CN112358981A - 一种植物乳杆菌及其在断奶幼兔饲料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于微生物育种技术领域，提供了一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS007，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16947；本发明还提供了一株植物乳杆菌在断奶幼兔饲料中的应用。借此，本发明的植物乳杆菌PLBS007具有较好的热稳定性、酸稳定性，在断奶幼兔日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS007，能够降低断奶幼兔的腹泻率和死亡率，提高断奶幼兔的平均日增重和免疫球蛋白含量，增强断奶幼兔的免疫能力，减轻断奶应激，提高断奶幼兔的经济效益。

Description

一种植物乳杆菌及其在断奶幼兔饲料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌及其在断奶幼兔饲料中的应用。
背景技术
断奶幼兔腹泻一直是影响实验兔产量和质量的重要原因，也是困扰整个养兔业发展的重大难题。产生腹泻的原因主要是断奶幼兔消化机能不完善，极易受外界环境、饲粮营养等因素影响造成肠道中微生物区系比例失衡，使有害菌大量增殖，不能被有益菌群所抑制。寻找一种安全、天然且可防治断奶幼兔腹泻的饲料原料，是实验兔饲养迫切需要解决的问题之一。
益生菌可产生多种酶，帮助宿主消化吸收，促进蛋白及钙等吸收，还可合成微生物等，维持机体生理代谢，具有抗氧化、提高免疫及调节肠道等功能。
植物乳杆菌是一种源自人类肠道的革兰氏阳性菌，具有抗炎特性和保护肠道屏障作用，能够调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，同时植物乳杆菌能分泌抗生物素类物质，对肠道致病菌产生拮抗作用，可改善动物肠道微生态平衡、促进生长及预防疾病；还耐受酸和胆汁、消除乳糖不耐症、降低胆固醇、抑制并治疗腹泻及增强机体免疫等。但是，植物乳杆菌在断奶幼兔中的应用研究鲜有报道，其添加量及效果也不尽相同。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌，具有较好的热稳定性、酸稳定性，在断奶幼兔日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS007，能够降低断奶幼兔的腹泻率和死亡率，提高断奶幼兔的平均日增重和免疫球蛋白含量，增强断奶幼兔的免疫能力，减轻断奶应激，提高断奶幼兔的经济效益。
为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS007，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16947。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌取自牛乳。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在断奶幼兔的基础日粮中的添加量为70～400mg/kg。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在断奶幼兔的基础日粮中的添加量为186～289mg/kg。
根据本发明的植物乳杆菌，本发明还提供一种筛选植物乳杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤一混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基培养，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；
步骤二菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的所述稀释液涂布于MRS初筛培养基中培养，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落；
步骤三菌株复筛
将所述初筛菌落接种于MRS培养基继续培养，收集上清液，用滤膜过滤除菌，制备无菌上清液；
制备指示菌平板，然后在牛津杯中添加所述无菌上清液，预扩散后继续培养，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
根据本发明筛选植物乳杆菌的方法，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L。
根据本发明筛选植物乳杆菌的方法，所述步骤三中，所述滤膜选用0.22μm滤膜。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在断奶幼兔饲料中的应用。
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌，本发明提供的植物乳杆菌PLBS007，具有较好的热稳定性、酸稳定性，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。在断奶幼兔日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS007，能够降低断奶幼兔的腹泻率和死亡率，提高断奶幼兔的平均日增重和免疫球蛋白含量，增强断奶幼兔的免疫能力，减轻断奶应激，提高断奶幼兔的经济效益。
附图说明
图1是本发明植物乳杆菌PLBS007的菌落形态图；
图2是本发明植物乳杆菌PLBS007的生长曲线图；
图3是本发明植物乳杆菌PLBS007的热稳定性试验图；
图4是本发明植物乳杆菌PLBS007的酸稳定性试验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一株植物乳杆菌，拉丁文学名：Lactobacillus plantarum；该植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS007，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.16947。
本发明的植物乳杆菌取自牛乳，本发明提供了植物乳杆菌PLBS007的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液。
MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L，115℃灭菌20分钟。
