CN112335556B - 一种新型圈养野生动物管理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型圈养野生动物管理方法，其特征在于：(1)铺设发酵床和/或垫料层：在动物笼舍的室内地面和/或室外地面、或橱窗式展舍铺设基于松树皮和益生菌组成的垫料层或发酵床，或者，将垫料层与拟生态园林造景相结合模拟动物自然栖息环境；(2)日常管理：无需每天清洗笼舍或橱窗式展舍；(3)消毒：无需对动物笼舍或橱窗式展舍进行定期常规消毒。本发明的管理方法，为动物提供了更加自然、舒适的生活环境，有助于动物自然行为的表达，丰富了动物生活环境中的微生物群落，而且简化了日常操作流程，减少了动物笼舍的消毒频次，简化了日常管理流程，对室内温度、湿度环境具有一定的调节作用，提升了动物福利和健康水平。

Description

一种新型圈养野生动物管理方法

技术领域

本发明涉及野生动物管理领域，特别是涉及一种新型圈养野生动物管理方法。

背景技术

国内动物园及其它野生动物饲养单位的动物笼舍基本结构包括：(1)内室或室内展厅：基本都是混凝土地面或其它类似的硬质地面；(2)室外运动场：主要有泥地、混凝土地面或其它类似硬质地面、或在前述地面上铺沙，近年来有越来越多的野生动物笼舍采用种植草坪或其它植物或加上水池、瀑布等拟生态景观。

根据中华人民共和国行业标准《动物园管理规范》(CJJ/T 263-2017)，动物园应制定动物饲养操作规程、动物卫生消毒操作规程等规范要求。日常管理包括：(1)每天对笼舍进行清扫、用水冲洗室内地面(《动物园饲养管理规范》)；(2)定期对笼舍和环境进行常规消毒。《动物园消毒管理规范》(征求意见稿)对笼舍消毒的具体要求是：a)内舍(内室) 冬季宜每周1次，其余季节每周2次；b)外舍(室外运动场)宜每月消毒1～2次，南方高温季节宜增加频次，北方冬季可降低频次。

现行动物园动物笼舍及其日常管理存在以下不足：

1.动物园动物笼舍受气候影响大，冬季地表温度偏低，潮湿天气湿度太大，特别是在清洗地面后，不易干燥，而气候过于干燥，也影响动物生活的舒适性。

2.混凝土地面质地太硬，表面要么过于粗糙，要么过于光滑，容易伤到动物的足垫和关节。

3.为了保证动物健康和饲养环境的清洁卫生，每天需要对动物笼舍进行清扫、用水冲洗地面、风机吹干地面积水，不仅耗费劳动力和水资源，而且地面积水不易干燥，容易滋生霉菌或其它致病微生物，在南方温暖湿润的气候条件下更是如此。

4.清扫泥地容易产生灰尘，雨季又容易造成地面泥泞；沙地不吸水，夏季热辐射大；草地在一定程度上解决了前述问题，但易受笼舍小气候影响或被动物破坏，在许多动物笼舍种植草坪或其它植物难于成活；而当绿植过于茂盛时，也会阻滞通风透气。

5.为了预防动物疫病，传统的做法是对动物笼舍进行频繁消毒，其作用不仅杀灭了笼舍环境中的有害微生物，同时也杀灭了动物生活环境中的有益微生物，通过间接影响动物体内微生物群落，继而对动物机体免疫功能产生不利影响。而且，消毒作用只限于消毒药物发生药效的时间内，当消毒过程结束后，无法保护笼舍环境不会受到新的污染。

在家畜、家禽养殖业，有部分养殖单位采用了发酵床或垫料。但是，动物园圈养条件下的野生动物饲养管理与畜牧业生产有本质的不同。主要体现在：(1)饲养动物的目的不同《动物园管理规范》(CJJ/T 263-2017)明确要求，动物园是公众直观认识动物、了解动物保护的第一场所，要求动物园传播的相关信息要准确，不应违背自然规律、违反科学伦理；为了让动物在符合生理习性的环境健康生活，展示自然行为，并能使得公众直观了解动物的地理环境，传播保护信息，要求笼舍设计尽量模拟野外原始栖息地生境，且根据动物的特点，提供适宜的辅助设施。强调的是环境的自然生态和有利于展示动物的自然行为。而畜牧业生产的目的是获得肉、蛋、奶等动物产品，注重的是生产效率，强调投入产出比；(2)动物的驯化程度不同野生动物是未驯化的动物，对生活环境中的各种应激原更加敏感；而家畜、家禽是长期驯化的，对人工环境的适应能力很强；(3)单位面积的饲养数量不同野生动物笼舍的单位面积饲养动物数量较少以满足动物自然行为的展示需要，产生的***物数量也相对较少；而现代畜牧业生产多采用集约化方法，主要是基于生产效率提高的需要，产生的动物***物也相对较多。因此，圈养野生动物的饲养和管理方法与畜牧业生产的有着根本的区别。

畜牧业生产单位采用的发酵床或垫料是基于畜牧业生产的需要来设计的，无需考虑模拟动物野外栖息地生境，而对动物***物的分解和发酵的效率要求较高，因为集约化生产会产生大量的动物***物，因此畜牧业生产中的发酵床或垫料的材料基本都含有粉碎的植物(如秸秆或其它植物)成分，辅助人工或机械方法不间断对发酵床进行搅拌，以促进动物***物与发酵材料的充分混合，加速发酵反应过程。此外，畜牧生产的动物饲养周期一般都不长，通常约3-8个月，所使用的发酵床或垫料随动物饲养周期的结束一并清除。

而动物园圈养野生动物饲养中，发酵床或垫料的使用首先要考虑是能够满足向公众传递自然保护信息的需要和满足动物自然行为表达的需要，需要尽量模拟动物栖息地的生境。其次，由于动物园的主要使命是濒危野生动物的物种保护，对饲养对象的健康关怀是全方位的，动物福利被放到重要地位，不止要防止动物感染疫病。研究表明，野生动物的生活环境，包括微生物环境与动物健康的关系非常密切，不仅因为致病微生物危害动物健康，环境微生物丰度还可能通过影响动物肠道菌群而对动物健康产生间接影响。因此，有必要为野生动物营造一种有利于动物健康的微生物环境。此外，由于野生动物的饲养周期很长，动物的驯化程度极低，而自然行为却更加丰富，因此，地面垫料要有利于保护动物足垫和关节，最好能够为其提供尽量舒适的温度和湿度环境，以减少外伤、感染、应激等的发生。

由于饲养目的、饲养密度和动物驯化程度的巨大差异，畜牧业生产与动物园野生动物的管理方法也存在巨大差异。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种新型圈养野生动物管理方法，其简单易于实施，为动物提供了更加自然、舒适的生活环境，有助于动物自然行为的表达，丰富了动物生活环境中的微生物群落，而且无需每天清洗动物笼舍，减少了动物笼舍的消毒频次，简化了日常管理流程，对室内温度、湿度环境具有一定的调节作用，间接影响动物健康水平。

