的分离、筛选及鉴定
(一)分离、纯化
香梨花2019年采自新疆库尔勒市香梨园，取10朵梨花置于土样与20mL生理盐水中，摇床上震荡30min，静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度，80℃水浴10min。吸取200μL稀释液涂布于LB培养基平板，置于30℃培养箱培养24h。从平板中挑取单菌落，接种于新的分离平板中进行纯化，重复3-4次进行纯化。纯化后的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3接种于培养基上，30℃培养箱恒温培养3-6d后，4℃保存备用。
(二)分类、鉴定
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3(以下简称为“菌株xl96-3”)16SrRNA和gyrB基因的序列测定与分析：
(1)PCR模板DNA的提取
将菌株xl96-3接种于LB培养基中，转速180r/min，30℃震荡培养10h，离心收集菌体，采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA提取。
(2)PCR扩增
16Sr RNA的PCR扩增引物：
UP1f：5’-GGATCCTAATACATGCAAGTCGAGCGG-3’；
UP2r：5’-GGATCCACGTATTACCGCGGCTGCTGGC-3’。
gyrB基因的PCR扩增引物：
UP1f：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’；
UP2r：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。
反应体系：
组成 体积/μL
2XMix 25
UP2r 1
UP2r 1
菌样模板 1
ddH<sub>2</sub>0 22
PCR扩增条件为：预变性95℃，4min；变性94℃，1min；退火62℃，1min；延伸72℃，2min；34个循环；延伸72℃，10min，4℃保存。
(3)序列测定
PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，对菌株xl96-3的16S rDNA和gyrB序列进行测序，通过DNAstar软件拼接得到其16SrDNA的部分有序序列，长度分别为1400bp和1200bp，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，分别于Gen Bank进行BLAST同源序列检索，利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立***进化树(重复抽样1000次)，结果见附图2-3。经比对分析发现，菌株xl96-3的16Sr DNA基因序列与Bacillus amyloliquefaciens Lx-11的同源性最高，相似性为99％，菌株xl96-3的gyrB基因序列与Bacillus amyloliquefaciens CC178的同源性最高，相似性为96％；以16Sr DNA基因序列构建的***发育树中，菌株xl96-3的16Sr DNA序列与Bacillusamyloliquefaciens(登录号为：HQ179100.1)的亲缘关系最近，置信度为99；以gyrB基因序列构建的***发育树中，菌株xl96-3的gyrB序列同样与Bacillus amyloliquefaciens(登录号为：JQ658430.1)的亲缘关系最近，置信度为98，表明菌株xl96-3作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，通过菌种的相似性和同源性的综合判定，经过本领域熟知公认的菌种***分子水平鉴定，证实获得的芽孢杆菌(Bacillus)属范畴内菌种编号为xl96-3属于一种典型的新菌种。
基于以上生物学特征，将上述菌株xl96-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)分支中新菌种。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期：2020年8月28日，保藏号为CGMCC No：20561。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3 CGMCC No：20561生理生化特性测定
菌株xl96-3的生理生化特性情况如表1所示。
菌株xl96-3***，杆状，该菌能利用D-木糖、柠檬酸盐，水解淀粉，但不能利用L-***糖、D-甘露醇和丙酸盐。V-P试验、明胶液化和硝酸盐还原等生理生化试验呈阳性。需盐性及耐盐性测试表明，pH值为5.7，盐浓度7％为阳性。根据菌株xl96-3的形态特征、生理生化特性以及《伯杰细菌鉴定手册》进行分析，这些生理生化特性与革兰氏阳性菌芽孢杆菌具有较大的相似性。
表1：生理化特性测定
生理生化特性 xl96-3
革兰氏染色 +
D-木糖 +
L-***糖 -
D-甘露醇 -
柠檬酸盐利用 +
丙酸盐 -
硝酸盐还原 +
淀粉水解 +
明胶液化 +
V-P +
PH5.7生长 +
7％NaCl生长 +
通过对菌株xl96-3生理生化性质的测试，根据《芽孢杆菌属》和《微生物分类学》以及《常见细菌***鉴定手册》，将菌株xl96-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)新种。
综合16S rDNA基因和gyrB序列和同源性对比分析以及生理化试验对比的结果，本发明提供的菌株xl96-3与常见的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)同属范围内菌种具有鲜明的区别，具有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)同属内新菌种的特性。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备
本实施例在实施例1-2的基础上，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，于28-32℃培养箱培养20-26h，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3菌株。
