CN112300134B - Ask1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

Ask1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ASK1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用。该化合物结构如式I，该ASK1抑制剂衍生物涉及所述化合物的异构体、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂化物、溶剂化物的盐、药学上可接受的盐或它们的混合物。该ASK1抑制剂及其衍生物对ASK1激酶具有高效的抑制作用，可用于制备与ASK1激酶相关疾病的药物，所制备药物在分子水平和细胞水平均可以发挥药效，应用广泛，并且该类化合物合成方法简便，易操作。
Figure DDA0002751617350000011

Description

ASK1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用
技术领域
本发明涉及一种ASK1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一种可制备为ASK1抑制剂药物的ASK1抑制剂及其衍生物，制备方法、药物组合物和应用。
背景技术
细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)属于细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，MAPK信号通路是生物体内重要的信号传导***之一，参与介导细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应等生理过程。MAPK家族包括细胞外信号调节激酶(ERK)、p38MAPK和JNK三大亚家族。MAPK家族包含三级激酶，首先是细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAP3K)受细胞内外刺激而激活，激活的MAP3K磷酸化激活MAP2K，后者再激活MAPK。ASK1属于MAP3K5，处于P38MAPK和JNK信号通路的上游。
ASK1能够在一系列应激反应的刺激下激活，如氧化应激、内质网应激和钙内流等。激活的ASK1通过磷酸化激活MKK3/6和MKK4/7从而激活P38MAPK和JNK通路。ASK1在调节细胞凋亡、细胞因子反应、细胞分化和先天性免疫反应等细胞生理过程中发挥重要作用。研究表明ASK1与许多疾病具有明显的相关性，如：神经退行性疾病、心血管***疾病、炎症性疾病、代谢性疾病和自身免疫性疾病等。
相关文献报道显示，ASK1小分子抑制剂表现出对多种疾病的治疗潜力。例如，GS-444217在多种肾纤维化和炎症动物实验模型中具有明显效果，K811、K812在ALS(肌萎缩性侧索性硬化症)的SOD1G93A转基因小鼠模型中延长小鼠生存期，K811在体外和体内实验中抑制胃癌细胞生长，GS-4997进行过肺动脉高压、糖尿病肾病和非酒精脂肪性肝炎(NASH)的临床实验。然而，目前ASK1小分子抑制剂的结构类型较为单一，只有GS-4997进行了相关疾病的临床实验。但是，GS-4997在两项关于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)III期临床实验中均未达到临床终点。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种ASK1抑制剂及其衍生物，第二目的是提供所述ASK1抑制剂及其衍生物的制备方法，第三目的是提供一种包含所述ASK1抑制剂和/或其衍生物的药物组合物，第四目的是提供所述ASK1抑制剂及其衍生物在制备ASK1抑制剂药物中的应用。
技术方案：本发明的ASK1抑制剂及其衍生物具有式I的结构，所述衍生物为所述化合物的异构体、非对映异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂化物、溶剂化物的盐、药学上可接受的盐或它们的混合物：
Figure BDA0002751617330000021
其中：
M1、M2或M3为N或C(R3)；
环A或环B为芳环或芳杂环；
R1、R2或R3为相同或不同的氢原子、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、卤素、氨基、硝基、羟基、氰基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR6、-(CH2)nSR6、-(CH2)nC(O)R6、-(CH2)nC(O)OR6、-(CH2)nS(O)mR6、-(CH2)nNR7R8、-(CH2)nC(O)NR7R8、-(CH2)nC(O)NHR7、-(CH2)nNR7C(O)R6或-(CH2)nNR7S(O)mR6；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9、-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R6为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9、-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R7或R8为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9、-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R9或R10为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、酯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、酯基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
x或n为0-5的整数；
m为0-2的整数。
优选，上述ASK1抑制剂及其衍生物结构中：
环B为
Figure BDA0002751617330000031
或
Figure BDA0002751617330000032
进一步地，上述ASK1抑制剂及其衍生物具有式II的结构：
Figure BDA0002751617330000033
其中：
M3为N或C(R3)，优选CH；
环A为芳环或芳杂环，优选为5元芳杂环；
R1为相同或不同的氢原子、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C1-8烷氧基、C1-8卤代烷氧基、卤素、C3-8环烷基、3-8元杂环基、5-7元芳基、5-7元杂芳基、-(CH2)nOR6、-(CH2)nSR6、-(CH2)nC(O)R6、-(CH2)nC(O)OR6、-(CH2)nS(O)mR6、-(CH2)nNR7R8、-(CH2)nC(O)NR7R8、-(CH2)nC(O)NHR7、-(CH2)nNR7C(O)R6或-(CH2)nNR7S(O)mR6；其中，所述烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被C1-8烷基、C1-8卤代烷基、卤素、羟基、C1-8烷氧基、C1-8卤代烷氧基、C1-8羟烷基、C3-8环烷基、3-8杂环基、5-7元芳基、5-7元杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选被6元芳基、5元杂芳基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、3-8元杂环基中的一个或多个取代基所取代；