本发明的目的是这样实现的：一种新型圈养野生动物管理方法，其特征在于：(1)铺设发酵床和/或垫料层：在动物笼舍的室内地面铺设混合有益生菌的松树皮为发酵床，在动物笼舍的室外地面或橱窗式展舍铺设混合有益生菌的松树皮为垫料层，或者，将垫料层与拟生态园林造景相结合模拟动物自然栖息环境；(2)日常管理：无需每天清洗笼舍或橱窗式展舍，但需清除动物残留的食物；(3)消毒：无需对动物笼舍或橱窗式展舍进行定期常规消毒。

所述的垫料层或发酵床的更换：当松树皮变至质地变脆、容易粉碎时，或受到严重污染时，或当动物发生疫情或死亡时，需要全部或部分更换。

所述的松树皮为松科松属植物包裹在其干、枝、根次生木质部外侧的全部组织，每块的长径为2厘米到25厘米之间；所述的垫料层厚度为5厘米至30厘米；所述的发酵床的铺垫厚度为30厘米至100厘米；所述松树皮的来源属于非疫区，且远离动物养殖场3千米以上，在使用前采用太阳光曝晒、或紫外线照射、或辐射的物理消毒方法，或用***熏蒸进行处理。

所述的发酵床的铺垫厚度：小型动物为30-40厘米；中小型动物为40-60厘米；大型动物为60-100厘米；所述的垫料层的铺垫厚度：小型动物为5-10厘米；中小型动物为10-15厘米；大型动物为15-30厘米；前述的小型动物为体重小于10千克的哺乳类、两栖爬行类或鸟类动物，中小型动物为体重介于10千克至200千克的哺乳类哺乳类、两栖爬行类或鸟类动物，大型动物为体重大于200千克的哺乳类哺乳类、两栖爬行类动物。

所述的动物笼舍或橱窗式展舍设有排水设施，排水设施的出水口处设有金属隔网；发酵床、垫料层的基底具有坡度，并向排水口倾斜。

所述的益生菌的添加量为200-400克/立方米松树皮；添加频次：铺设发酵床首次添加后至下次对环境进行彻底消毒前无需添加，对环境进行彻底消毒后，重新添加。

所述的益生菌为嗜酸乳杆菌，嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g。

动物***的尿液直接被垫料或发酵床吸收、分解；动物***的粪便的处理，需根据动物种类的不同分别采用翻动发酵床/垫料层将动物粪便埋入发酵床/垫料层内部，或者局部用水将动物粪便冲入发酵床/垫料层内部。

在动物笼舍的工作人员出入口处设置消毒池或消毒垫。

除了受到严重污染或动物发生疫情或死亡的情况以外，灵长类动物、食肉动物、鸟类或两栖爬行动物的笼舍的垫料层或发酵床维持2年以上不必更换，食草动物及除灵长类动物以外的其他杂食动物笼舍的垫料层或发酵床维持1年以上不必更换。

本发明的管理方法，为动物提供了更加自然、舒适的生活环境，有助于动物自然行为的表达，丰富了动物生活环境中的微生物群落，而且无需每天清洗动物笼舍，减少了动物笼舍的消毒频次，简化了日常管理流程，对室内温度、湿度环境具有一定的调节作用，提升了动物福利和健康水平。

附图说明

图1是本发明发酵床或垫料层的剖面图。

图2是本发明实施例1内室发酵床铺设前；图3是实施例1内室发酵床铺设后的效果图；图4是是实施例1室外运动场铺设垫料层的效果图。

图5是本发明实验研究1冬季环境温度与发酵床内部温度，图6是本发明实验研究1夏季环境温度与发酵床内部温度；图7是本发明实验研究1冬季环境湿度与发酵床内部湿度，图8是本发明实验研究1夏季环境湿度与发酵床内部湿度；图9是本发明实验研究1室内铺垫发酵床后空气中氨气浓度监测。

图10是本发明实验研究2中6个松树皮样本的AWCD值随培养时间的变化曲线；图11是本发明实验研究2中4个刨花样本的AWCD值随培养时间的变化曲线；图12是本发明实验研究2中3个苔藓样本的AWCD值随培养时间的变化曲线；图13是本发明实验研究2中不同类型垫料样本的AWCD值随培养时间的变化曲线。

图14是本发明实验研究3中的物种组成分析图，其中A:门水平细菌的相对丰度，B:属水平细菌的相对丰度；图15是本发明实验研究3中的Beta多样性分析，其中A:4组样品在OUT水平的PCA分析(16S)，B:展区4和展区2样品主成分分析比较，C:展区4和展区 1样品主成分分析比较，D:展区4和展区3样品主成分分析比较；图16是本发明实验研究 3中的各组差异基因火山图。

图17是本发明实验研究4中沙氏培养基上37℃培养48h的结果；图18是本发明实验研究4中麦芽汁培养基26℃培养168h的结果；图19是本发明实验研究4中马铃薯葡萄糖培养基26℃培养168h的结果；图20是本发明实验研究4中显微镜下真菌及分生孢子形态48h ×10。

具体实施方式

本发明是一种新型圈养野生动物管理方法，其包括：

(1)在现有动物笼舍、橱窗式展舍基础上进行简单改造，铺设发酵床和/或垫料层：在动物笼舍的室内地面铺设混合有益生菌的松树皮为发酵床，在动物笼舍的室外地面或橱窗式展舍铺设混合有益生菌的松树皮为垫料层，或者，将拟生态的园林造景与垫料层有机结合起来，在绿植不易生长的地面或者在动物经常躺卧、踩踏的地面铺设垫料层。

所述的松树皮，是指松科、松属(Pinus)植物，包裹在其干、枝、根次生木质部外侧的全部组织，又称赤松皮、赤龙鳞、松皮、赤龙皮等，以马尾松、油松、思茅松等种类的老树的下部鳞状树皮为佳，同属的其它松树种的树皮也可使用。据《本草纲目》记载：松树皮味苦、涩，性温，归肺、大肠经，具有收敛、生肌功效，外用治烧烫伤、小儿湿疹等。《全国中草药汇编》记载：松木皮(松树皮)用于祛风除湿，活血止血，敛疮生肌；主治风湿骨痛、跌打损伤、金刃伤、肠风下血、久痢、湿疹、烧烫伤和痈疽久不收口。此外，由于松树皮具有高有机质含量、高空隙率、总截流面广、良好的吸附效果、稳定的pH值、耐腐蚀等特点，在工业上用于生物滤池中的废气过滤、水分截留及承载微生物族群具有良好的效果。本发明采用松树皮作为基础材料用于野生动物笼舍，不仅对动物无害，而且具有许多优点。

