CN112301054A - 利用k1e噬菌体rna聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞表达病毒蛋白的方法 - Google Patents

利用k1e噬菌体rna聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞表达病毒蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法。本发明通过将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体，得到重组载体A；将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体，得到重组载体B；将重组载体A和重组载体B转染至宿主真核细胞中进行表达，得到目的蛋白。本发明提供的方法能将难以通过传统蛋白外源表达方法表达的蛋白进行表达，有助于开发特异性的抗病毒药物和预防病毒感染的有效疫苗。

Description

利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞 表达病毒蛋白的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法。
背景技术
大部分的真核表达***是利用宿主细胞的核转录和转录后机制，它们在生命科学领域中有着广泛的应用，而基于质粒的表达***却仍然有很大的缺陷。首先，质粒DNA从细胞质转移到细胞核在不***细胞中是一个限速的过程，在***细胞中这种限制基于质粒的真核表达***效率的障碍因为在有丝***的过程中由于核膜的暂时性解体而被克服，因而这种在静止细胞限制外源DNA转移到细胞核的因素对于非病毒基因治疗和DNA疫苗的接种疗效是一个很大的缺陷；第二，基于质粒表达***依赖于宿主细胞核RNA聚合酶II，这是一种中度的过程性酶，在体外和细胞中其延伸率分别是25和6个核苷酸/秒；第三，标准的基于质粒的真核表达***利用宿主细胞的转录机制，进而与宿主细胞基因组竞争转基因表达；第四，有些基因有潜在的内含子序列，进核的话会被剪接导致基因表达不出来。以上的这些挑战都会限制真核表达***的效率。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体，得到重组载体A；
(2)将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体，得到重组载体B；
(3)将步骤(1)得到的重组载体A和步骤(2)得到的重组载体B转染至宿主真核细胞中进行表达，得到目的蛋白。
所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，还包括如下步骤：
(4)检测：
A)收集转染后的细胞，冻融，得到检测样品；通过对目的蛋白的检测，评估利用K1E噬菌体RNA 聚合酶和启动子的双质粒***的表达效率；
B)当目的蛋白为荧光蛋白时，可选择通过荧光强度的观察初步评估利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***的表达效率。
步骤(1)中所述的NP868R帽状酶片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(1)中所述的构建的方式优选为通过同源重组将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体。
所述的同源重组的步骤优选具体如下：通过引物NP868R-F和NP868R-R扩增序列如SEQ ID NO.1所示的NP868R帽状酶片段，得到片段A；通过EcoRI和BamHI双酶切，将载体切成线性片段，得到片段B；通过同源重组酶将片段A和片段B进行同源重组连接，得到重组载体A；
NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’；
NP868R-R：5’-AGAACCTCCACCTCCGGATCCATTTTTGCGCAGACAAATAAACCC-3’。
步骤(1)中所述的含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体优选为载体pXIP-myc-K1ERNAP。
所述的载体pXIP-myc-K1ERNAP通过如下步骤制备得到：将序列如SEQ ID NO.2所示的myc -K1ERNAP-IRES-puroR通过EcoRI和NotI酶切位点克隆至载体pXJ40中，得到载体pXIP-myc-K1ERNAP。
步骤(2)中所述的目的蛋白为病毒蛋白，或病毒蛋白和荧光蛋白。
所述的病毒优选为鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和冠状病毒。
所述的病毒蛋白优选为病毒结构蛋白和病毒非结构蛋白中的至少一种。
所述的病毒非结构蛋白优选为nsp3、nsp4、nsp12和nsp13中的至少一种。
所述的病毒结构蛋白优选为IBVS结构蛋白。
所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
步骤(2)中所述的构建的方式优选为通过同源重组将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体。
步骤(2)中所述的K1E启动子的序列如下所示：TTACTGGACACTATAGAAG。
步骤(2)中所述的含有K1E启动子的载体还包含荧光素酶HiBiT标签序列；优选为载体pK1E-HiBiT。
所述的pK1E-HiBiT通过如下步骤制备得到：将序列如SEQ ID NO.3所示的K1Epro-3’-UTR-gHDV Rz 通过酶切位点Asel和MluI，构建入载体pEGFP-C1中，得到载体pK1E-HiBiT。
所述的同源重组的步骤优选具体如下：
1)以鸡传染性支气管炎病毒cDNA为模板，通过如下引物扩增得到nsp3、nsp4、nsp12、nsp13和IBVS cDNA序列；
nsp3-F：5’-ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTAAGACTGTCACCTTTG-3’；
nsp3-R：5’-GAAAAAGGCAGGTTAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC-3’；
nsp4-F：5’-ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTATTGTTAGCGGCACCTTT-3’；
nsp4-R：5’-GCTCAGTTAGCTAACTCGAGCTATTGTAATCTACTAACACCAATAGAGTAACG-3’；