R2为相同或不同的氢原子、C1-8烷基、C1-8卤代烷基、C1-8烷氧基、C1-8卤代烷氧基、C3-8环烷基、3-8元杂环基、C1-8羟烷基、5-7元芳基、5-7元杂芳基、-(CH2)nOR6、-(CH2)nSR6、-(CH2)nC(O)R6、-(CH2)nC(O)OR6、-(CH2)nS(O)mR6、-(CH2)nNR7R8、-(CH2)nC(O)NR7R8、-(CH2)nC(O)NHR7、-(CH2)nNR7C(O)R6或-(CH2)nNR7S(O)mR6；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选被C1-8羟烷基、C1-8烷基、C3-8环烷基、3-8元杂环基中的一个或多个取代基所取代；
R3为相同或不同的氢原子、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、卤素、氨基、硝基、羟基、氰基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR6、-(CH2)nSR6、-(CH2)nC(O)R6、-(CH2)nC(O)OR6、-(CH2)nS(O)mR6、-(CH2)nNR7R8、-(CH2)nC(O)NR7R8、-(CH2)nC(O)NHR7、-(CH2)nNR7C(O)R6或-(CH2)nNR7S(O)mR6；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9或-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R6为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9、-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R7或R8为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9、-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R9或R10为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、酯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、酯基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
x或n为0-5的整数；
m为0-2的整数。
更进一步地，上述ASK1抑制剂及其衍生物具有式III的结构：
Figure BDA0002751617330000051
其中：
R1为相同或不同的氢原子、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、卤素、C3-6环烷基、3-6元杂环基、5-6元芳基、5-6元杂芳基、-(CH2)nOR6、-(CH2)nC(O)R6、-(CH2)nS(O)mR6、-(CH2)nC(O)NR7R8、-(CH2)nNR7C(O)R6或-(CH2)nNR7S(O)mR6；其中，所述烷氧基、杂环基、芳基或杂芳基被C1-6烷基、C1-6卤代烷基、卤素、羟基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6羟烷基、C3-6环烷基、3-6杂环基、6元芳基、5元杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选被C1-6烷氧基、C1-6烷基、6元芳基、取代的5元杂芳基、3-6元杂环基中的一个或多个取代基所取代；
R4为氢原子、C1-6烷基、C1-6羟烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C3-6环烷基或3-6元杂环基，优选为氢原子或C1-6烷基；
R6为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9或-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R7或R8为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-(CH2)nOR9、-(CH2)nSR9、-(CH2)nC(O)R9、-(CH2)nC(O)OR9、-(CH2)nS(O)mR9、-(CH2)nNR9R10、-(CH2)nC(O)NR9R10、-(CH2)nC(O)NHR10、-(CH2)nNR10C(O)R9或-(CH2)nNR10S(O)mR9中的一个或多个取代基所取代；
R9或R10为氢原子、烷基、卤代烷基、羟基、氨基、酯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；其中，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基被烷基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、酯基、烷氧基、羟烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
x或n为0-5的整数；
m为0-2的整数。
再进一步地，上述ASK1抑制剂具有式IV的结构：
Figure BDA0002751617330000061
其中：
R1为相同或不同的氢原子、卤素、C1-3烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C1-3环烷基、6元杂环基或5元杂芳基；
R4为氢原子、C1-3烷基、C1-4羟烷基、C3-6环烷基或3-6元杂环基，优选为异丙基；
R5为氢原子、C1-3烷基、C1-3卤代烷基、C1-3烷氧基、C1-3卤代烷氧基、C3-6环烷基或6元杂环基，优选为甲基、甲氧基甲基、1-乙氧基乙基或四氢-2H-吡喃-4-基；
x为1-5的整数。
再进一步地，上述ASK1抑制剂具有式V的结构：
Figure BDA0002751617330000062
其中：
R1为氢原子、卤素、C1-3烷基、C1-3卤代烷基、C1-3烷氧基、C1-3卤代烷氧基、C3-6环烷基、6元杂环基或5元杂芳基，优选为甲基、甲氧基或1-吗啉基；
R4为氢原子、C1-3烷基、C1-4羟烷基、C3-6环烷基、3-6元杂环基，优选为异丙基；
R5选自氢原子、C1-3烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C3-6环烷基或6元杂环基，优选为异丙基；
x为1-5的整数。
再进一步地，在上述ASK1抑制剂的结构中，R1为C1-8烷基、C1-8烷氧基、5-7元杂芳基或卤素，优选为5-6元杂芳基、卤素、C1-3烷基或C1-3烷氧基，更优选为取代的5元杂芳基、甲基、甲氧基或吗啉基，其中所述R6为C1-6烷基；R2为C1-8烷基、C1-8烷氧基、5-7元杂芳基、C1-8羟烷基或卤素，优选为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-4羟烷基，更优选为异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基或吗啉基；R3为氢原子。