(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3菌株接种到100mL LB液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为120-140r/min的条件下震荡培养20-26h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液。
(3)将步骤(2)所得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3种子液，按照质量体积比为4-6％的接种量接入到Landy液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，180-220r/min震荡培养32-48h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3发酵液。
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的液体或者固体制剂。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液接种量为5％，发酵温度为30℃，发酵时间为40h。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液接种量为4％，发酵温度为28℃，发酵时间为32h。
实施例6：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液接种量为6％，发酵温度为32℃，发酵时间为48h。
实施例7：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂的制备方法，其中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3种子液接种量为5％，发酵温度为30℃，发酵时间为44h。
实施例8：菌株xl96-3对香梨花腐病菌的抑菌作用
采用平板抑菌法，吸取5mL液体培养24h的香梨花腐病原菌菌液于放凉至40℃左右的LB培养基中摇匀后倒平板吹干。在上述平板中无菌滤纸片，吸取液体培养24h的芽孢杆菌菌液5μL滴加于滤纸片之上，30℃恒温培养20h。观测菌株xl96-3对香梨花腐病菌的抑菌效果，结果参见附图3所示。
由附图3结果可知，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)xl96-3对香梨花腐病菌的抑菌圈直径为9.33mm，表明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3对香梨花腐病菌生长具有明显的抑制作用，具有防治香梨花腐病菌的生防潜力。
实施例9：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂在香梨花腐病菌防治中的应用
(1)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂对砀山梨花腐病防效试验
采集砀山梨盛花期大蕾，待花粉阴干后收集花粉，与生防菌剂1:1混合，播于0.1g/L硼酸+100g/L蔗糖+10g/L琼脂的固体培养基上，单独播花粉作为对照，3次重复，20℃下暗培养4h，统计花粉萌发率。每个处理观察3个视野，每个视野花粉粒不少于30个，以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发，具体结果参见附图4所示。
由附图4结果可知，单独播花粉及生防菌与花粉混合萌发率均为83％左右，无明显差异，表明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3菌株对砀山梨花腐萌发无抑菌作用。
(2)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂香梨花腐病的防效试验
本试验对本发明实施例4制备的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂分别稀释500倍、1000倍和5000倍后进行叶面喷施处理+蜜蜂导向盒，对市售的植物源防治剂+蜜蜂导向盒、化学防治剂+蜜蜂导向盒按照说明进行喷施处理，同时对本发明实施例5-7也进行试验，并统计香梨花腐病的发病率和最终产量，具体结果见表2和附图5。
表2：本发明与其他香梨花腐病防治剂防治效果对比
Figure GDA0003858434450000121
由表2及附图5数据可知，在香梨盛花期叶面喷施和释放蜜蜂，本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂较市售的植物源防治剂和化学防治剂，生防效果显著增强，对香梨花腐病和枝枯病生防效果均可达90％以上，其中，实施例4提供的微生物菌剂原液和稀释5000倍后的生防效果最佳，且在单果果重及产量上均有显著提高，单果重较市售的植物源防治剂和化学防治剂试验组提高了4.3％～7.7％，产量提高了19.6％～23.5％；进一步对蜜蜂的数量也进行了统计，发现本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂在喷施过程中对蜜蜂的影响较小，没有出现蜜蜂数量的急剧减少现象，而化学防治剂在喷施过程中蜜蜂的数量明显减少，且有蜜蜂死亡现象，这表明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3微生物菌剂副作用小，且对香梨花腐病的防治效果佳。
以上试验表明，本发明通过分离筛选自新疆库尔勒香梨园梨树花的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3，菌株xl96-3及其微生物菌剂具有显著的香梨花腐病生物防治能力，菌株xl96-3对香梨枝枯病菌的抑菌圈平均直径为9.33mm，香梨盛花期叶面喷施和释放蜜蜂，其生防效果可达90％以上，通过产量统计发现产量提高了19.6％～23.5％，对于香梨花腐病生物防治具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 巴州加木农业科技有限公司
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens XL96-3)
<400> 1
agaggcgggg tgctataatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa 1440