nsp12-F：5’-GAGGAGGTGGATCCTTTAAACGGGTACGGGGTAGCAGTGA-3’；
nsp12-R：5’-AGAGCTCCTACGACTTTACCTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGCTTT-3’；
nsp13-F：5’-GCGGATCTGGAGGAGGTGGATCCTGTGGCGTTTGTGTAGT-3’；
nsp13-R：5’-GTGAAACAAGTCTGCAATAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC-3’；
IBVS-F：5’-CAGACACCGAATTCCACCATGTTGGTAACACCTCTTTTAC-3’；
IBVS-R：5’-AGACCCAAAAAGTCTGTTTGAACCGAGCAGAAGCTGATCTC-3’；
2)以序列如SEQ ID NO.4所示的msfGFP片段为模板，通过引物SFV-GFP-F和SFV-GFP-R扩增得到序列C；
SFV-GFP-F：5’-GGTCCGAAGAGTGGGATCCCGTGAGTAAAGGTGAAGAACTC-3’；
SFV-GFP-R：5’-CAATTAATTACCCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCATCC-3’。
3)通过BamHI和XhoI将载体pK1E-HiBiT切成线性片段，分别与扩增得到的nsp3、nsp4、nsp12、 nsp13 cDNA序列和序列C进行同源重组连接；通过EcoRI和XhoI将载体pK1E-HiBiT切成线性片段，与 IBVS cDNA序列进行同源重组连接。
步骤(3)中所述的宿主真核细胞为动物细胞，优选为人肺癌细胞H1299，非洲绿猴肾细胞(Vero)和人肾上皮细胞系293T。
步骤(3)中所述的重组载体A和所述的重组载体B优选为按摩尔比1：3的比例配比转染。
步骤(3)中所述的转染为瞬时转染。
步骤(4)中所述的对目的蛋白的检测包括蛋白免疫印迹法。
所述的利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法在蛋白表达中的应用，特别是对难以通过传统蛋白外源表达方法表达的蛋白进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
在本发明中我们构建了一个K1E真核细胞质表达病毒蛋白***。这个***依赖于两种成分：1)一种人工嵌合酶，包括一个5’-加帽酶NP868R和噬菌体K1E RNA聚合酶；2)有具体转录的转导酶和提供人工聚腺苷酸的DNA模板。一旦K1E酶在细胞质中表达，帽状和聚腺苷酸化的mRNA就独立于宿主细胞的转录机制而产生。以往的CMV真核表达***表达IBV的nsp3和nsp4是根本检测不到蛋白的，但是本发明中的K1E真核细胞质表达***能够使IBV的nsp3和nsp4蛋白在人肺癌细胞H1299、非洲绿猴肾细胞 (Vero)和人肾上皮细胞系293T中的瞬时表达效率良好，可见该***有助于开发特异性的抗病毒药物和预防病毒感染的有效疫苗，是一种很好的科技研究手段。
附图说明
图1是同源重组技术构建目的蛋白质粒的图谱图；其中，A为质粒pXIP-K1ERNAP-NP868R的图谱图， B为pK1Epro-HiBiT谱图，目的蛋白在(G4S)2linker与3’UTR之间的位置。
图2是HiBiT报告***检测质粒表达结果图。图中为在H1299和293T细胞上表达荧光蛋白GFP和非结构蛋白Nsp3、Nsp12、Nsp13后进行荧光素酶发光测定。
图3是蛋白免疫印迹测定目的蛋白的表达结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1构建质粒pXIP-K1ERNAP-NP868R
以公司合成的NP868R基因片段(序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，设计具有同载体pXIP-myc-K1ERNAP(以载体pXJ40为基础，该载体已在文献“Cloning,Expression,andTranscriptional Properties of the Human Enhancer Factor TEF-1,Cell.1991:P551-568”中公开；用EcoRI和NotI酶切pXJ40，中间部分的序列myc-K1ERNAP-IRES-puroR如SEQID NO.2所示，由金唯智生物科技有限公司合成，最后将通过EcoRI和NotI酶切后得到的pXJ40与合成的序列连接，得到pXIP-myc-K1ERNAP)相同的同源臂的引物NP868R-F、下游引物NP868R-R，用于扩增NP868R片段，通过EcoRI和BamHI双酶切，将载体切成线性片段，通过同源重组酶将两个片段进行同源重组连接，连接反应体系见表1，反应条件见表2；通过氯化钙化学转化的方法，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取适量转化产物于含100μg/ml的氨苄西林LB固体培养基中进行涂布培养，最后挑选多个单菌落通过PCR的方法验证克隆是否成功，该PCR 中所运用的引物为上游引物RBGI-F和下游引物NP868R-R；再从中挑选几个单克隆进行质粒的提取，通过 EcoRI和XhoI酶切，得到6189bp和4598bp大小的两个片段为目标质粒；进一步验证质粒是否成功，最后挑选阳性质粒送公司进行测序验证，确定得到阳性质粒pXIP-K1ERNAP-NP868R(K1E RNA聚合酶和 NP868R序列之间是由两个G4S氨基酸连接)，构建的阳性质粒图谱如图1A所示。
NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’(含Kozak序列和起始密码子ATG)；
NP868R-R：5’-AGAACCTCCACCTCCGGATCCATTTTTGCGCAGACAAATAAACCC-3’(含终止密码子 TAA)；
RBGI-F：5’-GCAACGTGCTGGTTATTGTG-3’。
表1同源重组反应体系
Figure BDA0002739496720000031
表2同源重组反应条件
Figure BDA0002739496720000032
实施例2构建S蛋白和非结构蛋白至克隆载体pK1E-HiBiT