松树广泛分布在自然界，将松树皮用于动物笼舍后，使动物笼舍看起来更加自然、野趣和生态，有利于提升景观效果；松树皮与植物的相容性好，不仅可以和乔木、灌木、草本很好的搭配在一起，更可以作为种植植物的基质，所以无论是单纯的垫料层，还是垫料层加园林景观，用于动物笼舍都可以取得很好的效果。

松树皮具有弹性、隔音等特性，将其铺设在硬质地面，可以改善地面质地，对动物的足垫和关节起着保护作用，而且可以降低动物笼舍内的噪音。

松树皮是热的不良导体，即使在寒冷的冬季，垫料和发酵床的表面也不会冰凉，而且发酵床在发酵过程中会产热，发酵床内部温度始终高于环境温度，给动物提供了一个舒适的“温床”，可以起到类似地毯的保温作用；而在气温高时，只要笼舍保持通风透气，发酵床内部产生的热量对环境温度的影响可以忽略。

在南方潮湿天气，笼舍内的湿度会非常高，特别是用水冲洗地面以后，即使用风机吹也很难干燥，而松树皮多孔、吸水、耐腐的特性能始终保持笼舍干燥；当空气湿度很低时，吸附在松树皮内的部分水分可以补充到空气中，使笼舍内保持舒适的湿度。因此，本发明对动物笼舍内的温度、湿度起到一定的调节作用，特别是在温暖湿润的南方气候条件下，解决了动物笼舍长期潮湿的问题，有利于减少动物皮肤病等疾病的发生、提升动物福利水平。

松树皮的自然特性，能起到类似“细菌屋”的作用，有利于微生物的生长，而动物的自然***物则是益生菌生长的天然营养素。研究表明，松树皮作为垫料时，较刨花、苔藓，或沙、土等其它材料所含的环境微生物更加丰富，而动物生活环境的微生物丰度又与动物肠道微生物群落的丰度有关，从而对动物的健康产生有利的影响。

同样，松树皮良好的吸附、吸收性能，以及大量的益生菌对动物的***物具有很好的吸收和分解作用。动物***的尿液很快被松树皮吸收，并作为益生菌的营养被分解，使发酵床和垫料的表面保持干爽；动物***的粪便同样可以被益生菌利用和分解，不但减少了人工清除动物***物的劳动量，而且对室内空气具有一定的净化作用。通过对有发酵床的笼舍内室的有害气体的长期跟踪检测，结果：未检出硫化氢和二氧化硫，冬季在室内保温情况下氨气浓度低于1.0ppm，在开窗通风情况下未检出。

所述松树皮的来源属于非疫区，且远离动物养殖场3千米以上，在使用前采用太阳光曝晒、或紫外线照射、或辐射的物理消毒方法，或用***熏蒸进行处理。优选的，根据饲养动物的种类和习性不同，每块松树皮的长径从3厘米到20厘米之间，对于猿猴类、豹等中小型动物，松树皮的长径以5厘米至10厘米为佳；对于犀牛、大象等大型动物，松树皮的长径则以5厘米至15厘米为佳。

优选的，铺垫的厚度分为两种：一是作为垫料层使用，即在硬质地面或泥地上面直接铺垫，厚度从5厘米至30厘米不等；二是作为发酵床使用，铺垫厚度从30厘米至100厘米不等。更优选的，对猿猴类、豹等中小型动物，发酵床的铺垫厚度为40-60厘米；对于松鼠猴等小型动物，发酵床的铺垫厚度为30-40厘米；对于犀牛、大象等大型动物，发酵床的铺垫厚度为60-100厘米。最优选的，对于猿猴类、豹等中小型动物，作为发酵床使用的松树皮垫层的厚度以50厘米为佳；对于松鼠猴等小型动物，发酵床使用的松树皮垫层的厚度30厘米即可；对于犀牛等大型动物，作为发酵床使用的松树皮垫层的厚度以100厘米为佳。发酵床和垫料层既可以单独使用，也可以结合在一起使用，其区别是发酵床对动物***物的分解效率更高。优选的，在笼舍的内室使用发酵床，在室外运动场或橱窗式展舍使用垫料层。优选的，对于产生***物数量大的草食动物优先使用发酵床。

前述的小型动物为体重小于10千克的哺乳类、两栖爬行类或鸟类等动物，中小型动物为体重介于10千克至200千克的哺乳类、两栖爬行类或鸟类等动物，大型动物为体重大于200 千克的哺乳类、两栖爬行类动物。

优选的，如图1所示，所述的动物笼舍或橱窗式展舍设有排水设施3，排水设施的入水口设有不锈钢金属隔网2(例如采用孔径为1厘米的隔网)，以防止树皮进入排水设施；发酵床1(或垫料层)四周用砖砌成池样，在其中按所需的铺垫厚度放入处理好的松树皮12即可；发酵床1(或垫料层)的基底11具有坡度(在附图所示例子中坡度约为5°)，倾斜向排水设施3有利于排水。

优选的，所述的益生菌的添加量为200-400克/立方米松树皮；添加频次：通常情况下只加一次即可，铺设发酵床首次添加后至下次对环境进行彻底消毒前无需添加，特殊情况下，如对环境进行彻底消毒后，重新添加。益生菌的添加可以是在铺设前先与松树皮12混合均匀，也可以是在铺设过程中进行，即铺一层松树皮、加一层益生菌，并均匀泼洒、搅拌。

优选的，为了促进垫料或/和发酵床内有益微生物的快速建立，或/和抑制有害微生物的生长，在松树皮中添加嗜酸乳杆菌。最优选的，嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g。

(2)日常管理、维护：由于垫料层或/和发酵床对动物***物的滤过作用、吸收作用及益生菌对有机物的分解作用，使动物***物能够得到有效地处理，因此无需每天清洗笼舍或橱窗式展舍，但仍然需要及时对动物残留的食物进行清除，以防动物食入变质食物。动物***物可以充当发酵床的营养原料，无需清走，当残留在发酵床或垫料表面的动物粪便量较大，明显影响到景观时可以局部翻动垫料将动物粪便埋入发酵床/垫料层内部加速其分解，或者局部用水将动物粪便冲入发酵床/垫料层内部加速其分解。优选的对于排粪量较少的灵长类动物、其他杂食动物或食肉动物、两栖爬行动物和鸟类，每周清理一次即可；对于排粪量大的食草动物，可局部用水将动物粪便冲入发酵床/垫料层内部，无需清运。