再进一步地，在上述ASK1抑制剂的结构中，M1、M2或M3为-C(R3)，其中所述R3为氢原子、C1-8烷基或C3-8环烷基，优选为氢原子。
再进一步地，在上述ASK1抑制剂的结构中，R4为氢原子、C1-8羟烷基、C1-8烷基、卤代C1-8烷基或C3-8环烷基，优选为异丙基；R5为氢原子、3-8元杂环基、C1-8烷基或C3-8环烷基，优选为环丙基。
上述ASK1抑制剂具体为以下任一化合物：
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-1)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-4-甲基苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-2)，
3-(5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-甲氧基苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-3)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-甲氧基苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-4)，
4-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-4-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)吗啉(I-5)，
4-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)吗啉(I-6)，
5-(4-环己基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑(I-7)，
5-(4-环戊基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑(I-8)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-环丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-9)，
(R)-2-(3-(3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑-5-基)-4H-1,2,4-***-4-基)丙-1-醇(I-10)，
5-(4-环丁基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑(I-11)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(甲基磺酰基)苯基)-1H-吲唑(I-12)，
3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(I-13)，
N-环丙基-3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(I-14)，
3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯甲酰胺(I-15)，
3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺(I-16)，
2-环丙基-N-(5-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)-2-甲基苯基)乙酰胺(I-17)，
4-(叔丁基)-N-(3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)苯甲酰胺(I-18)，
N-(3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(I-19)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(吡啶-3-基)苯基)-1H-吲唑(I-20)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-21)，
3-(3-(1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-22)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)苯基)-1H-吲唑(I-23)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-24)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-(甲氧基甲基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-25)，
3-(5-(1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-26)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-1H-吲唑(I-27)，
N-(3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)乙磺酰胺(I-28)，
3-(3-(3-环丙基-1H-1,2,4-***-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-29)，
3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯磺酰胺(I-30)，
N-(3-(5-(1H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)-4-(叔丁基)苯甲酰胺(I-31)，
N-(3-(5-(1H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(I-32)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-33)，
5-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)-2-甲基苯磺酰胺(I-34)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑(I-35)，
(S)-2-((3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯氧基)甲基)吗啉(I-36)，
4-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)噻吩-2-羧酰胺(I-37)。
上述ASK1抑制剂及其衍生物的制备方法为：
化合物1与化合物2，经偶联反应得到化合物I；
Figure BDA0002751617330000091
其中，环A、环B、M1、M2、M3、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、x、m、n的定义同前所述；