从感染本实验室在细胞上具有细胞适应性的IBV病毒的细胞样品(即鸡的传染性支气管炎病毒(IBV)，购买于American Type Culture Collection,ATCC，先在10日龄的鸡胚上适应传代3代，再转移到非洲绿猴肾细胞(Vero，购于American Type CultureCollection,ATCC))上连续传代感染65代(p65)，得到适应毒株IBV-p65。本实验样品是将适应毒株IBV-p65感染Vero细胞，当所有细胞都发生细胞融合病变效应，用 Trizol裂解细胞，收取样品)中提取病毒RNA，进行反转录成cDNA，反转录体系见表3，反应条件见表4；设计具有同载体pK1E-HiBiT(该载体是pEGFP-C1，用Asel和MluI将CMV-EGFP-polyA替换成本载体的如SEQ ID NO.3所示的K1Epro-3’-UTR-gHDV Rz序列，该序列由公司合成；通过Asel和MluI双酶切 pEGFP-C1，然后由公司合成的序列与酶切后的pEGFP-C1连接得到载体pK1E-HiBiT)相同的同源臂的引物，以cDNA为模板通过PCR扩增nsp3、nsp4、nsp12、nsp13这几个非结构蛋白和结构蛋白IBVS的基因片段，扩增这几个片段的引物见表5，反应体系见表6，反应条件见表7；通过BamHI和XhoI(用于构建本发明中的非结构蛋白)或者EcoRI和XhoI(用于构建本发明中的IBVS结构蛋白)酶切方法，将载体 pK1E-HiBiT切成线性片段，通过同源重组酶将两个片段进行同源重组连接(反应体系和条件同实施例1)；通过氯化钙化学转化的方法，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取适量转化产物于含 50μg/ml的卡那霉素LB固体培养基中进行涂布培养，最后从中挑选几个单克隆进行质粒的提取，通过BamHI和XhoI酶切pK1Epro-IBV-nsp3、pK1Epro-IBV-nsp4、pK1Epro-IBV-nsp12、pK1Epro-IBV-nsp13这几个质粒，分别得到4758bp+3665bp、1551bp+3665bp、2788bp+3665bp、1806bp+3665bp片段为目标质粒，通过EcoRI和HindIII酶切pK1Epro-IBV-S质粒，得到4878bp+3665bp片段为目标质粒，进一步验证质粒是否成功，最后挑选上述质粒中的阳性质粒送公司进行测序验证。构建目标蛋白的图谱如图1B所示。
表3反转录反应体系
Figure BDA0002739496720000041
表4反转录反应条件
Figure BDA0002739496720000042
表5引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’)
nsp3-F ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTAAGACTGTCACCTTTG
nsp3-R GAAAAAGGCAGGTTAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC
nsp4-F ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTATTGTTAGCGGCACCTTT
nsp4-R GCTCAGTTAGCTAACTCGAGCTATTGTAATCTACTAACACCAATAGAGTAACG
nsp12-F GAGGAGGTGGATCCTTTAAACGGGTACGGGGTAGCAGTGA
nsp12-R AGAGCTCCTACGACTTTACCTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGCTTT
nsp13-F GCGGATCTGGAGGAGGTGGATCCTGTGGCGTTTGTGTAGT
nsp13-R GTGAAACAAGTCTGCAATAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC
IBVS-F CAGACACCGAATTCCACCATGTTGGTAACACCTCTTTTAC
IBVS-R AGACCCAAAAAGTCTGTTTGAACCGAGCAGAAGCTGATCTC
表6 PCR反应体系
Figure BDA0002739496720000043
表7反应条件
Figure BDA0002739496720000044
实施例3构建msfGFP片段至克隆载体pK1E-HiBiT
将送公司合成的msfGFP片段(如SEQ ID NO.4所示)作为模板扩增msfGFP片段，上游引物 SFV-GFP-F，下游引物SFV-GFP-R，载体pK1E-HiBiT通过BamHI和XhoI酶切位点切成线性，通过同源重组酶将两个片段进行同源重组连接，得到pK1E-HiBiT-msfGFP，构建质粒的方法同实施例2中的方法一样。
SFV-GFP-F：5’-GGTCCGAAGAGTGGGATCCCGTGAGTAAAGGTGAAGAACTC-3’；
SFV-GFP-R：5’-CAATTAATTACCCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCATCC-3’。
实施例4通过转染实验进行质粒表达
将pXIP-K1ERNAP-NP868R质粒分别和pK1Epro-IBV-S、pK1Epro-IBV-nsp3、pK1Epro-IBV-nsp4、 pK1Epro-IBV-nsp12、pK1Epro-IBV-nsp13、pK1Epro-IBV-msfGFP质粒以摩尔比1：3的比例混合，根据公司说明书，加入转染试剂(Transfection ELTransfection Reagent，FT201-2，全式金)与上述质粒混合，静置20分钟，接着将质粒转染试剂混合液逐滴加入到前一天铺好的人肺癌细胞H1299(American Type CultureCollection,ATCC)、非洲绿猴肾细胞(Vero，American Type Culture Collection,ATCC)和人肾上皮细胞293T (American Type Culture Collection,ATCC)三个细胞系中，经过24小时转染收取细胞蛋白样品和细胞冻融三次的样品。
实施例5HiBiT报告***和蛋白免疫印迹法以及HiBiT印迹法检测蛋白表达
通过HiBiT报告***得出这些蛋白质粒的表达情况，具体步骤是：将实施例4中的细胞冻融样品取出，充分涡旋，根据promega公司
Figure BDA0002739496720000051
HiBiT Lytic Detection System试剂盒说明书，每个样品取60μl，等量加入混有LgBiT protein、HiBiT Lytic Substrate以及HiBiT缓冲液的混合液，充分吹打混匀，分装到96 孔板中，通过酶标仪进行检测发光情况，初步判断质粒的表达情况，如图2所示。
通过HiBiT蛋白免疫印迹法法(Western Blot)检验蛋白的表达情况，具体步骤：将实施例4中收取的蛋白样品取出，在95℃的金属浴中煮10分钟，每个蛋白取等量在SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳实验，再通过膜转移实验将蛋白转移到NC膜上，接着对NC膜用5％的脱脂奶进行封闭实验，最后根据promega 公司的