(3)消毒(disinfection)，是指用物理、化学或生物方法等清除或杀灭动物体表及其环境中的病原体，使其达到无害化的处理过程。消毒的过程不仅杀灭了有害微生物，也同时杀灭了对动物有益的益生菌。安全起见，在铺垫发酵床和垫料层之前，需要对笼舍或橱窗式展舍内环境进行一次彻底消毒，以杀灭笼舍环或橱窗式展舍境中可能存在的致病菌。作为垫料的松树皮在使用前已经作了消毒处理，并混合了大量益生菌，其作用是在环境中人为地快速建立起对动物有利的优势菌群，从而竞争性地抑制其它细菌的生长。此后，松树皮所具有的吸附、多孔等特性，加上源源不断的动物***物为益生菌的生长提供了适宜条件，使垫料层和发酵床内的益生菌始终处于相对丰富的状态，不仅抑制了环境中致病微生物的生长，而且为动物提供了丰富的微生物生态环境。因此，一旦铺垫了垫料层和/或发酵床后，笼舍或橱窗式展舍内无需进行定期常规消毒操作，也不宜进行消毒操作，因此改进了传统的野生动物日常管理流程，使其变得更加简单高效。安全起见，只有当笼舍维修、维护，或发生动物疫病、死亡等事件时，需要对笼舍或橱窗式展舍内的垫料及环境进行彻底消毒，并于消毒操作后及时补充益生菌，以维持环境中益生菌的优势菌地位；如果消毒采用了化学药物，需要等消毒药物的药效消失后再添加益生菌，以免残余的消毒药将添加的益生菌活性降低。

无论是物理的还是化学的消毒方法，只在消毒过程中发挥杀灭微生物作用，消毒过程结束以后对微生物的杀灭作用也随之消失，笼舍或橱窗式展舍环境依然暴露在各种微生物包括致病微生物面前。本发明的垫料和发酵床内部大量益生菌的存在，从铺垫垫料层和发酵床开始，就在笼舍或橱窗式展舍内建立起对致病微生物的抑制机制，动物***物的存在又加强了益生菌的优势菌地位，使致病性微生物难于生长，因而建立起了长期、稳定的抑制致病微生物的环境。不仅如此，研究表明，丰富的微生物环境可以影响动物肠道菌落的丰度，从而对动物的免疫机能、消化机能产生有益的作用。

(4)垫料或发酵床的更换：根据动物种类、数量和笼舍面积、具体环境等实际情况，当松树皮变至质地变脆、容易粉碎时，或受到严重污染或其它特殊情况(例如动物发生疫情或死亡，仅通过消毒无法解决时)，需要及时全部或部分更换。通常情况下(除前述严重污染、动物发生疫情或死亡等特殊情况以外，例如松树皮正常风化或是被动物踩踏破碎)，灵长类动物、食肉动物、鸟类、两栖爬行动物等动物笼舍的垫料或发酵床可以维持两年以上不必更换；食草动物、除灵长类动物以外的其它杂食动物笼舍的垫料或发酵床可以维持一年以上不必更换。

(5)在笼舍的工作人员出入口设置消毒池或消毒垫，目的是减少因工作人员出入笼舍将笼舍外的致病微生物带入笼舍内的可能性。人员出入动物笼舍必须穿着专门的工作服和工作鞋，必须通过消毒垫或消毒池，防止将有害微生物从笼舍外带入笼舍内。

铺设垫料层或发酵床后，不仅使动物生活的环境看起来更加自然、生态，动物还会经常翻动垫料或发酵床上的树皮，行为更加丰富，减少了不利于动物健康的刻板行为的发生，观赏效果更好，动物更具活力。

实施例1(黑叶猴笼舍)

广州动物园黑叶猴笼舍分内室和室外运动场两部分，饲养了1对成年猴及其3只未成年后代。其中内室部分约7平方米，有两道门，分别通向室外运动场和工作人员通道，内室地面为混凝土结构(如图2)，地面有一定坡度，在内室地势较低的一角有下水道(即排水设施)；室外运动场部分约100平方米，也有两道门分别通向内室和工作人员通道，运动场地面有自然坡度，在较低的一端有带栅栏的排水沟(即排水设施)，原地面为泥地、沙地，并种值有少量绿植。

1.1工程施工和消毒

内室：首先在内室的两道门的内侧用砖砌成55厘米高挡墙，要求不妨碍正常开关门操作；在现有下水道的排水口的上面覆盖一块1厘米孔径的不锈钢网。

室外运动场：将现有排水沟上面的栅栏式盖板打开，在盖板下加一层带1厘米孔径的不锈钢网，再重新将栅栏式盖板盖上。

加不锈钢网的目的是防止松树皮堵塞排水设施。

消毒：施工完成后，采用1:2000稀释的广消安(戊二醛癸甲溴铵溶液，广东省前沿动物保健有限公司生产)按常规方法对笼舍内环境进行喷洒消毒，消毒后用清水冲洗掉残余的消毒药。垫料层和发酵床铺设完成后不再进行消毒。

在笼舍工作人员出入口外设置消毒垫，每天用1:2000稀释的广消安喷洒消毒垫，并使之保持湿润，工作人员出入笼舍都必须在消毒垫上面踩踏。

1.2发酵床及垫料层原料的准备

采用马尾松(学名：Pinus massoniana Lamb)主干外周鳞状皮，长径为5厘米至10厘米，直接从产地购入，经太阳曝晒后使用。原料大小比较均一，外观新鲜、干净、干燥、无霉变。经了解，产地周边无动物疫病发生，邻近3千米内无动物养殖场。铺设使用前加入益生菌(嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g)，添加量为400克/立方米松树皮，尽量混合均匀，并立即使用。

1.3发酵床的制作

在前述内室倒入含有益生菌的松树皮原料，铺垫厚度为50厘米(如图3)。在发酵床的中央埋入温度和湿度探头，每天记录发酵床的温度和湿度。采用气体检测仪每天记录室内氨气、二氧化硫、硫化氢、一氧化碳浓度。制作得到的发酵床剖面结构如图1所示。

1.4垫料层的制作

在前述室外运动场泥地、沙地上面铺设含有益生菌的松树皮原料，铺垫厚度约为10厘米，仍然保留部分原生长良好的植被，如图4。垫料层上面保留原有的枯树、栖架、木亭及其它丰容设施，景观更加自然、生态。

1.5日常管理

上岗时，工作人员按传统要求穿着工作服和工作鞋。

工作人员按传统要求每天投喂动物饲料和更换清洁饮水，每天清理动物残余的饲料，防止腐败变质。

由于该笼舍饲养的动物数量只有5只，动物***物数量不多，室外运动场的***物无需清理，室内发酵床表面残留的动物粪便，每周2次用自来水冲洗，使其自然渗入发酵床内部即可。使用本发明前后饲养员岗位工作对比见表1。

表1使用本发明前后饲养员岗位工作对比

实施例2(黑叶猴笼舍)

与实施例1相邻的黑叶猴笼舍，内室面积约7平方米，室外运动场面积约80平方米，饲养亚成体黑叶猴2只。

与实施例1不同之处在于：内室未铺发酵床，在管理上每天按常规对内室进行清洁、冲洗、消毒，其它同实施例1。

实施例3(松鼠猴笼舍)