将相应的酸或碱的溶液加入到以上方法制备的化合物I的溶液中，成盐完全后减压除去溶剂，即得所述ASK1抑制剂的药学上可接受的盐。
本申请还公开了一种药物组合物，其包含上述ASK1抑制剂和/或其衍生物以及药学上可接受的载体，其中，所述ASK1抑制剂的药学上可接受的盐为所述ASK1抑制剂与酸或碱形成的盐，所述酸为无机酸或有机酸，具体为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸；所述碱为无机碱或有机碱，具体为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱。
所述ASK1抑制剂及其衍生物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。
上述的ASK1抑制剂及其衍生物可制备为ASK1抑制剂药物，可用于治疗和/或预防神经变性疾病、心血管疾病、炎症疾病、代谢疾病等疾病。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)该类化合物及其衍生物和药物组合物可有效抑制ASK1蛋白激酶活性，IC50均达到纳摩尔浓度级别，最优小于15nM；应用广泛，可制备为治疗和/或预防治疗神经变性疾病、心血管疾病、炎症疾病、代谢疾病等疾病的药物；所述药物在分子水平和细胞水平均可以发挥药效，并且治疗效果更优异，最优可达到纳摩尔浓度级别；
(2)化合物制备方法简便、易操作。
附图说明
图1为化合物I-22的1H-NMR谱图；
图2为化合物I-22的质谱图；
图3为化合物对HSC细胞Colla1基因mRNA表达水平影响的柱状图；
图4为化合物I-22对肠上皮细胞存活率影响的柱状图；
图5为化合物I-22对肠上皮细胞存活影响的细胞影像，其中，A为空白对照组，B为TNF-α刺激组，C为经TNF-α刺激后施用GS-4997组，D为经TNF-α刺激后施用I-22组。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
试剂与材料：薄层层析(TLC)采用薄层层析硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)，自制硅胶薄层板采用GF254硅胶(青岛海洋化工厂)，硅胶柱层析一般采用200-300目硅胶(青岛海洋化工厂)。间溴苯胺、1H-吲唑-5-羧酸甲酯、间溴苯甲酸、1,3-二溴苯、3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡啶、环丙基腈、间溴苯磺酰胺、(S)-2-(羟甲基)吗啉-4-羧酸叔丁酯、间溴苯酚、Pd(pph3)4、Pd(dppf)Cl2等有机合成原料和催化剂购买自上海毕得医药科技有限公司、上海安耐吉化学有限公司、萨恩化学技术有限公司。HTRF激酶实验试剂盒购买自Cisbio公司，ASK1(MAP3K5)蛋白购买自Carna公司，AP1-HEK293细胞试剂盒购买自BPS Bioscience公司，HT-29细胞系购买自American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA)公司。
仪器：1H-NMR采用BRUKER AVANCE-300型和BRUKER AVANCE-400型核磁共振仪(瑞士BRUKER公司)测定，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)和氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)，位移值(δ)单位为ppm；质谱MS采用Advion Mass expression CMS质谱仪；HPLC的测定采用Agilent 1260Infinity液相色谱***。
实施例1：3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物I-1)的合成
Figure BDA0002751617330000111
1、4-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-咪唑(化合物1-1)的合成
Figure BDA0002751617330000112
(1)2-((3溴苯基)氨基)-1-环丙基-1-乙酮(化合物3)的合成
间溴苯胺(3.0g,17.5mmol)用DMF溶解，加入K2CO3(2.9g,21mmol)、KI(2.9g,17.5mmol)，室温搅拌30min，加入2-溴-1-环丙基乙-1-酮(4.25g,26.2mmol)后60℃反应3h。TLC检测反应结束，反应液用水稀释，然后用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(3g,68％)。ESI-MS m/z:254.0[M+H]+.
(2)1-(3-溴苯基)-4-环丙基-1H-咪唑-2-硫醇(化合物4)的合成
2-((3-溴苯基)氨基)-1-环丙基-1-乙酮(3.0g,11.9mmol)用CH3COOH溶解，加入KSCN(2.3g,23.7mmol)，110℃反应4h。TLC检测反应结束，旋除CH3COOH后用水稀释，2M NaOH调pH至中性，用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(2.0g,58％)。ESI-MS m/z:295.0[M+H]+.
(3)1-(3-溴苯基)-4-环丙基-1H-咪唑(化合物5)的合成
1-(3-溴苯基)-4-环丙基-1H-咪唑-2-硫醇(2.0g,6.8mmol)用10mLCH3COOH溶解，加入2mL水、30％H2O2(2.5mL,20.4mmol)，55℃反应2h。TLC检测反应结束，旋除CH3COOH后用水稀释，2M NaOH调pH至中性，用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(1.2g,68％)。ESI-MS m/z:263.0[M+H]+.
(4)4-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-咪唑(化合物1-1)的合成
取1-(3-溴苯基)-4-环丙基-1H-咪唑(1.2g,4.58mmol)、联硼酸频那醇酯(1.75g,6.9mmol)、醋酸钾(670mg,6.9mmol)和Pd(dppf)Cl2(330mg,0.46mmol)，用无水Dioxane溶解，氮气抽排后100℃反应4h。TLC检测反应结束，反应液抽滤后用水稀释，EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(1.0g,71％)。ESI-MS m/z:311.2[M+H]+.
2、3-碘-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物2-1)的合成
Figure BDA0002751617330000121
(1)1H-吲唑-5-碳酰肼(化合物6)的合成
1H-吲唑-5-羧酸甲酯(5g,28.4mmol)用乙醇溶解，加入水合肼2mL，耐压管80℃反应5h；TLC检测反应结束，旋除乙醇和水合肼得白色固体目标产物(5.0g,98％)。ESI-MS m/z:177.1[M+H]+.
(2)(E)-N'-(1H-吲唑-5-羧酸)-N,N-二甲基甲酰肼酰胺(化合物7)的合成
1H-吲唑-5-碳酰肼(5g,28.4mmol)用DMF-DMA溶解，104℃回流反应4h；旋除DMF-DMA，残余物用EA溶解后制砂，硅胶柱层析分离得到目标产物(3g,46％)。ESI-MS m/z:232.1[M+H]+.