Figure BDA0002739496720000052
HiBiT Blotting System试剂盒孵育出目的蛋白，如图3所示。
图2的结果和图3的结果表明了利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达病毒蛋白的方法是可行的，并且是行之有效的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2604
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> NP868R序列
<400> 1
atggcttctt tagataattt agtggcacga tatcagaggt gctttaatga ccagtctctt 60
aaaaatagta ctattgaact tgaaatacgt tttcaacaga taaatttttt attattcaaa 120
accgtatatg aggcacttgt ggcacaagag atccctagca ccatctccca cagcatccgc 180
tgcatcaaaa aagttcacca tgaaaaccac tgccgggaaa aaattttgcc gtcggaaaat 240
ctttacttca aaaaacagcc tctcatgttt tttaagtttt cagagcctgc atctctgggc 300
tgtaaggtct cgctggccat cgagcagccc attcgtaaat ttatcttgga ctcctccatt 360
ctcgttcggc tcaaaaatcg tacgaccttt cgggtatctg aactttggaa aatagagctt 420
accattgtaa agcagctgat gggaagcgag gtctctgcaa aacttgccgc tttcaaaacg 480
cttctgtttg acaccccaga gcaacaaacg acaaaaaata tgatgacgtt aataaaccca 540
gatgacgaat atctttacga aatagaaata gagtatacag gaaagcccga atccctaacg 600
gcggcagatg ttataaaaat taaaaacacg gtgttgacac ttatttctcc aaaccattta 660
atgctaacag cctaccacca ggccattgaa ttcattgcct cccatatact gtcctcagaa 720
atccttcttg ctcgtattaa gagcgggaag tgggggctta aacgcctcct cccccaggtg 780
aaatccatga ccaaagcgga ttacatgaaa ttttatccgc ccgttggcta ctatgtaacg 840
gacaaagcag atggaattag aggcatcgcc gtcattcagg acacgcaaat ttatgtggtt 900
gcagaccagt tatacagcct aggtaccacc ggcattgaac cccttaaacc aaccattttg 960
gacggtgaat ttatgcctga aaaaaaagaa ttttatgggt ttgacgtcat catgtatgag 1020
ggcaatctat tgacgcaaca ggggtttgaa acaagaattg agtctttaag caagggcatt 1080
aaagtcttac aagcgtttaa cataaaagca gaaatgaagc cctttatttc gctaacaagt 1140
gcagatccca acgtgctcct caaaaacttt gaaagcattt ttaagaaaaa aactcgccca 1200
tattctattg atggcatcat tttagtagaa cctggcaatt cttatctaaa tacaaacacc 1260
tttaagtgga agcccacctg ggataacaca ttagactttt tggtgcgaaa atgtccggag 1320
agtttaaacg taccagagta cgcgcccaaa aaagggtttt ccctgcatct actatttgta 1380
ggcatctccg gagagctttt taaaaaatta gcgctaaatt ggtgtccagg atatacgaaa 1440
ctattccccg ttacacagcg caaccaaaac tactttccag tacagttcca gccatcggat 1500
tttccattgg catttcttta ttaccaccca gatacctcgt cattttctaa tatagatgga 1560
aaggtccttg aaatgcgttg tcttaagaga gaaatcaatc acgtcagctg ggaaattgta 1620
aaaatccggg aggataggca gcaggatctt aaaaccggcg ggtattttgg caatgatttc 1680
aaaacagccg aactcacatg gcttaactat atggatccct tttcctttga ggagctggca 1740
aagggccctt ctggaatgta cttcgccggt gccaaaaccg gcatataccg cgctcaaaca 1800
gcacttattt cctttattaa acaagaaatc atccaaaaaa taagtcacca atcctgggtt 1860
atcgatcttg gaataggaaa agggcaggac ctaggacgtt acctggacgc agggataagg 1920
catcttgttg ggatcgataa ggatcaaacc gcgcttgcgg agcttgttta tcgaaaattt 1980
tcgcatgcta cgacccgaca gcacaagcac gctaccaaca tttacgtgtt gcatcaagac 2040
ctcgcagagc ctgcgaaaga aatcagcgaa aaggtacacc aaatttacgg gtttcccaag 2100
gagggagctt cttccattgt tagcaacctg tttattcact atcttatgaa aaacacgcag 2160
caggtggaaa acctggccgt tctgtgccat aagcttcttc agccgggggg aatggtgtgg 2220
tttaccacca tgttgggaga acaggtctta gaattacttc atgaaaatag aatagagctc 2280