内室面积约6平方米，室外运动场面积约80平方米，饲养松鼠猴11只(2雄7雌2亚成体)。

与实施例1不同之处在于：内室未铺发酵床，在管理上每天按常规对内室进行清洁、冲洗、消毒，其它同实施例1。

实施例4(蟒蛇笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养蟒蛇2条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经处理过的含益生菌的松树皮，厚度为10厘米。益生菌为嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g，添加量为400克/立方米松树皮。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

实施例5(绿鬣蜥笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养绿鬣蜥20条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经处理过的含益生菌的松树皮，厚度为5厘米。益生菌为嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g，添加量为400克/立方米松树皮。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

实施例6(巨蜥笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养绿鬣蜥3条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经处理过的含益生菌的松树皮，厚度为5厘米。益生菌为嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g，添加量为400克/立方米松树皮。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

对比实验1(黑猩猩笼舍)

猩猩馆共饲养8只黑猩猩，共用4个内室，每间内室面积约30平方米，以丝状刨花为垫料；室外运动场种植有乔木、灌木、草本等各种植被。日常管理为每天打扫笼舍，运动场定期消毒。

对比实验2(蟒蛇笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养蟒蛇2条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经过处理的苔藓，厚度为10厘米。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

对比实验3(绿鬣蜥笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养绿鬣蜥20条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经过处理的苔藓，厚度约为5厘米。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

对比实验4(巨蜥笼舍)

橱窗式展舍，面积约5平方米，饲养绿鬣蜥3条。对展舍进行彻底消毒后，铺垫经过处理的苔藓，厚度约为5厘米。日常管理除及时清除残余食物外，无需其它处理，无需进行常规消毒。

实验研究1有发酵床的内室温、湿度及有害气体监测

1.实验目的

1.1对实施例1发酵床内部温度、湿度变化，及其与环境温度、湿度的关系进行监测；

1.2对应用发酵床后室内空气中与动物***物分解相关的有害气体浓度。

2.仪器和方法

2.1温度、湿度监测采用广州乐享电子有限公司生产的LX8013工业温湿度计，将温度、湿度探头埋入发酵床中央每天读取发酵床内部温度和湿度，同时读取环境温度和湿度；

2.2气体检测分别采用东莞万创电子制品有限公司生产的希玛AR8500氨气气体检测仪和希玛AS8900四合一气体检测仪。

3.结果与讨论

3.1温度刚铺设发酵时，发酵床内部温度与环境温度一致，此后发酵床温度略高于环境温度，并随环境温度波动而波动，但发酵床内部温度波动幅度明显少于环境温度的变化，特别是在夏季环境温度较高时，发酵床内部温度反而比较平稳(图5、图6)。松树皮良好的保温性能使发酵床内部的温度较环境温度更加平稳，有利于益生菌的生长。

3.2湿度无论夏季还是冬季，发酵床内部的湿度几乎恒定在较高的水平(图7、图8)，但发酵床表面始终保持较为干燥的状态，而未加发酵床或垫料的笼舍地面则长期积水。发酵床内部的水分主要来自：广州空气湿度大、动物***物、工作人员冲洗笼舍后残留的水分。发酵床内部较高的湿度环境为益生菌的生长提供了有利条件。

3.3有害气体浓度检测在冬季室内保温情况下，距离内室发酵床中部表面约30厘米处测定的氨气浓度最高为1.0ppm，大部分时间未检出(图9)；一氧化碳、二氧化硫、硫化氢等气体未检出。在铺设有发酵床的动物内室，空气质量远高于《实验动物规范》GB14925-2001 和《工业企业设计卫生标准》TJ36-79等的有关规定，接近人的《室内空气质量标准》GB/T18883-2002(《室内空气质量标准》GB/T18883-2002规定：氨气在室内空气中最高允许浓度为0.2mg/m³(0.2635ppm)；《工业企业设计卫生标准》TJ36-79规定，车间空气中氨的最高容许浓度为30mg/m³(39.53ppm)；《实验动物规范》GB14925-2001规定，实验动物饲养环境的氨气浓度应少于或等于14mg/m³(18.452ppm)。

实验研究2(动物笼舍垫料中微生物活性的研究)

为了比较动物笼舍内不同垫料中微生物的活性，采集了来自3种灵长动物、3种爬行动物笼舍的3种不同类型的垫料样本共13个，采用Biolog-ECO方法进行了分析，结果显示：笼舍内的垫料类型相比动物种类而言，对环境微生物的影响更大，本研究中微生物活性自高到低的垫料类型依次为松树皮>刨花>苔藓。

1材料和方法

1.1样品及处理

样本采集和处理：在对应实施例的动物笼舍的四周及中央部位无菌采集5处的垫料样本共约10g，按1g样本加9ml的比例在样本中加入灭菌蒸馏水，置4℃恒温振荡箱中振荡1h，取上清液用灭菌蒸馏水稀释10倍后接种ECO板，150μl/孔，37℃培养，每24h分别读取OD590 和OD750值。样本来源详见表2。

表2样本来源

*松树皮中添加了益生菌(嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g)，添加量为400克/立方米松树皮

1.2数据处理

微生物代谢活性用平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)表示，其计算方法为：AWCD＝Σ(C-R)/n。公式中，C为每个碳源孔在590nm下的吸光度值减去750nm 下的吸光度值；R为对照孔的吸光度值；n为培养基碳源种类数。当C-R的数值小于0.06时矫正为0处理。

对得到的AWCD数据分别采用SPSS17.0、vegan v2.5-6和flashClust v1.01-2进行处理。

2结果与分析 各样本对ECO板碳源的利用情况

AWCD值反映了样本中微生物的代谢活性，即对碳源的利用能力。13个样本的AWCD曲线依垫料的种类不同呈现出了各自的规律性，而与动物的种类没有明确的相关性，如松树皮样本虽然来自5种不同的动物，但其AWCD曲线的变化规律却相似(图10、图11、图12)。从3种垫料样本的AWCD均值曲线可以清楚地看出：来自苔藓样本的AWCD曲线斜率在24h 内最大，随后变得平缓，并于96h达到峰值；刨花样本的AWCD曲线斜率最大值出现在前 48h，其后变得平缓；松树皮样本的AWCD曲线斜率最大值出现在24h至48h之间，此前、后的曲线斜率均较低。从AWCD曲线的变化趋势分析，苔藓样本的微生物群落利用ECO板全部31种碳源的活性在24h内最高，但其后则落后于其它垫料样本；刨花样本中微生物利用 ECO板全部31种碳源的活性在48h内均较高，并在此后低于松树皮样本；松树皮样本中微生物活性在前24h内虽然较低，但此后迅速升高，并于48h追上刨花样本后，持续高于其它两种垫料样本(图13)。由此可见，垫料种类与AWCD曲线变化存在一定的关系，也就是说动物笼舍环境中的微生物活性主要与垫料的种类有关，而与动物的种类关系不太。