(3)5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物8)的合成
(1H-吲唑-5-羧酸)-N,N-二甲基甲酰肼酰胺(3g,13.0mmol)用CH3CN/CH3COOH 5:1溶解，加入异丙胺(5.6mL,65mmol)，90℃回流反应4h；TLC检测反应结束，旋除CH3CN和CH3COOH，残余物用水稀释候用2M NaOH调pH至弱碱性，EA萃取干燥，硅胶柱层析得目标产物(1.5g,51％)。ESI-MS m/z:228.1[M+H]+.
(4)3-碘-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物2-1)的合成
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(1.5g,6.6mmol)用DMF溶解，加入I2(3.36g,13.2mmol)、KOH(739mg,13.2mmol)，室温反应3h。TLC检测反应结束，饱和亚硫酸钠水溶液淬灭反应液，EA萃取，EA层再用饱和食盐水洗，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(1.5g,64％)。ESI-MS m/z:354.0[M+H]+.
3、3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物I-1)的合成
取4-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-咪唑(100mg,0.325mmol)、3-碘-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(110mg,0.325mmol)、四三苯基膦钯(37.6mg,0.0325mmol)和Na2CO3(69mg,0.65mmol)，用Dioxane/H2O 5:1溶解，100℃微波反应1h。TLC检测反应结束，抽滤除去不溶物，用EA洗滤饼，滤液加水稀释后用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析分离，硅胶薄层大板分离得目标产物(30mg,23％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ12.51(s,1H),8.40(s,1H),8.27(s,1H),7.96(s,2H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,1H),7.56-7.47(m,2H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),7.09(s,1H),4.53(m,1H),1.94(m,1H),1.51(d,J＝6.7Hz,6H),1.00-0.80(m,4H).ESI-MS m/z:410.2[M+H]+.
采用与实施例1相似的操作，制得下列化合物：
Figure BDA0002751617330000131
Figure BDA0002751617330000141
Figure BDA0002751617330000151
实施例2：N-环丙基-3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(I-14)的合成
Figure BDA0002751617330000152
1、N-环丙基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯甲酰胺(化合物1-2)的合成
Figure BDA0002751617330000161
(1)3-溴-N-环丙基苯甲酰胺(化合物9)的合成
取3-溴苯甲酸(500mg,2.5mmol)、HATU(1.43mmol,3.75mmol)和DIEA(806mg,6.25mmol)，用DMF溶解，室温搅拌15min后加入环丙胺(171mg,3mmol)，室温反应3h；TLC检测反应结束，反应液用水稀释，EA萃取干燥，硅胶柱层析得目标产物(400mg,67％)。ESI-MS m/z:240.0[M+H]+.
(2)N-环丙基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯甲酰胺(化合物1-2)的合成
取3-溴-N-环丙基苯甲酰胺(400mg,1.67mmol)、联硼酸频那醇酯(636mg,2.5mmol)、醋酸钾(245mg,2.5mmol)和Pd(dppf)Cl2(122.4mg,0.167mmol)，用无水Dioxane溶解，氮气抽排后100℃反应4h；TLC检测反应结束，反应液抽滤后用水稀释，EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(300mg,63％)。ESI-MS m/z:288.2[M+H]+.
2、N-环丙基-3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(I-14)的合成
取N-环丙基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯甲酰胺(100mg,0.35mmol)、3-碘-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(124mg,0.35mmol)、Pd(dppf)Cl2(25.7mg,0.035mmol)和Na2CO3(74mg,0.70mmol)，用Dioxane/H2O 5:1溶解，95℃微波反应1h；TLC检测反应结束，抽滤除去不溶物，用EA洗滤饼，滤液加水稀释后用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析分离，硅胶薄层大板分离得目标产物(40mg,30％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.61(s,1H),8.87(s,1H),8.61(d,J＝4.3Hz,1H),8.42(s,1H),8.26(s,1H),8.16(d,J＝7.9Hz,1H),7.86(d,J＝7.9Hz,1H),7.79(d,J＝8.7Hz,1H),7.68-7.57(m,2H),4.49(m,1H),2.88(m,1H),1.45(d,J＝6.7Hz,6H),0.77-0.65(m,2H),0.61-0.50(m,2H).ESI-MS m/z:387.2[M+H]+.
采用与实施例2相似的操作，制得下列化合物：
Figure BDA0002751617330000171
Figure BDA0002751617330000181
实施例3：3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物I-20)的合成
Figure BDA0002751617330000182
1、3-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡啶(化合物1-3)的合成
Figure BDA0002751617330000183
(1)3-(3-溴苯基)吡啶(化合物10)的合成
取1,3-二溴苯(343mg,1.46mmol)、3-(4，4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吡啶(300mg,1.46mmol)，Pd(pph3)4(168mg,0.146mmol)和K2CO3(404mg,2.92mmol)，用Dioxane/H2O 5:1溶解，80℃过夜反应；TLC检测反应结束，抽滤除去不溶物，EA洗滤饼，滤液加水稀释后，反应液用水稀释后EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(300mg,89％)。ESI-MS m/z:234.0[M+H]+.