aatgaagtat gggaggctcg tgaaaacgaa gtggtcaaat ttgctattaa acgtctcttt 2340
aaagaggata tattacagga aactgggcaa gaaattggag tcctgttacc cttcagcaat 2400
ggcgacttct acaatgaata tcttgtgaac acagcgtttt taattaaaat atttaaacat 2460
cacggctttt ccctagttca aaagcagtcc tttaaggact ggattccaga atttcaaaac 2520
tttagtaaaa gtttgtataa aattcttaca gaagccgata aaacttggac aagccttttt 2580
gggtttattt gtctgcgcaa aaat 2604
<210> 2
<211> 3946
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> myc-K1ERNAP-IRES-puroR
<400> 2
atggagcaga agctgatctc agaggaggac ctgggatccg gaggtggagg ttctggcgga 60
ggagggtcta tgcaagatct gcacgccatc cagctccagc tggaggaaga gatgttcaat 120
ggcggcatta gaagattcga ggccgatcag cagaggcaga ttgccagcgg caacgagagc 180
gacaccgctt ggaatagaag gctgctgtcc gaactgattg cccccatggc tgagggcatt 240
caagcctaca aggaggagta tgaaggcaag agaggaagag ctcctagggc tctggccttc 300
attaactgtg tcggcaacga agtggctgcc tacatcacca tgaagatcgt catggacatg 360
ctgaacacag acgtcacact gcaagccatt gctatgaacg tcgccgatag aattgaggac 420
caagtgaggt tcagcaagct ggagggccat gccgctaaat atttcgagaa ggtcaagaag 480
tctctgaagg cctccaaaac caagagctat aggcacgccc ataacgtggc cgtcgtggct 540
gagaagagcg tcgctgatag ggacgctgac ttctctagat gggaggcttg gcccaaagac 600
accctcctcc agatcggcat gacactgctg gagattctgg agaactccgt gttcttcaac 660
ggccagcccg tgtttctgag aacactgaga acaaacggcg gcaagcatgg agtgtattat 720
ctgcagacca gcgagcacgt cggcgaatgg atcaccgcct ttaaggaaca cgtggctcag 780
ctgtcccccg cttatgctcc ttgcgtcatc cctcctaggc cttgggtcag ccccttcaac 840
ggaggctttc ataccgagaa ggtggccagc agaatcagac tggtgaaggg caacagagaa 900
catgtgagga agctgaccaa gaaacaaatg cccgccgtct acaaagctgt caatgctctg 960
caagccacca agtggcaagt gaacaaggaa gtcctccaag tggtcgaaga cgtgattaga 1020
ctcgacctcg gctatggcgt cccttccttt aagcctctga tcgatagaga gaacaagccc 1080
gccaaccccg tgcctctgga gttccagcat ctgagaggaa gagagctgaa ggagatgctg 1140
acccccgagc aatggcaagc cttcatcaac tggaagggcg agtgcaccaa gctgtacacc 1200
gccgagacca aaaggggcag caagtccgct gccaccgtga gaatggtggg acaagctaga 1260
aagtacagcc aattcgacgc catctacttt gtctacgctc tggactccag atctagagtg 1320
tatgctcaaa gcagcacact gagccctcag agcaatgatc tgggcaaagc tctgctgagg 1380
tttaccgagg gccagagact ggactccgct gaggctctga agtggtttct ggtgaacggc 1440
gccaacaatt ggggatggga caagaagaca ttcgacgtga gaaccgccaa cgtgctcgac 1500
agcgagttcc aagacatgtg tagagatatc gccgccgacc ctctgacctt tacccagtgg 1560
gtgaacgccg acagccccta tggctttctc gcttggtgct ttgagtacgc cagatatctg 1620
gacgccctcg acgagggaac ccaagaccag ttcatgacac atctgcccgt gcaccaagac 1680
ggcagctgca gcggaatcca gcactacagc gccatgctgt ccgatgctgt cggcgctaag 1740
gccgtgaatc tgaagccctc cgattcccct caagacatct atggcgccgt ggctcaagtg 1800
gtgatccaga agaactacgc ctacatgaat gctgaagacg ccgagacatt cacaagcggc 1860
tccgtgacac tcaccggcgc tgagctgaga agcatggcta gcgcttggga catgatcggc 1920
atcacaagag gactgaccaa gaagcccgtg atgacactgc cctacggaag cacaaggctg 1980
acatgcagag aaagcgtgat cgactacatc gtggatctgg aggaaaagga ggcccagagg 2040
gctattgccg agggcagaac agctaatccc gtgcacccct tcgacaacga taggaaagac 2100