选择培养96h的各样本的AWCD值进行方差分析，结果各样品对碳源的利用存在极显著的差异(P<0.01)。为了进一步分析各样本微生物对ECO板中不同类型碳源的利用情况，将 ECO板的31种碳源分为6大类(参见Biolog生态板的应用原理及碳源构成[J].孔滨,杨秀娟. 绿色科技,2011,7:231-234)，分别计算各样本利用每类碳源的AWCD值，并进行方差分析。结果，各样本对碳水化合物、氨基酸、胺类等三类碳源的利用存在极显著差异(P<0.01)，而对羧酸、多聚物、酚酸类等碳源的利用差异不显著(P>0.05)。

将各样本按垫料种类的不同分为3个组：松树皮组、刨花组、苔藓组，分别对培养不同时间的AWCD值进行方差分析，结果3个样本组的AWCD值除48h为差异显著(P<0.05) 外，在24h、72h、96h、120h等4个时间的组间差异均达到极显著水平(P<0.01)。其中，在24h苔藓组极显著高于松树皮组(P<0.01)，刨花组显著高于松树皮组(P<0.05)，但刨花组与苔藓组差异不显著(P>0.05)；在48h松树皮组和刨花组均显著高于苔藓组(P<0.05)，而松树皮组和刨花组则差异不显著(P>0.05)。在72h、96h、120h等3个时间段，刨花组均显著高于苔藓组(P<0.05)，而松树皮组极显著高于苔藓组(P<0.01)；虽然在统计上，松树皮组和刨花组无显著差异(P>0.05)，但自72h后，松树皮组始终高于刨花组。

3.讨论

Biolog方法通过微生物对多种碳底物的不同利用类型来反映微生物群落的功能多样性，可以直接反映微生物群落的总体活性，在表征细菌群落动态变化的时空尺度上有显著的优势，且具有数据量大、方便、快捷等优点，近年来被广泛应用于土壤、水体和环境等领域。其中，生态板(Ecology plate，ECO板)在土壤微生物群落功能多样性研究中应用更为广泛，也用于动物的肠道微生物研究。

本研究收集的样本分别来自3种灵长动物和3种爬行动物笼舍的3种不同类型的垫料，采用Biolog-ECO板对样本的微生物活性进行了分析。结果，各样本间的微生物活性存在极显著差异(P<0.01)，且差异主要表现为对碳水化合物、氨基酸、胺类等三类碳源的利用上(P<0.01)，对羧酸、多聚物、酚酸类的利用差异不显著(P>0.05)，提示这些动物笼舍的环境微生物群落存在某种相似性。

将样本来源按垫料种类的不同进行分组，发现松树皮、刨花、苔藓等3种来源的样本，其AWCD曲线呈现了相似的规律性，即，各垫料组均有各自的规律。因此，动物笼舍内垫料的种类相比动物种类而言，对环境微生物活性的影响更大。其中苔藓组样本的微生物活性在培养早期较高，而松树皮样本的微生物活性在培养早期虽然较低，但随后迅速上升，并超越其它两组，当AWCD值达到基本稳定后，3种不同种类的垫料样本微生物活性自高到低依次为松树皮>刨花>苔藓。

实验研究3(黑叶猴肠道微生物与环境的关系研究)

哺乳动物的消化***中含有一个复杂的微生物群落，它们是宿主消化***不可或缺的一部分。近年来，高通量测序技术的应用和发展，进一步揭示了肠道微生物群在动物健康和代谢中发挥着重要的作用。实验研究2的结果显示，笼舍内垫料种类与其中所含的微生物活性有关，微生物活性自高到低的垫料依次为松树皮>刨花>苔藓。为了进一步研究动物的生活环境对动物肠道微生物丰度的影响，收集了来自不同生活环境的黑叶猴新鲜粪便，采用宏基因组和16S测序方法进行了分析。

宏基因组学作为新兴的分子生物学技术被广泛用于开展微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性以及其相互关系等相关研究，可以更准确地反映出微生物生存的真实状态。

1试验材料与方法

1.1样品采集

黑叶猴的新鲜粪样，分别采自4个管理方式和环境均有差异的动物笼舍，于-80℃保存后干冰运输，由华大基因进行宏基因组和16S测序分析。样品来源情况详见表3：

表3采样和分组情况

*注：展区2为实施例1

1.2试验方法

1.2.1总DNA提取利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组黑叶猴粪便样品中微生物基因组DNA。完成基因组DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。最终上机测序及部分数据分析由深圳华大基因股份有限公司完成。

1.2.2 16S rRNA的扩增、测序与分析取质量合格的基因组DNA样品30ng进行PCR扩增 (16S rRNA的V3-V4区)并进行纯化。检测合格后利用HiSeq平台进行测序，测序结果与16S 细菌和古菌核糖体数据库(silva119)比对进行注释，继而进行黑叶猴肠道微生物多样性分析，并对4组黑叶猴的菌群变化进行差异分析。

1.2.3宏基因组的扩增、测序与分析取质量合格的基因组DNA样品，使用Covaris超声仪将DNA片段化后获得符合长度要求的短DNA片段。构建文库并通过联合探针锚定聚合技术 (cPAS)进行测序。从下机原始序列开始对原始序列进行拆分、质量剪切以及去除污染等优化处理并使用优化序列进行拼接组装和基因预测，对得到的基因进行物种和功能上的注释以及分类。

2结果

2.1黑叶猴肠道菌群物种与功能组成分析有研究表明拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门 (Firmicutes)在所有非人灵长类肠道菌群中所占比例较高。本研究中16SrRNA和宏基因组结果均显示：门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门在肠道微生物的组成中属于优势群体，表明黑叶猴肠道菌群组成以及各菌门间的趋势与多数哺乳动物相似。本研究中笼舍的环境丰度自高到低依次为展区2、展区1、展区3和展区4，厚壁门在各展区中的丰度依次升高，而拟杆菌门在各展区中的丰度则依次下降。此外，在展区1和展区2这两组中Spirochaetes(螺旋体门) 的占比也(类似16S结果)略高于另外2组；Proteobacteria(变形菌门)在展区3的相对丰度高于展区4、展区1和展区2(见图14A)。

为进一步探究不同饲养环境下黑叶猴肠道微生物多样性，利用群落柱形图分析不同样本基于属水平的优势物种及相对丰度。从分析结果来看，在4个组中除去未被注释到的微生物 (Unclassfied)，其中梭菌属(Clostridium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、另枝菌属(Alistipes)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、密螺旋体属(Treponema)、颤杆菌属(Oscillibacter)属于4个组中的优势菌群(见图14B)。而丰度略有不同的菌群如梭菌属 (Clostridium)在展区4的相对丰度要高于其他3组；普雷沃氏菌属(Prevotella)和拟杆菌属(Bacteroides)在展区4的相对丰度要低于其他3组；瘤胃球菌属(Ruminococcus)在展区 3的相对丰度要高于其他3组。

