CN112322589A - 一种提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科双链rna真菌病毒 - Google Patents

一种提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科双链rna真菌病毒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:3或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列；以及所述产黄青霉科双链RNA真菌病毒用于提高球孢白僵菌的菌丝生长速度的用途。本发明还提供了含有所述产黄青霉科双链RNA真菌病毒的球孢白僵菌菌株。

Description

一种提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科双链RNA真 菌病毒
技术领域
本发明涉及一种能够提高球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌丝生长速度的新型产黄青霉科双链RNA真菌病毒，含有所述病毒的球孢白僵菌菌株及其应用。
背景技术
球孢白僵菌寄主范围广，是防治作物害虫的生物防治剂。球孢白僵菌广泛应用于作物病虫害的生物防治，其主要依靠分生孢子实现其内生性及直接作用于靶标有害生物。研究表明，球孢白僵菌毒力与菌丝生长速度呈正相关，而菌丝生长速度与细胞形成过程呈正相关，并且与菌株代谢途径，如脂质代谢、转运和分解代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢密切相关。
研究表明，来源于世界各地近五分之一以上的球孢白僵菌分离物含有双链RNA病毒。主要包括Totiviridae，Partitiviridae，Polymycoviridae三个科，以及未分类的含有最小基因组的Narnaviridae。目前，已经报道的球孢白僵菌中双链RNA病毒少量属于Totiviridae，部分属于含有2-4条双链RNA的Partitiviridae，而Polymycoviridae由4条以上双链RNA构成。到目前为止，在球孢白僵菌双链RNA病毒分类中还未发现产黄青霉科(Chrysoviridae)的双链RNA病毒。
在双链RNA病毒对寄主球孢白僵菌的影响研究方面，有研究表明，含有Polymycoviridae病毒科病毒的球孢白僵菌菌株菌落生长速度及生物量低于不含病毒的菌株；在内生病毒对球孢白僵菌杀虫活性研究方面，有报道Partitiviridae病毒降低球孢白僵菌杀虫活性，而含有Polymycoviridae病毒科病毒提高了球孢白僵菌菌株对大蜡螟毒力。对产黄青霉科(Chrysoviridae)的双链RNA病毒对球孢白僵菌菌丝生长速度的影响还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与球孢白僵菌对害虫毒力和菌落生长速度呈正相关，与球孢白僵菌产孢量呈负相关，以及与球孢白僵菌孢子萌发率无相关性的真菌内生双链RNA病毒，以期用于球孢白僵菌防治害虫过程中提高毒力的目的。
在一个方面，本发明提供了一种能够提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科(Chrysoviridae)的双链RNA病毒。
所述病毒内生于分离自吉林省梨树县玉米田间亚洲玉米螟幼虫僵虫的球孢白僵菌菌株BbOFZK152中。该菌株在2020年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCC 19371。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及保藏号为CGMCC 19371的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)所携带的产黄青霉科双链RNA真菌病毒。
在一个实施方案中，本发明提供了一种产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其包含SEQID NO:1或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:3或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其由SEQ IDNO:1或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:3或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种使用产黄青霉科双链RNA真菌病毒而提高球孢白僵菌的菌丝生长速度的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种防治植物害虫的方法，包括使所述产黄青霉科双链RNA真菌病毒感染球孢白僵菌的步骤。
本申请发明人意想不到地发现，通过将上述病毒转移到球孢白僵菌中，成功创制了高毒力新菌株，从而提高球孢白僵菌对害虫毒力，降低生产和防治成本。
在另一个方面，本发明提供了一种球孢白僵菌菌株，其含有所述产黄青霉科双链RNA真菌病毒。
在一个实施方案中，所述菌株的保藏号为CGMCC 19371。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本申请说明书为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
附图说明
图1为dsRNA提取结果的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为dsRNA1比对结果示意图。
图3为dsRNA2比对结果示意图。
图4为dsRNA3比对结果示意图。