agcctcaccc ctagcgccgc ttacaactac atgacagccc tcatctggcc ctccatcagc 2160
gaagtggtga aggctcccat cgtggctatg aagatgatta gacagctcgc cagattcgct 2220
gctaaaagaa acgagggact ggagtatcct ctgcccaccg gctttattct gcagcagaag 2280
atcatggcca ccgacatgct gagagtctcc acatgtctga tgggcgagat caagatgagc 2340
ctccagatcg agaccgacgt ggtggatgaa accgctatga tgggagccgc cgcccccaat 2400
tttgtccacg gccatgatgc ctcccatctg attctcacag tctgcgatct ggtcgacaag 2460
ggcatcacca gcgtggctgt gatccatgat tcctttggca cccatgccgg cagaacagcc 2520
gatctgaggg actctctgag agaggaaatg gtcaaaatgt accagaatca caacgctctg 2580
cagaatctgc tggatgtgca cgaggaaagg tggctggtcg ataccggcat ccaagtgccc 2640
gagcaaggcg agttcgatct gaacgagatt ctggtgagcg actactgctt cgcttgaacg 2700
cgttagctaa ctgactcgag gcgaccgccc cgggctgcag gagctcggta taagatccgc 2760
ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt 2820
gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg 2880
aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga 2940
atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa 3000
acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc 3060
tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac 3120
gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag 3180
gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtac 3240
acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 3300
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc acaaccatga ccgagtacaa 3360
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 3420
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 3480
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 3540
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 3600
ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 3660
gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 3720
ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 3780
ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaaa cctccgcgcc 3840
ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 3900
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctga 3946
<210> 3
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> K1Epro-3’-UTR-gHDV Rz
<400> 3
taatcagtat ttactggaca ctatagaagg ggtcgacaca tttgcttctg acacaactgt 60
gttcactagc aacctcaaac agacaccgaa ttcgccacca tggtgagcgg ctggcggctg 120
ttcaagaaga ttagcggcgg gggcggatct ggaggaggtg gatccggaag cttggctgca 180
gcggccgctg gctcgagtta gctaactgag ctcgctttct tgctgtccaa tttctattaa 240
aggttccttt gttccctaag tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag 300
catctggatt ctgcctaccg gtagattaat agatctcaaa ggctcttttc agagccacca 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggccggcatg gtcccagcct 420
cctcgctggc gccggctggg caacattccg aggggaccgt cccctcggta atggcgaatg 480
ggacccatag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttg 534
<210> 4
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> msfGFP
<400> 4
gtgagtaaag gtgaagaact cttcactgga gtagtgccca ttctggtaga gcttgatgga 60
gatgtaaatg gacataaatt ctccgtcagg ggcgaaggcg aaggggacgc cacgaatggt 120