此外，根据微生物种水平群落组成分析发现，在4个组中除去未被注释到的微生物(Unclassfied)，其中Treponema_succinifaciens在展区2中的相对丰度高于其他3组，这可能与展区2(本实施例1)未进行消毒，环境微生物较为丰富有关。

2.2Beta多样性分析采用Beta多样性具体评估微生物群落间的差异。通过PCA分析发现，在OTU水平，除展区1和展区2有一些重叠，其他各组间菌群组成离散情况较明显，存在较大差异(见图15A)。而利用宏基因组测序进行PCA分析发现，在物种水平展区4和展区3 群落构成重叠较多，差异较小(见图15D)；而展区4和展区2的群落构成相比其离散程度大于展区4与展区1的群落构成(见图15B、C)。

2.3黑叶猴肠道菌群物种与功能差异比较分析根据16S rRNA测序结果分析,在属水平中进行组间差异显著性检验发现丰度在Top 15的群落中，有7个存在显著性差异，分别是： Prevotella_9,Treponema_2,unclassified_f_Lachnospiraceae,[Eubacterium]_coprostanoligenes_gr oup,Christensenellaceae_R-7_group,Ruminococcaceae_NK4A214_group。利用宏基因组测序对黑叶猴肠道菌群差异性进行分析。其中环境丰度最低的展区4和展区3两组样本中丰度存在显著性差异的属主要为：Thermosinus、Thermophagus等。展区4和展区1这2组样本存在显著性差异的属主要为：Unclassfied、Tyzzerella、Tannerella等。而展区4和展区2两组样本存在显著性差异的属主要为：Tyzzerella、Tannerella、Ruminococcus等，这与展区4和展区1 的比较结果较为相似，也间接说明展区1与展区2环境丰度较为相似。

2.5黑叶猴肠道菌群功能基因分析

2.5.1差异基因分析结果基于宏基因组测序结果，对各组差异基因进行比对分析，并以火山图表现(见图16)。展区4和另外3个组比较，其差异基因均比较多，在4000个以上，并且差异基因中的大部分基因丰度低于其他组，这可能与其环境丰度较低有关。本研究中环境丰度从高到低依次为：展区2、展区1、展区3、展区4，而结果显示某些差异基因的丰度也呈现类似的规律性。

2.5.2黑叶猴肠道菌群差异基因KEGG功能分析基于16S rRNA测序结果，分别进行COG 和KEGG功能注释，获得OTU在COG、KEGG各功能水平的注释信息及各功能在不同样本中的丰度信息。结果显示所有样本的COG功能组成较为相似，在不同饲养区域均未发现较大变化。对KEGG代谢通路level 1水平丰度统计分析发现Environmental InformationProcessing， Genetic Information Processing和Metabolism这3个通路的基因丰度最高。因此结合宏基因组测序结果对KEGG注释结果进行分析。宏基因组结果表明4组在Level1分类中，Metabolism 所含的基因数目最多，其中含基因数目较多的level 2分类有Globaland overview maps， Carbohydrate metabolism和Amino acid metabolism。而Environmental Information Processing中仅有3个level 2分类水平，其中Membranetransport和Signal transduction的数量最多。

结合宏基因组数据将环境丰度相对较低的展区4与其他3组差异基因利用KEGG数据库比对而得的功能注释进行分析(数据库内无功能注释的不含在内)。展区4与其他3组比较，在Level 1分类中，Metabolism所含的基因数目均显示最多，其次是Geneticinformation processing；含基因数目较多的level 2分类均含有Global and overviewmaps、Replication and repair和Membrane transport。此外，展区4和展区1的差异基因整体较多；但Level 1分类水平最少的是Organismal system，而在其他两组比较中最少的是human diseasess。

3讨论

肠道微生物与宿主的健康密切相关，而作为和人类亲缘关系最近的灵长类动物，其肠道微生物研究具有重要意义。近年来，随着16S rRNA和宏基因组测序技术的广泛应用，肠道微生物群研究目前已成为现代生物学领域热点。本研究综合16S rRNA及宏基因组测序分析了不同饲养环境下黑叶猴肠道微生物群落组成及丰度变化，并对其差异基因功能进行了预测。

本研究中黑叶猴肠道菌群中的优势菌群是在纤维物质消化中起主要作用的厚壁菌门 (Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，这与黑叶猴采食树叶等食性相关，且与文献报道一致。而基于属水平所鉴定出的优势菌群梭菌属(Clostridium)、普雷沃氏菌属(Prevotella) 等可帮助黑叶猴分解树叶中的纤维素及降解树叶中的结构性碳水化合物，表明肠道菌群在黑叶猴的营养消化吸收方面起到重要作用。

本研究综合差异基因比较结果发现展区4与另外3组比较，其差异基因均较多且差异基因中的大部分基因丰度均低于其他组。推测与本研究中环境丰度从高到低依次为：展区2、展区1、展区3、展区4有关。综合环境丰度与PCA比较分析发现展区4和另外3组肠道菌群相比的离散程度随环境丰度的增加而增加，提示微生物群落构成与饲养环境有关(混凝土地面加上消毒杀灭环境微生物)。

瘤胃球菌属(Ruminococcus)等菌群与动物的食性和代谢存在一定的关系。本研究中瘤胃球菌属(Ruminococcus)在4组黑叶猴肠道中属于优势菌群中的一种，而且在4组中存在一定差异。肠道菌群差异基因功能分析结果显示4个组中与代谢相关的基因数目最多，这与灵长类动物适应环境温度、食物种类及其摄取营养有关。也因此说明了动物进化过程中，肠道微生物组成结构与动物食性和生活环境密切相关。

本研究通过16S rRNA和宏基因组测序对不同环境下黑叶猴肠道微生物进行了比较分析，发现其肠道菌群与环境丰度存在密切联系。

据报道，阳虚体质的人肠道拟杆菌门/厚壁菌门的比值要低于平和体质的人，且阳虚体质人的肠道拟杆菌丰度显著低于平和体质的人(P<0.05)，拟杆菌属相对丰度的显著下降是阳虚体质肠道菌群的特征。本研究中，拟杆菌门/厚壁菌门的比值从高到低依次为：展区2>展区1> 展区3>展区4，与4个展区的环境丰度从高到低相一致，其中展区2为本发明实施例1的笼舍环境。中医认为，阳虚体质是指机体脏腑功能失调，容易出现体内阳气不足、阳虚生里寒的表现。由此得出结论，环境丰度影响动物肠道微生物群落，并影响机体健康。

实验研究4(动物笼舍垫料致病微生物检测)