图5为dsRNA4比对结果示意图。
图6显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌生长速度的关系。
图7显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌产孢量的关系。
图8显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌萌发率的关系。
图9显示了菌株对峙培养后15d，菌丝生长重合。
图10为筛选所得菌株dsRNA提取验证电泳图，其中M为DNA marker，泳道1-5为BbOFZK152，泳道6-10为受体菌株BbOFDH1-5。
图11为筛选后菌株PCR检测电泳图，其中M为DNA marker，泳道1-5为BbOFZK152，泳道6-10为受体菌株BbOFDH1-5。
图12显示了球孢白僵菌病毒对寄主菌丝生长速率的影响。
具体实施方式
实施例1球孢白僵菌双链RNA基因的分离及鉴定
1.1球孢白僵菌菌株双链RNA的分离
取约0.5g菌丝，液氮下研磨成粉末，转移至2ml离心管中。依次加入2xSTE缓冲液(释放，保存核酸)800μl，苯酚-氯仿异戊醇(25：24：1)400μl，10％SDS 183μl，室温下震荡10min，离心10min(4℃，12000r)。取上清液800μl至新2mlEP管中，加入0.05g纤维素粉和152μl无水乙醇(定容约为15％—16％)，17％乙醇STE溶液补满，冰浴10min，离心3-5min(4℃。12000r)。弃上清液，加入1ml17％乙醇1xSTE清洗缓冲液，混匀震荡，离心1min(4℃，12000r)。反复清洗3-4次。弃上清液，用200μl移液枪尽可能吸干残液，加入640μl1xSTE，混匀震荡5min，静置，离心3min(4℃。12000r)。取600μl至1.5mlEP管中(灭菌或DEPC处理)，加入0.1倍体积的3M NaAC和等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀(30min以上)，离心30min(4℃，12000r)。弃上清液，用1ml预冷的75％乙醇洗涤，沉淀，离心2min(4℃，12000r)。用200μl移液枪吸出洗液，37℃下干燥1min(30s分段干燥，防止干燥过度)。加入45μlDEPC水，-20℃保存。
1.2病毒基因组扩增
病毒ds RNA基因组序列全长克隆策略：主要进行随机引物克隆、特异性引物中间缺口克隆和末端序列克隆来获得病毒ds RNA全长基因组序列。
病毒基因组反转录过程：
以纯化的dsRNA为模板，以随机引物RACE3RT为反转录引物，加入：
Figure BDA0002793950290000051
混匀后，PCR仪中95-98℃反应10-15min，迅速于冰上冷却5min，完成后，向反应液中依次加入反转录试剂：
Figure BDA0002793950290000052
混匀后于PCR中进行反应。反应条件为：25℃反应5min，42℃温育1h，85℃加热5min，4℃保存，终止反应程序。
病毒dsRNA中RNA降解及cDNA的复性：
反转录后的反应液25ul，加入1MNaOH溶液2.5ul总量27.5ul，置于65℃的水浴锅或PCR仪中反应1h，反应结束后，室温中冷却，依次加入1M Tris-HCl溶液2.5ul，混匀，再加入2.5ul的1M HCl溶液，充分混匀后，置于65℃的水浴锅中复性1-16h。
对反转录合成的cDNA产物进行未知片段的PCR扩增：
Figure BDA0002793950290000061
反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，56℃退火20s，72℃延伸1min，循环36次，72℃延伸5min，4℃保存。
PCR程序完成后，将PCR产物上样于浓度为1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，获得弥散性条带，切下500bp以上的弥散条带进行纯化回收，最后溶于25-30ul的ddH2O中。
回收产物的T-A克隆、转化、菌落PCR、送测：
将纯化回收片段与PMD18-T载体连接并转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，37℃恒温培养12h后，挑选单菌落，进行阳性克隆的鉴定，过程如下：①挑取单个菌落到10ul灭菌水的PCR管中反复吹吸混匀；②取5.5ul菌液加入300ul的LB+Amp+液体培养基，37℃进行菌体培养；③4.5ul菌液用于菌落PCR，反应体系及反应条件如下：
Figure BDA0002793950290000062
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火20s，72℃延伸1min，循环36次，72℃延伸5min，4℃保存。
④1％琼脂糖凝胶电泳后，挑选阳性克隆送至生工生物(上海)股份有限公司进行测序。
病毒基因组序列的拼接：通过随机引物克隆获得的核酸序列经测序后，通过NCBI数据库中的BLAST在线程序进行搜索比对，根据反馈出来的最终结果确定提取的ds RNA可能的来源，并将克隆后获得的序列用DNASTAR软件进行拼接，可将大小不一的核酸序列片段组装成contig，获的未知序列的大小。设计病毒特异性引物和随机引物对获得的全长基因组序列进行再次验证确定核酸序列的正确性。
1.3.病毒基因组序列比对鉴定
使用DNAMAN软件中“Sequence和“Protein”功能区和NCBI在线程序ORF-Finder来预测病毒dsRNA基因组可能编码的开放阅读框及其大小。
使用NCBI在线程序CDD-search分析新病毒dsRNA基因组可能编码的氨基酸序列及其编码的保守结构域。
1.4.结果