步骤二菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的稀释液涂布于MRS初筛培养基中，37℃培养24～36h，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落。
步骤三菌株复筛
将初筛菌落接种于MRS培养基，37℃培养24h，8000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，制备无菌上清液。
以S.aureus ATCC14458为指示菌，在营养琼脂培养基中添加S.aureus ATCC14458菌液，终浓度为106CFU/mL，制备指示菌平板，采用牛津杯琼脂扩散法，牛津杯中添加无菌上清液50μL，4℃冰箱预扩散10h后于37℃培养14h，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
本发明还提供了植物乳杆菌PLBS007的鉴定方法，包括形态学鉴定和基因序列鉴定。
形态学鉴定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对复筛菌株进行形态观察和生理生化鉴定。
(参见图1)
由图1可知，菌落边缘整齐无锯齿状，呈乳白色，表面光滑不透明。
基因序列鉴定
将复筛菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，根据得到的16S r RNA序列信息与NCBI的16S数据库进行比对，设置参数identify>95。然后选取identify最高的前30条16S r RNA序列(不足则全取)，并利用muscle软件进行序列多重比对后，采用FastTree软件构件***发育树。结果显示，复筛菌株与已发表的植物乳杆菌Lactobacillusplantarum JDM1最接近。因此，将复筛菌株归为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌PLBS007。
为了验证本发明的植物乳杆菌PLBS007的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、热稳定性、酸稳定性和抑菌活性试验。
菌株的生长曲线
将复筛菌株接种于MRS培养基上，37℃恒温培养，每隔一定时间取样，分别涂布到平板上，测定活菌数，绘制菌株生长曲线。(参见图2)
由图2可知，植物乳杆菌PLBS007在MRS培养基中生长迅速，在0～4h生长缓慢，4～12h左右进入对数期，12～50h生长缓慢，基本保持稳定；随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，50h后菌株数量开始下降，72h后进入稳定期。
菌株的热稳定性
将复筛菌株的发酵上清液，分别在4、25、50和100℃处理30min，121℃下处理20min(使用灭菌锅处理)。处理完成后立即进行抑菌试验。(参见图3)
由图3可知，不同温度处理后，复筛菌株的抑菌性无显著性差异。121℃处理20min后，复筛菌株的抑菌性无明显下降。说明植物乳杆菌PLBS007的热稳定性较好，一般的热加工对植物乳杆菌PLBS007的抑菌性影响不大。
菌株的酸稳定性
用3mol/L NaOH溶液将复筛菌株的发酵上清液pH调节至4.0、5.0、6.0和7.0，并保持30min，处理结束后采用打孔法测试抑菌活性。(参见图4)
由图4可知，随着pH的逐渐升高，复筛菌株发酵上清液的抑菌性逐渐下降，在pH中性条件下，复筛菌株发酵上清液仍有良好的抑菌性，说明植物乳杆菌PLBS007的发酵上清液具有良好的酸稳定性。
菌株的抑菌活性
分别以单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌做抑菌试验，验证复筛菌株对食品中常见革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果。(参见表一)
该复筛菌株产生的抑菌物质对7株指示菌中的4株有抑制作用，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。
表一复筛菌株的抑菌普
Figure BDA0002743783470000061
抑菌圈直径+++为19～24mm，++为15～18mm，+为10～14mm，—为无抑菌效果。
由于植物乳杆菌PLBS007具有较好的热稳定性、酸稳定性，因此，本发明将植物乳杆菌PLBS007应用于断奶幼兔饲料中，为了验证本发明的植物乳杆菌PLBS007在断奶幼兔饲料中的应用价值，本发明还提供一株植物乳杆菌在断奶幼兔饲料中的应用方法。
一、试验动物及饲养管理
选取体重一致的40日龄断奶实验兔(品种为日本大耳白兔)48只，随机分为4个处理组(对照组和三个试验组)，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮基础上添加植物乳杆菌PLBS007。试验期35天，其中预试期7天。
试验前对兔舍进行彻底清理并消毒，对全部断奶幼兔进行驱虫、免疫注射、打耳号。光照、通风等饲养环境条件一致。
参考《实验动物兔配合饲料》(GB14924.4-2001)和NRC(1977)兔营养需求，并按照断奶幼兔养殖场的配方配制。
二、饲料配方
在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，添加量为70～400mg/kg。
三、测定指标
在试验期间，记录各组试验兔健康情况。
在14、21和35d测定各组仔兔的体重，计算平均日增重。每天记录各组仔兔的采食量，计算平均日采食量。
试验第35d，每组取10只试兔，空腹，经耳动脉取血，分离血清。用于测定血清免疫球蛋白含量。
为了进一步验证本发明的植物乳杆菌PLBS007在断奶幼兔饲料中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养断奶幼兔，设置如下若干实施例，并对各实施例中断奶幼兔的相关指标进行测定。各实施例中断奶幼兔的饲养管理方法相同，仅改变实施例中植物乳杆菌PLBS007的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。
各实施例中植物乳杆菌PLBS007的添加量见表二；各实施例中断奶幼兔的相关指标结果见表三、表四。
对比例
在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，添加量为0。
养殖完成后，测得断奶幼兔的平均日增重为19.45g、平均日采食量为81.05g、料重比为4.17、腹泻率为％，死亡率为2.34％；测得断奶幼兔的免疫指标中，免疫球蛋白A的含量为4.37μg/mL、免疫球蛋白G的含量为21.34μg/mL、免疫球蛋白M的含量为2.23μg/mL。