aagctgactc tgaaattcat ctgtacgacg ggcaaactgc ccgtcccatg gcctacactc 180
gtaacgaccc tcacctacgg cgtgcaatgc ttttctcgat atcccgacca catgaaacag 240
catgactttt tcaagtctgc aatgcctgaa ggttatgttc aagaaaggac catcagcttt 300
aaggatgatg gtacatataa aacccgagcc gaggttaaat ttgaagggga cactctggtt 360
aatcgaattg aactgaaagg tattgatttt aaggaggacg gtaacatact ggggcacaag 420
ttggagtaca actttaacag ccataatgtg tatattaccg ctgataagca gaaaaatggg 480
ataaaggcca actttaagat ccgacataat gtcgaagatg gtagtgttca actggctgat 540
cattaccaac aaaatacgcc catcggagat ggacctgtac tcttgcctga caatcattat 600
ctctccacgc aatcaaagct ttccaaggac ccaaacgaaa agagagatca catggtcctt 660
ctggaatttg tgactgccgc aggcatcact ctcggtatgg atgagctgta caag 714
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> K1E启动子
<400> 5
ttactggaca ctatagaag 19
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> NP868R-F
<400> 6
gactcactat agggcgaatt gccaccatgg cttctttag 39
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> NP868R-R
<400> 7
agaacctcca cctccggatc catttttgcg cagacaaata aaccc 45
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> RBGI-F
<400> 8
gcaacgtgct ggttattgtg 20
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp3-F
<400> 9
atctggagga ggtggatccg gtaagactgt cacctttg 38
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp3-R
<400> 10
gaaaaaggca ggttaactcg agttagctaa ctgagctcgc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp4-F
<400> 11
atctggagga ggtggatccg gtattgttag cggcaccttt 40
<210> 12
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp4-R
<400> 12
gctcagttag ctaactcgag ctattgtaat ctactaacac caatagagta acg 53
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp12-F
<400> 13
gaggaggtgg atcctttaaa cgggtacggg gtagcagtga 40
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp12-R
<400> 14
agagctccta cgactttacc tcgagttagc taactgagct cgcttt 46
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp13-F
<400> 15
gcggatctgg aggaggtgga tcctgtggcg tttgtgtagt 40
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> nsp13-R
<400> 16
gtgaaacaag tctgcaataa ctcgagttag ctaactgagc tcgc 44
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> IBVS-F
<400> 17
cagacaccga attccaccat gttggtaaca cctcttttac 40
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> IBVS-R
<400> 18
agacccaaaa agtctgtttg aaccgagcag aagctgatct c 41
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> SFV-GFP-F
<400> 19
ggtccgaaga gtgggatccc gtgagtaaag gtgaagaact c 41
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<223> SFV-GFP-R
<400> 20
caattaatta cccgggatcc ttacttgtac agctcatcc 39

Claims (10)

1.一种利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体，得到重组载体A；
(2)将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体，得到重组载体B；
(3)将步骤(1)得到的重组载体A和步骤(2)得到的重组载体B转染至宿主真核细胞中进行表达，得到目的蛋白。
2.根据权利要求1所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于还包括如下步骤：
(4)检测：
A)收集转染后的细胞，冻融，得到检测样品；通过对目的蛋白的检测，评估利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***的表达效率；
B)当目的蛋白为荧光蛋白时，可选择通过荧光强度的观察初步评估利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***的表达效率。