dsRNA提取结果的电泳图参见图1。经过上述测序后，发现该病毒的全长基因组序列由以下四个部分组成：dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。以下更详细描述这些序列。
dsRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。dsRNA1比对结果示意图参见图2。
Blast同源性比对说明与已知真菌病毒核酸序列同源性最高为70.71％，通过对ORF以及保守域分析，结果显示该病毒dsRNA1编码其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase,RdRp)。因此该病毒为一真菌双链RNA病毒新种，命名为Beauveriabassiana chrysovirus 1(BbCV1)。
dsRNA2：其序列如SEQ ID NO:2所示。dsRNA2比对结果示意图参见图3。
Blast同源性比对说明与已知真菌病毒核酸序列同源性最高为66.77％，与已知病毒外壳蛋白氨基酸序列同源性最高为64.54％。
dsRNA3：其序列如SEQ ID NO:3所示。dsRNA3比对结果示意图参见图4。
Blast同源性比对说明与已知真菌病毒核酸序列同源性最高为68.83％，与已知病毒氨基酸序列同源性最高为56.36％。
dsRNA4：其序列如SEQ ID NO:4所示。dsRNA4比对结果示意图参见图5。
Blast同源性比对说明与已知真菌病毒核酸序列同源性最高为67.88％，与已知病毒外壳蛋白氨基酸序列同源性最高为63.79％。
根据dsRNA1比对结果显示，并对应电泳图结果，自上而下该病毒第一条dsRNA链编码其RdRp基因。第二条dsRNA链编码其外壳蛋白。第三和第四链即dsRNA3和dsRNA4的编码蛋白未知。根据其RdRp基因比对结果可知，该病毒为产黄青霉科Beauveria bassianachrysovirus 1m(BbCV1)。
实施例2双链RNA病毒对继代培养过程中寄主生物学活性影响测定
2.1球孢白僵菌菌株继代培养
将形态学及分子生物学鉴定的球孢白僵菌菌种BbOFZK152接种于PDA培养基上，置于温度为26℃的恒温培养箱培养10d，产分生孢子后，将分生孢子刮下，放入内含20mL无菌0.1％(v/v)Tween-80水溶液的离心管中，涡旋振荡2min，用血球计数板计数，并配制成1×107个孢子/mL的孢子悬浮液，取100微升均匀涂布与PDA培养基上，置于温度为26℃的恒温培养箱培养14d进行继代培养，连续培养5代。分别取第1,3和5代培养物进行生物学特性及病毒含量的荧光定量PCR测定。
2.2产孢量测定
将不同世代球孢白僵菌培养物的分生孢子用无菌0.1％(v/v)Tween-80水溶液配制成1×107个孢子/mL的孢子悬浮液，取1mL均匀涂布于PDA培养基，置于温度为26℃的恒温培养箱培养14d。用直径3.5mm的打孔器在平板中央到边缘1/2处打下菌落，放入内含20mL无菌0.1％(v/v)Tween-80水溶液的离心管中，涡旋振荡2min，用血球计数板测定并计算产孢量。每板随机选取3块菌落，每个球孢白僵菌分离物设3个平板作为重复。
2.3萌发率测定
待继代培养的球孢白僵菌培养物长出孢子后，用接种环挑取适量的孢子，接种到SDY液体培养基中，200r/min，26℃，震荡培养24h，然后镜检，分别观察不同视野下孢子萌发情况，计算萌发率。每个球孢白僵菌分离物做3个重复。
2.4菌落生长速度测定
每一代球孢白僵菌继代培养的培养物随机挑取3个球孢白僵菌分离物的单孢，接种到PDA培养基中。每天观察一次，用游标卡尺测量菌落直径，共观测10d.。菌落生长速度(cm/d)＝菌落直径/10。
2.5球孢白僵菌病毒含量的荧光定量PCR测定
分别收集0.1g不同世代球孢白僵菌培养物，利用Trizol法提取Total RNA。利用AVM合成试剂盒Kit II(Omega)进行cDNA第一链合成。根据病毒RdRp(RNA-depedent RNApolymerase)基因设计特异性引物，采用2xSG Fast qPCR Master Mix(上海生工生物工程有限公司)试剂盒，实时荧光定量PCR***Quantstudio 6Flex以球孢白僵菌cal(calmodulin)基因作为内参基因，对球孢白僵菌病毒RdRP基因进行表达差异分析，以相对定量的方法分别对于球孢白僵菌继代培养后第1代，第2代以及第5代作球孢白僵菌病毒RdRP基因表达量进行检测。每个实验样品进行3次独立的生物学重复，采用2-ΔΔCT法计算相对表达量，观察继代培养中球孢白僵菌病毒的变化。
Figure BDA0002793950290000101
Real-time PCR反应体系及反应程序
(1)反应体系如下：
Figure BDA0002793950290000102
(2)qPCR循环程序运行如下：
Figure BDA0002793950290000103
2.6统计分析
采用软件SPSS 26.0进行统计分析，采用方差同质性(homogeneity of variance)检验方法进行方差齐性检验，One-way ANOVA进行差异显著性分析，多重比较采用LSD法进行。球孢白僵菌分离物产孢量、孢子萌发率、菌落生长速度、球孢白僵菌对玉米螟幼虫毒力与其病毒含量相关性采用软件SPSS 26.0进行一元线性回归分析，建立回归模型，评价各自变量对因变量的影响程度。采用软件Sigmaplot 12.5进行绘图。
2.7结果
通过继代培养测定双链RNA病毒的生物学活性，图6显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌生长速度的关系；图7显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌产孢量的关系；图8显示了双链RNA病毒与球孢白僵菌萌发率的关系。