动物生活环境中如果存在致病性微生物，将严重威胁动物的健康和生命。动物园传统的野生动物饲养方法中，必须对动物笼舍及其周边环境进行定期消毒，其缺点是在杀灭有害微生物的同时，也杀灭了环境中的益生菌，对动物肠道微生物丰度产生影响，并影响动物健康 (见实验研究3)。为了解本发明中不进行定期消毒的情况下动物生活环境可能存在的致病微生物，对来自18个动物笼舍的垫料样本进行了检测，结果均未检测到致病性微生物的存在。

1.材料和方法

1.1样品及处理

在动物笼舍的四周及中央部位无菌采集5处的垫料样本共约10g，按1g样本加9ml的比例在样本中加入灭菌蒸馏水，经充分振荡后，粘取液体接种培养基。样本来源详见表4。

表4样本来源

*松树皮中添加了益生菌(嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g)，添加量为400克/立方米松树皮

1.2大肠杆菌O157培养

将前述1.1制备的样品接种于大肠杆菌O157显色培养基(广东环凯微生物科技有限公司， J2294Y)，37℃培养24h。

1.3血琼脂平板培养

将前述1.1制备的样品接种于血琼脂平板培养基(广东环凯微生物科技有限公司，K1869Y)，37℃培养24h。

1.4真菌培养

将前述1.1制备的样品，分别接种以下培养基进行培养：(1)沙氏培养基(广东环凯微生物科技有限公司，J2136Y)，37℃培养48h；(2)麦芽汁培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，20180105)，26℃培养168h；(3)马铃薯葡萄糖培养基(广东环凯微生物科技有限公司，1070091)，26℃培养168h。

1.5PCR鉴定

从前述1.3培养基上挑选生长良好的菌落，采用《翟俊琼.副流感病毒5型的全基因序列分析及对小鼠的致病性研究[D].广州：华南农业大学,2017》的方法提取总DNA，采用ITS 全序列通用引物进行PCR扩增。仪器：美国Bio-Rad伯乐热循环PCR仪T100。

2结果与分析

3.结果与分析

2.1大肠杆菌O157培养

所有18个样品接种大肠杆菌O157显色培养基，37℃培养24h，均未见品红色或***菌落生长。

2.2血琼脂平板培养

所有18个样本接种血琼脂平板培养基后，经37℃培养24h，均未见有α溶血或β溶血的菌落生长。

2.3真菌培养

在11个松树皮样本和4个刨花样本中，均能形成以下菌落：沙氏培养基上37℃培养48h，形成中央为黄白色、致密、平坦的菌落，边缘呈浅绿毛绒状，反面无色，例如样本S1的结果见图17；在麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基上生长缓慢，经26℃培养168h后，在麦芽汁培养基上形成棕绿色厚绒状菌落，例如样本S1的结果见图18；在马铃薯葡萄糖培养基上形成烟绿色厚绒状菌落，例如样本S1的结果见图19。

显微镜下，分生孢子梗菌丝透明，多分枝。分生孢子呈椭圆形或长形，单细胞，透明，无色，壁光滑，直径为3～5μm(见图20)。

2.3PCR鉴定

取培养基上的菌落，提取总DNA，经PCR扩增、测序、比对，结果与该菌株基因序列相似度最高(99.18％)的是里氏木霉(Trichoderma reesei)。

4.讨论

本研究收集的样本分别来自5种灵长动物和4种爬行动物笼舍的3种不同类型的垫料，均未检出大肠杆菌O157，也未发现有α溶血或β溶血的菌落生长。

来自11个松树皮和4个刨花的样本均在3种常用的真菌培养基上有真菌生长，根据培养特性、形态结构、PCR鉴定，确定为里氏木霉(Trichoderma reesei)，是一种能够产生分解纤维素的酶的真菌，未见其对人或动物有致病性的报道。

综合实验室培养和鉴定结果，结合动物健康状况，可以认为本研究所采集的样本中未发现常见的致病性微生物。

Claims (8)

1.一种圈养野生动物管理方法，其特征在于：(1)铺设发酵床、垫料层：在动物笼舍的室内地面铺设混合有益生菌的松树皮为发酵床，在动物笼舍的室外地面或橱窗式展舍铺设混合有益生菌的松树皮为垫料层，或者，将垫料层与拟生态园林造景相结合模拟动物自然栖息环境；所述的益生菌为嗜酸乳杆菌；所述的发酵床的铺垫厚度：小型动物为30-40厘米；中小型动物为40-60厘米；大型动物为60-100厘米；所述的垫料层的铺垫厚度：小型动物为5-10厘米；中小型动物为10-15厘米；大型动物为15-30厘米；前述的小型动物为体重小于10千克的哺乳类、两栖爬行类或鸟类动物，中小型动物为体重介于10千克至200千克的哺乳类、两栖爬行类或鸟类动物，大型动物为体重大于200千克的哺乳类、两栖爬行类动物；(2)日常管理：无需每天清洗笼舍或橱窗式展舍，但需清除动物残留的食物；(3)消毒：无需对动物笼舍或橱窗式展舍进行定期常规消毒；(4)除了受到严重污染或动物发生疫情或死亡的情况以外，灵长类动物、食肉动物、鸟类或两栖爬行动物的笼舍的垫料层或发酵床维持2年以上不必更换，食草动物及除灵长类动物以外的其他杂食动物笼舍的垫料层或发酵床维持1年以上不必更换。

2.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：所述的垫料层或发酵床的更换：当松树皮变至质地变脆、容易粉碎时，或受到严重污染时，或当动物发生疫情或死亡时，需要全部或部分更换。

3.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：所述的松树皮为松科松属植物包裹在其干、枝、根次生木质部外侧的全部组织，每块的长径为2厘米到25厘米之间；所述松树皮的来源属于非疫区，且远离动物养殖场3千米以上，在使用前采用太阳光曝晒、或紫外线照射、或辐射方法，或用***熏蒸进行处理。

4.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：所述的动物笼舍或橱窗式展舍设有排水设施，排水设施的出水口处设有金属隔网；发酵床、垫料层的基底具有坡度，并向排水口倾斜。

5.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：所述的益生菌的添加量为200-400克/立方米松树皮；添加频次：铺设发酵床首次添加后至下次对环境进行彻底消毒前无需添加，对环境进行彻底消毒后，重新添加。

6.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌活菌数≥1×10⁸cfu/g。

7.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：动物***的尿液直接被垫料或发酵床吸收、分解；动物***的粪便的处理，根据动物种类的不同分别采用翻动发酵床/垫料层将动物粪便埋入发酵床/垫料层内部，或者局部用水将动物粪便冲入发酵床/垫料层内部。

8.根据权利要求1所述的圈养野生动物管理方法，其特征在于：在动物笼舍的工作人员出入口处设置消毒池或消毒垫。

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