ggtcacagat t 1451
<210> 2
<211> 1193
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens XL96-3)
<400> 2
gggcacatga cgctagatta cctgctggga tacgcgcttt ttcaagatta aaatcttctc 60
cgattcctgt tccgagggcc gtgatcattg atctgacctc attgtttgag agaattttat 120
caagtctggc tttctcaacg ttcagaatct taccgcgcag cggcagaatg gcttggaaat 180
gacggtcccg tccctgtttc gctgatccgc ccgcagagtc accctctacg atatacagct 240
cggaaatgct cggatcttta gaagaacagt ccgccagttt gcccggcaga ttggaaatct 300
caagcgcact tttgcggcgg gtcaattccc gcgctttttt cgctgccatc cgcgctcttg 360
cggccattaa acctttttca acgattttgc gggctgagtc cggattttca agaaggaatg 420
tttccagcgc agaagaaaac agcgtatcag tgatcgttct cgcttcggag ttgccgagct 480
tcgttttcgt ctgcccttcg aattgcggat cagggtgctt aattgaaata atggcagtca 540
gcccttctct cacatcatcc ccgcttaaat tcggatcatt ttctttgaaa atcccttttc 600
ttcttgcata gtcgtttatg acacgggtca gaccggtttt aaatccggct tcgtgcgtcc 660
cgccttcgta tgtgttgatg ttatttgtga aagaataaat gttgcttgta tagctgtcgt 720
tgtattgcaa cgcaacttca accgttatgc cgtctttctc gccttcgata taaatcggct 780
cttcatgaac gacttctttg gaacggttta agtactcaac atagcttttg attccgcctt 840
cgtagtggta ctcgtttttc cgttcttgtc cttcacgttt gtcttcaatc gtgatgttta 900
cgccttttgt caggaaggcc aattcccgga cacggtttga aagcagatca tagtcgtata 960
cgattgtttc tttgaagatt tccggatccg gaacgaagtg cgtaatcgtt ccggtcttat 1020
cagtatcacc gatcacttca agatcagcca caggtacacc gcgctcgtac gcctgatagt 1080
ggatttttcc gtcacgatga accgtaacgt caagagtggt cgacaaggcg tttacgacgg 1140
acgcccctac accgtgaaga ccgccggata catatatccg ctgcagtatc cgc 1193

Claims (4)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3经过发酵获得；所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20561。
2.如权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3微生物菌剂的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，于28-32℃培养箱培养20-26h，即得活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3菌株；
(2) 用无 菌 的 接 种 环 刮取 一 环 步 骤 (1) 活 化 的 解 淀 粉 芽 孢 杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3 CGMCC No. 20561菌株接种到100m L LB液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为120-140 r/min的条件下震荡培养20-26 h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3种子液；
(3)将步骤(2)所得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3种子液，按照质量体积比为4-6％的接种量接入到Landy液体培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，180-220 r/min震荡培养32-48h，得解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3发酵液；
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时停止发酵培养，根据需要制备获得解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3微生物菌剂的液体或者固体制剂。
3.如权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3微生物菌剂的制备方法，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)xl96-3种子液的接种量为5％，发酵温度为30℃，发酵时间为40h。
4.如权利要求1所述一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) xl96-3微生物菌剂在制备防治香梨花腐病药物中的应用。
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