实施例1
在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，添加量为186mg/kg。
养殖完成后，测得断奶幼兔的平均日增重为25.67g、平均日采食量为82.04g、料重比为3.20、腹泻率为0.83％，死亡率为14.23％；测得断奶幼兔的免疫指标中，免疫球蛋白A的含量为6.03μg/mL、免疫球蛋白G的含量为25.58μg/mL、免疫球蛋白M的含量为3.54μg/mL。
实施例2
在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，添加量为226mg/kg。
养殖完成后，测得断奶幼兔的平均日增重为25.92g、平均日采食量为81.93g、料重比为3.16、腹泻率为0.91％，死亡率为13.65％；测得断奶幼兔的免疫指标中，免疫球蛋白A的含量为6.14μg/mL、免疫球蛋白G的含量为25.44μg/mL、免疫球蛋白M的含量为3.61μg/mL。
实施例3
在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，添加量为289mg/kg。
养殖完成后，测得断奶幼兔的平均日增重为24.83g、平均日采食量为82.66g、料重比为3.32、腹泻率为0.94％，死亡率为13.97％；测得断奶幼兔的免疫指标中，免疫球蛋白A的含量为6.06μg/mL、免疫球蛋白G的含量为25.71μg/mL、免疫球蛋白M的含量为3.59μg/mL。
由于各实施例的实施过程均相同，因此，其他实施例的具体过程不再列出，仅列出上述三个效果较好的实施例。
表二各实施例中植物乳杆菌PLBS007的添加量mg/kg
Figure BDA0002743783470000091
表三断奶幼兔的生产性能g
Figure BDA0002743783470000092
表四断奶幼兔的免疫指标
Figure BDA0002743783470000101
由上述实施例可以看出，在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，不影响断奶幼兔的平均日采食量，能够提高断奶幼兔的平均日增重，降低断奶幼兔的料重比，说明植物乳杆菌PLBS007增强了断奶幼兔的肠道消化酶活性，提高了断奶幼兔对营养物质的利用率。植物乳杆菌PLBS007用作饲料添加剂加入到肉兔饲粮中，可以调节肠道菌群、增强胃肠道的消化吸收功能，保持益生菌优势地位，促进肠胃消化吸收。
由上述实施例可以看出，在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，能够降低断奶幼兔的腹泻率和死亡率，说明植物乳杆菌PLBS007增强了断奶幼兔的抗菌、抗炎作用，提高其抗病能力，提高断奶幼兔的成活率。植物乳杆菌PLBS007用作饲料添加剂加入到肉兔饲粮中，可以降低肉兔发病率和死亡率，提高肉兔的养殖经济效益。
由上述实施例可以看出，在断奶幼兔的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS007，能够提高断奶幼兔血液中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量，说明植物乳杆菌PLBS007增强断奶幼兔的免疫能力，使断奶幼兔肠道免疫防御水平提高，防止断奶幼兔腹泻，减轻断奶应激，促进断奶幼兔生长。
另外，通过上述实施例可以看出，在断奶幼兔的基础日粮中添加植物乳杆菌PLBS007的添加量为186～289mg/kg时，断奶幼兔的平均日增重最多，料重比、腹泻率和死亡率最低，免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量最高，因此，在断奶幼兔的基础日粮中，植物乳杆菌PLBS007的最适添加量为186～289mg/kg。
综上所述，本发明提供的植物乳杆菌PLBS007，具有较好的热稳定性、酸稳定性，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。在断奶幼兔日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS007，能够降低断奶幼兔的腹泻率和死亡率，提高断奶幼兔的平均日增重和免疫球蛋白含量，增强断奶幼兔的免疫能力，减轻断奶应激，提高断奶幼兔的经济效益。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS007，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.16947。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌取自牛乳。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌在断奶幼兔的基础日粮中的添加量为70～400mg/kg。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌在断奶幼兔的基础日粮中的添加量为186～289mg/kg。
5.一种筛选权利要求1所述的植物乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基培养，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；
步骤二菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的所述稀释液涂布于MRS初筛培养基中培养，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落；
步骤三菌株复筛
将所述初筛菌落接种于MRS培养基继续培养，收集上清液，用滤膜过滤除菌，制备无菌上清液；
制备指示菌平板，然后在牛津杯中添加所述无菌上清液，预扩散后继续培养，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
6.根据权利要求5所述的筛选所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温80 1mlg/L，蒸馏水1L。
7.根据权利要求5所述的筛选所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述滤膜选用0.22μm滤膜。
8.一种根据权利要求1所述的植物乳杆菌在断奶幼兔饲料中的应用。
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