具体而言，对寄主菌株进行1-5代继代培养，测定每一代球孢白僵菌培养物产孢量，孢子萌发率和菌落生长速度，结合继代过程中每一代病毒含量的荧光定量PCR测定，结果表明该病毒含量随着球孢白僵菌继代培养不断下降，且与球孢白僵菌菌落生长速度呈正相关(图6)，与球孢白僵菌产孢量成负相关(图7)，与球孢白僵菌孢子萌发率无相关性(图8)，与球孢白僵菌对寄主毒力呈正相关。
实施例3球孢白僵菌病毒菌种间传播及对球孢白僵菌生物学活性的影响
3.1球孢白僵菌病毒菌种间传毒
分别将含病毒菌株BbOFZK152与实验室工程菌株BbOFDH1-5(表达bar基因)活化，26℃暗培养3d后，利用直径5mm打孔器，分别取两菌株初生菌丝边缘。于新PDA培养基上进行对峙培养，三次重复，26℃，至两菌株菌丝生长重合。利用5mm打孔器取菌丝交界处含抗性基因一侧菌丝块至新筛选抗性PDA培养基(草铵膦浓度200ng\μl)上进行培养15d，收集分生孢子进行单孢分离，随机分离5个单孢，接种于灭菌的PDA培养基上，暗培养15天，收集菌丝进行病毒检测。
3.2球孢白僵菌病毒检测
提取筛选后菌株菌丝进行dsRNA提取验证，进行初步筛选，去除无dsRNA菌株。对于初步筛选菌株进行总RNA提取，将总RNA进行反转录，以所得cDNA为模板，利用引物BbCV-F：CCGCCACTTGACGCCGTATAAC；BbCV-R：CTTCGTGTTCGGGCATGGGATG，对于病毒特异性序列进行PCR扩增。PCR程序如下：
Figure BDA0002793950290000121
3.3球孢白僵菌病毒对寄主菌丝生长速率的影响
将供试球孢白僵菌菌株培养物随机挑取3个球孢白僵菌分离物的单孢，试验方法同2.4。
3.4统计分析
方法同2.6。
3.5结果
球孢白僵菌病毒菌种间传播及对球孢白僵菌菌丝生长速率的影响显示于图9，表明菌株对峙培养后15d菌丝生长重合。
将含病毒菌株BbOFZK152与受体菌株BbOFDH1-5进行对峙培养后(图9)，将受体菌株一侧经草铵膦选择压力获得的分生孢子进行单孢分离并扩繁，并进行双链RNA提取，结果表明，所有分离株均含有双链RNA(图10)，在此基础上，利用病毒特异性引物进行RT-PCR验证，结果表明，所有分离株均呈阳性，表明病毒已经有供体菌株BbOFZK152水平传播至受体菌株BbOFDH1-5。
球孢白僵菌病毒对寄主菌丝生长速率的影响显示于图12。通过对于五株对照组菌株以及五株处理组(含BbCV1)菌株菌丝直径进行连续10d的测量，得出对应组菌生长速率。通过对于两组生长速率的差异显著性分析，结果表明含病毒菌株菌丝生长速率高于无病毒菌株，具有极显著差异。证明BbCV1可以提高菌丝生长速率。
虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。
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序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种提高球孢白僵菌菌丝生长速度的产黄青霉科双链RNA真菌病毒
<130> 案卷号
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3441
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana chrysovirus 1(BbCV1)
<400> 1
<210> 2
<211> 2929
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana chrysovirus 1(BbCV1)
<400> 2
<210> 3
<211> 2924
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana chrysovirus 1(BbCV1)
<400> 3
<210> 4
<211> 2779
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana chrysovirus 1(BbCV1)
<400> 4

Claims (7)

1.一种产黄青霉科(Chrysoviridae)双链RNA真菌病毒，其包含SEQ ID NO:1或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:3或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
2.一种产黄青霉科双链RNA真菌病毒，其由SEQ ID NO:1或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列、SEQ ID NO:3或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列和SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列组成。
3.保藏号为CGMCC 19371的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)所携带的产黄青霉科双链RNA真菌病毒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的产黄青霉科双链RNA真菌病毒用于提高球孢白僵菌的菌丝生长速度的用途。
5.一种防治植物害虫的方法，包括使权利要求1或2所述的产黄青霉科双链RNA真菌病毒感染球孢白僵菌的步骤。
6.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株，其含有根据权利要求1或2所述的产黄青霉科双链RNA真菌病毒。
7.保藏号为CGMCC 19371的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
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