(2)3-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡啶(化合物1-3)的合成
取3-(3-溴苯基)吡啶(300mg,1.29mmol)、联硼酸频那醇酯(393mg,1.55mmol)、醋酸钾(253mg,2.58mmol)和Pd(dppf)Cl2(95mg,0.129mmol)，用无水Dioxane溶解，氮气抽排后100℃反应4h；TLC检测反应结束，反应液抽滤后用水稀释，EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(300mg,83％)。ESI-MS m/z:282.2[M+H]+.
2、3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯甲酰胺(化合物I-20)的合成
取3-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)吡啶(100mg,0.36mmol)、3-碘-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(127mg,0.36mmol)、Pd(pph3)4(42mg,0.036mmol)和K2CO3(100mg,0.72mmol)，用Dioxane/H2O 5:1溶解，100℃微波反应1h。TLC检测反应结束，抽滤除去不溶物，用EA洗滤饼，滤液加水稀释后用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析分离，硅胶薄层板分离得目标产物(40mg,28％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),8.55(s,1H),8.32(s,1H),8.20(s,1H),8.09(s,1H),7.89(s,2H),7.62(d,J＝8.6Hz,1H),7.57-7.43(m,3H),7.33(s,1H),4.54-4.27(m,1H),1.42(d,J＝6.5Hz,6H).ESI-MS m/z:381.2[M+H]+.
采用与实施例3相似的操作，制得下列化合物：
Figure BDA0002751617330000191
Figure BDA0002751617330000201
实施例4：3-(3-(3-环丙基-1H-1,2,4-***-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物I-29)的合成
Figure BDA0002751617330000202
1、3-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-1,2,4-***(化合物1-4)的合成
Figure BDA0002751617330000203
(1)环丙烷碳酰亚胺乙酯(化合物11)的合成
取环丙基腈(500mg,7.5mmol)，用8M HCl/dioxane溶解，0℃条件下加入无水乙醇(343mg,7.5mmol)，0℃条件下反应2h，然后室温条件下反应12h。直接旋除乙醇和Dioxane的目标产物的盐酸盐(678mg,80％)。ESI-MS m/z:114.1[M+H]+.
(2)1-(3-溴苯基)-3-环丙基-1H-1,2,4-***(化合物12)的合成
取环丙烷碳酰亚胺乙酯盐酸盐(500mg,3.34mmol)、间溴苯肼(622mg,3.34mmol)用无水乙醇溶解，加入三乙胺(675mg,6.68mmol)，室温条件下反应30min，旋除乙醇，残余物用原甲酸三甲酯溶解，加入甲酸铵(421mg,6.68mmol)，80℃反应15h；TLC检测反应结束，反应液旋除溶剂后用水稀释，EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(500mg,57％)。ESI-MS m/z:264.0[M+H]+.
(3)3-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-1,2,4-***(1-4)的合成
取1-(3-溴苯基)-3-环丙基-1H-1,2,4-***(500mg,1.9mmol)、联硼酸频那醇酯(580mg,2.28mmol)、醋酸钾(372mg,3.8mmol)和Pd(dppf)Cl2(139mg,0.19mmol)，用无水Dioxane溶解，氮气抽排后100℃反应4h；TLC检测反应结束，反应液抽滤后用水稀释，EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析得目标产物(400mg,68％)。ESI-MS m/z:312.2[M+H]+.
2、3-(3-(3-环丙基-1H-1,2,4-***-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(化合物I-29)的合成
取3-环丙基-1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-1H-1,2,4-***(100mg,0.32mmol)、3-碘-5-(4-异丙-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(113mg,0.32mmol)、Pd(pph3)4(37mg,0.032mmol)和Na2CO3(68mg,0.64mmol)用Dioxane/H2O 5:1溶解，100℃微波反应2h；TLC检测反应结束，抽滤除去不溶物，用EA洗滤饼，滤液加水稀释后用EA萃取，EA干燥旋干，硅胶柱层析分离，硅胶薄层大板分离得目标产物(40mg,31％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.40(d,J＝23.6Hz,2H),8.13(s,2H),7.81(s,1H),7.58(s,1H),7.46(s,2H),7.19(d,J＝3.3Hz,1H),4.45-4.57(m,1H),2.05-2.11(m,1H),1.44(d,J＝6.3Hz,6H),1.14-1.22(m,2H),0.92-1.02(m,2H).ESI-MS m/z:411.2[M+H]+.