3.根据权利要求1或2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的NP868R帽状酶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(1)中所述的构建的方式通过同源重组将NP868R帽状酶片段构建至含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体；
步骤(1)中所述的含有K1E RNA聚合酶表达序列的载体为pXIP-myc-K1ERNAP；
所述的载体pXIP-myc-K1ERNAP通过如下步骤制备得到：将序列如SEQ ID NO.2所示的myc-K1ERNAP-IRES-puroR通过EcoRI和NotI酶切位点克隆至载体pXJ40中，得到载体pXIP-myc-K1ERNAP。
4.根据权利要求3所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
所述的同源重组的步骤具体如下：通过引物NP868R-F和NP868R-R扩增序列如SEQ IDNO.1所示的NP868R帽状酶片段，得到片段A；通过EcoRI和BamHI双酶切，将载体切成线性片段，得到片段B；通过同源重组酶将片段A和片段B进行同源重组连接，得到重组载体A；
NP868R-F：5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGCCACCATGGCTTCTTTAG-3’；
NP868R-R：5’-AGAACCTCCACCTCCGGATCCATTTTTGCGCAGACAAATAAACCC-3’。
5.根据权利要求1或2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的目的蛋白为病毒蛋白，或病毒蛋白和荧光蛋白；
步骤(2)中所述的构建的方式为通过同源重组将目的蛋白的cDNA序列构建至含有K1E启动子的载体；
步骤(2)中所述的K1E启动子的序列如下所示：TTACTGGACACTATAGAAG。
6.根据权利要求5所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
所述的病毒为鸡传染性支气管炎病毒和冠状病毒；
所述的病毒蛋白为病毒结构蛋白和病毒非结构蛋白中的至少一种；
所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白；
步骤(2)中所述的含有K1E启动子的载体还包含荧光素酶HiBiT标签序列。
7.根据权利要求6所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
所述的病毒非结构蛋白为nsp3、nsp4、nsp12和nsp13中的至少一种；
所述的病毒结构蛋白为IBVS结构蛋白；
步骤(2)中所述的含有K1E启动子的载体为载体pK1E-HiBiT；
所述的pK1E-HiBiT通过如下步骤制备得到：将序列如SEQ ID NO.3所示的K1Epro-3’-UTR-gHDV Rz通过酶切位点Asel和MluI，构建入载体pEGFP-C1中，得到载体pK1E-HiBiT；
所述的同源重组的步骤具体如下：
1)以鸡传染性支气管炎病毒cDNA为模板、通过如下引物扩增得到nsp3、nsp4、nsp12、nsp13和IBVS cDNA序列；
nsp3-F：5’-ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTAAGACTGTCACCTTTG-3’；
nsp3-R：5’-GAAAAAGGCAGGTTAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC-3’；
nsp4-F：5’-ATCTGGAGGAGGTGGATCCGGTATTGTTAGCGGCACCTTT-3’；
nsp4-R：5’-GCTCAGTTAGCTAACTCGAGCTATTGTAATCTACTAACACCAATAGAGTAACG-3’；
nsp12-F：5’-GAGGAGGTGGATCCTTTAAACGGGTACGGGGTAGCAGTGA-3’；
nsp12-R：5’-AGAGCTCCTACGACTTTACCTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGCTTT-3’；
nsp13-F：5’-GCGGATCTGGAGGAGGTGGATCCTGTGGCGTTTGTGTAGT-3’；
nsp13-R：5’-GTGAAACAAGTCTGCAATAACTCGAGTTAGCTAACTGAGCTCGC-3’；
IBVS-F：5’-CAGACACCGAATTCCACCATGTTGGTAACACCTCTTTTAC-3’；
IBVS-R：5’-AGACCCAAAAAGTCTGTTTGAACCGAGCAGAAGCTGATCTC-3’；
2)以序列如SEQ ID NO.4所示的msfGFP片段为模板，通过引物SFV-GFP-F和SFV-GFP-R扩增得到序列C；
SFV-GFP-F：5’-GGTCCGAAGAGTGGGATCCCGTGAGTAAAGGTGAAGAACTC-3’；
SFV-GFP-R：5’-CAATTAATTACCCGGGATCCTTACTTGTACAGCTCATCC-3’；
3)通过BamHI和XhoI将载体pK1E-HiBiT切成线性片段，分别与扩增得到的nsp3、nsp4、nsp12、nsp13 cDNA序列和序列C进行同源重组连接；通过EcoRI和XhoI将载体pK1E-HiBiT切成线性片段，与IBVS cDNA序列进行同源重组连接。
8.根据权利要求1或2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的宿主真核细胞为人肺癌细胞H1299，非洲绿猴肾细胞和人肾上皮细胞系293T中的至少一种；
步骤(3)中所述的重组载体A和所述的重组载体B按摩尔比1：3的比例配比转染。
9.根据权利要求2所述利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的对目的蛋白的检测包括蛋白免疫印迹法。
10.权利要求1～9任一项所述的利用K1E噬菌体RNA聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞质表达蛋白的方法在蛋白表达中的应用。
CN202011145191.2A 2020-10-23 2020-10-23 利用k1e噬菌体rna聚合酶和启动子的双质粒***在真核细胞表达病毒蛋白的方法 Pending CN112301054A (zh)

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