实施例5：化合物对ASK1蛋白激酶的抑制作用
采用均相时间分辨荧光(HTRF)的方法测试化合物对ASK1激酶的抑制活性，并与阳性化合物GS-4997对照。
(1)在384孔板中加入稀释后的化合物，阳性对照孔和阴性对照孔分别加入AssayBuffer稀释的DMSO；
(2)化合物孔和阳性对照孔加入STK-Substrate 3-biotin/ATP和ASK1(MAP3K5)，阴性对照孔加入STK-Substrate 3-biotin/ATP和Assay Buffer；
(3)室温孵育2.0h后加入STK S3 Antibody-Eu；
(4)室温孵育1.0h，酶标仪测定各板孔的荧光信号值，根据荧光信号值计算抑制率，IC50值通过Prism(GraphPad Software)拟合曲线算得，结果见表1。
表1化合物对ASK1激酶的抑制作用
化合物编号 <![CDATA[IC<sub>50</sub>(nM)]]> 化合物编号 <![CDATA[IC<sub>50</sub>(nM)]]>
I-1 12.6 I-21 50
I-4 48.5 I-22 29.9
I-5 31.8 I-25 26.9
GS-4997 14 I-28 19.8
I-9 50 I-29 37
I-10 16.5 I-33 18.84
如表1所示，所有测试化合物对ASK1激酶均有抑制作用，IC50值均达到纳摩尔级别；其中，化合物I-1对ASK1激酶的抑制作用最显著，IC50小于15nM，与阳性对照相当。
实施例6：化合物对AP1-HEK293细胞的抑制作用
采用AP1 Reporter-HEK293重组细胞，在细胞水平评估了化合物对ASK1下游信号通路的影响。
实验步骤：
(1)将AP1-HEK293细胞接种到96孔板中并加入100μL Thaw Medium 1；
(2)将细胞在CO2孵育器中孵育过夜；
(3)缓慢将培养基倾倒出孔板，用Assay medium将待测化合物稀释后加入到细胞孔中，加相同浓度DMSO的Assay medium稀释液至细胞孔中作为对照，另加相同浓度DMSO的Assay medium稀释液至无细胞孔中来去除本底荧光信号，孵育1h；
(4)加PMA的Assay medium稀释液至细胞孔中，加0.1％DMSO的Assay medium的稀释液至细胞孔中作为对照，另加0.1％DMSO的Assay medium的稀释液至无细胞孔中来去除本底荧光信号；
(5)根据操作规范用ONE-StepTM荧光素酶检测***进行荧光素酶检测：加ONE-StepTM荧光素酶试剂至孔中，室温摇动15min，使用光度计测量荧光信号；
(6)数据分析：扣除本底荧光值。计算每个化合物的抑制率，结果见表2。
表2化合物对AP1-HEK293细胞的抑制作用
化合物编号 <![CDATA[IC<sub>50</sub>(nM)]]> 化合物编号 <![CDATA[IC<sub>50</sub>(nM)]]>
I-2 8729 I-22 4462
I-4 11294 GS-4997 7501
I-8 5502 I-24 8333
I-9 7045 I-25 9808
I-21 12064 I-29 8877
如表2所示，所有测试化合物对AP1-HEK293细胞均有抑制作用，IC50值均达到微摩尔级别；其中，化合物I-2、I-24及I-29的IC50值与阳性对照相当，化合物I-8、I-9及I-22的IC50值优于阳性对照，以I-22的对AP1-HEK293细胞的抑制作用最显著，IC50值小于5μM，初步说明上述化合物具有良好的成药性。
实施例7：化合物对肝星状细胞(HSC)的抑制作用
通过qPCR法检测化合物对LX-2细胞Colla1 mRNA表达的影响，评估化合物在细胞水平对肝纤维化的治疗潜力。
实验步骤：(1)药物配制；(2)细胞复苏；(3)细胞培养及传代；(4)加药处理；(5)总RNA抽提；(6)RNA浓度测定；(7)cDNA合成(两步法)；(8)Real-time PCR反应。
数据处理：Real Time PCR结果的阈值由Real Time PCR detector system自动设置，通过扩增曲线及溶解曲线判断引物特异性及是否符合实验要求；根据Ct值数值确定cDNA稀释倍数是否合理；按如下方法计算Colla1基因的相对含量，结果见表3和图3。
ΔCt(TGF组Colla1基因)＝Avg.Ct(TGF组Colla1基因)-Avg.Ct(TGF组GAPDH基因)；ΔCt(对照组Colla1基因)＝Avg.Ct(对照组Colla1基因)-Avg.Ct(对照组GAPDH基因)；ΔΔCt＝ΔCt(TGF组/药物处理组Colla1基因)-ΔCt(对照组Colla1基因)的平均值；Colla1基因的相对含量计算公式：RQ＝2-ΔΔCt。
表3化合物对HSC细胞的抑制作用(3μM单一浓度抑制率)
Group <![CDATA[Average RQ<sup>1</sup>]]> <![CDATA[Abs Inhibition<sup>2</sup>(％)]]> <![CDATA[Rel Inhibition<sup>3</sup>(％)]]>
Control 1.00 / /
TGF-β 3.16 0.00 0.00
I-1 1.94 38.60 56.47
I-5 2.21 29.96 43.83
I-20 2.31 27.06 39.58
I-22 1.82 42.50 62.17
注：1：Colla1基因mRNA表达水平；2：绝对抑制率；3：相对抑制率。
如表3所示，上述化合物对HSC细胞均有抑制作用，其中化合物I-22对HSC细胞的抑制作用最显著，绝对抑制率大于40％，相对抑制率大于60％。如图3所示，实验结果用均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝2，与Control组比较，###P<0.001；与TGF-β组比较**P<0.05，*P<0.05，上述化合物对Colla1基因mRNA表达水平均与Control组合、TGF-β组存在显著差异。综上所述，上述化合物在细胞水平表现出对肝星状细胞的抑制活性，初步说明上述化合物可制备为对肝纤维化具有潜在治疗作用的药物。
实施例8：化合物对肠上皮细胞(HT-29)的作用
通过CCK-8方法检测实施例化合物I-22对TNF-α刺激的肠上皮细胞存活的影响，评估化合物在细胞水平对炎症性肠病的治疗潜力。
实验步骤：
(1)HT-29细胞被接种在96孔板，每孔10000细胞；
(2)孵育24h后，加药孔加入GS-4997(10μM)和化合物I-22(10μM)，孵育24h,加药孔和TNF-α模型孔加入TNF-α(10ng/ml)；
(3)孵育24h，每孔加入10μM CCK-8溶液后37℃条件下孵育2h；
(4)溶液吸光度在450nm下用微孔板检测仪测定，细胞存活率是相对于控制组的百分比。
如图4所示，实验结果用均值±标准误(mean±SEM)表示，n＝6，与Control组比较，###P<0.001，说明模型造模成功；与DSS组比较，**P<0.01，说明化合物I-22、GS-4997对上皮细胞存活率与DSS组具有显著差异；如图5所示，对于TNF-α刺激后下降的人结肠上皮细胞(HT-29)存活率(图5B)，化合物I-22(图5D)表现出与GS-4997(图5C)具有相当的逆转效果，说明上述化合物可制备为对炎症疾病具有潜在治疗作用的药物。

Claims (5)

1.一种ASK1抑制剂，其特征在于，所述ASK1抑制剂具有式IV的结构：
Figure FDA0004078736880000011
其中：
R1为氢原子；
R4为C1-3烷基；
R5为C1-3烷基；
x为5。
2.一种ASK1抑制剂，其特征在于，所述ASK1抑制剂具有式V的结构：
Figure FDA0004078736880000012
其中：
R1为氢原子、C1-3烷基、C1-3烷氧基；
R4为氢原子、C1-3烷基、C1-4羟烷基、C3-6环烷基；
R5选自C3-6环烷基；
x为2、5。
3.一种ASK1抑制剂，其特征在于，所述ASK1抑制剂为以下任一化合物：
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-1)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-4-甲基苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-2)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-甲氧基苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-4)，
4-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-4-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)吗啉(I-5)，
5-(4-环戊基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑(I-8)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4-环丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-9)，
(R)-2-(3-(3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-1H-吲唑-5-基)-4H-1,2,4-***-4-基)丙-1-醇(I-10)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(吡啶-3-基)苯基)-1H-吲唑(I-20)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-21)，
3-(3-(1-(1-乙氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-22)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-24)，
5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-3-(3-(1-(甲氧基甲基)-1H-吡唑-4-基)苯基)-1H-吲唑(I-25)，
N-(3-(5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑-3-基)苯基)乙磺酰胺(I-28)，3-(3-(3-环丙基-1H-1,2,4-***-1-基)苯基)-5-(4-异丙基-4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-29)，
3-(3-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(4H-1,2,4-***-3-基)-1H-吲唑(I-33)。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～3任一所述ASK1抑制剂以及药学上可接受的载体。
5.一种权利要求1～3任一所述的ASK1抑制剂在制备治疗肝纤维化、炎症性肠病药物中的应用。
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