CN112251406A - 一种nk细胞活化阶段的外泌体分选方法 - Google Patents
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Abstract
一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，它涉及生物领域。本发明要解决目前还没有技术定向分选脐带血特异性外泌体的问题。本发明采取特定刺激活化后的脐带血NK细胞时期的细胞外泌体分离，利用IL‑2使NK细胞增殖，IL‑12、IL‑15、GM‑SCF和Fit3‑L能够促进NK细胞活化，并可以诱导CD34+干细胞向NK细胞分化。并在体外培养第10d左右分选收集NK细胞，以获得更多量的NK细胞分泌的外泌体。本发明利用创新优化NK细胞因子培养法与饲养法特点，规模化提取活化后的NK细胞外泌体，并用来达到活化NK细胞的目的。本发明应用于外泌体领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法。
背景技术
病毒感染或者肿瘤发生的发病机制主要是由于机体的免疫能力无法战胜病原微生物或清除肿瘤细胞所致。人体自然杀伤细胞(NK细胞)是机体自身具有的自然杀伤性的免疫细胞，是抵御病毒感染以及清除衰老病变细胞的第一道防线，其在流感、HIV等重大病毒性传染病治疗及抗肿瘤发生过程中有明确的作用，主要免疫学特点是产生细胞因子，并通过分泌细胞因子IFN-γ等介导细胞毒活性，以及通过释放穿孔素和颗粒酶介导对靶细胞的杀伤，(Vivieret al.,2008)。NK细胞是固有免疫***中的核心细胞，约占血液中白细胞的15％，对先天免疫和适应性免疫均至关重要，在防御病毒感染中不可或缺。
NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势。首先无需预先致敏就能引起非特异性杀伤肿瘤细胞和被病毒感染细胞的淋巴细胞。其次，NK细胞不受主要组织相容性复合物(MHC)限制性开启靶细胞杀伤作用，主要是通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF-α等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，从而可避免造成严重的细胞因子风暴。同时NK细胞还可通过表面抗原与特异性抗体Fc片段结合，诱发抗体依赖的的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。因此利用NK细胞以及相关技术干预病毒感染与肿瘤疾病将有创新现有的生物治疗方式与手段。
然而在免疫力低下的患者身体内NK细胞的数量、抵抗病毒的能力也随之下降。目前在临床造血干细胞移植的过程中，NK细胞可以发挥移植物抗白血病细胞的能力，而不会引起移植物抗宿主病的发生(Ruggeri et al.,2002)。此外，NK细胞输注可以使血液肿瘤病人的病情缓解(Miller et al.,2005)。因此，目前NK细胞是进行血液肿瘤治疗的非常有前景的免疫细胞。然而，由于NK细胞应用的限制因素，临床应用方面仍然存在着一些尚未解决的问题。例如，从原代NK细胞扩增或由干细胞分化扩增获得足够数量的杀伤性较强的NK细胞是促进NK细胞临床应用及提高治疗疗效的前提(Cheng et al.,2013；Luevano et al.,2012)。其次，非特异的细胞毒性、生物安全性差、送效率低等问题，细胞制剂输注后由于体内的免疫***的作用在体内很快被清除。(人体血脑屏障，组织生理结构，免疫微环境影响造成免疫细胞无法作用到靶细胞中去，细胞之间无法接触。同时细胞免疫治疗靶向性不强)想要完全消除免疫反应的影响，唯一的方法就是使用人源性的纳米级载体。
外泌体(Exosomes)是由各种活细胞主动分泌方式通过内吞、融合、外排等一系列生物学机制产生分泌、直径约为30-200nm、在蔗糖梯度中浮力密度在1.10-1.21g/mL之间的膜性囊泡，主要为磷脂双分子层结构。Exosomes天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等。外泌体大小相对均一，呈“杯”形或“双凹碟形”，在人体体液中呈球状。
外泌体中含有一些重要的生物活性分子，如脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、信使核糖核酸(messenger ribonucleicacid,mRNA)微RNA(miRNA)等。由于外泌体特殊的生成方式，外泌体中含有的细胞质膜、核内体等蛋白质成分要比高尔基体、细胞核、线粒体等相关蛋白质成分多。外泌体还包含MHC分子；四跨膜蛋白超家族，如CD81、CD82、CD63、CD9由于外泌体具有脂质双分子层，包裹在其里面的核酸、蛋白质等生物分子能保持稳定活性，被受体细胞摄取后发挥多方面的生物学作用。其中，细胞外泌体可携带RNA、蛋白质和脂质等多种生物活性物质，在细胞通讯、免疫应答和抗原呈递等生物过程发挥着重要的作用。NK的外泌体具有与调节NK细胞功能，同时还具有较好的组织细胞相容性。易通过血脑屏障、性能稳定、易于保存和无成瘤性等优点，因此具NK细胞的全面的活化对于其发挥免疫功能的作用是非常关键的(Long et al.,2013)。研究表明，通过人体外周血获取的细胞由于个体差异，其细胞均一性存在差异，功能活性情况不稳定。而来源于肿瘤细胞的永生化工具细胞系例如NK-92细胞系，其生物安全性差，不利于后续的外泌体应用。同时外周血细胞增值效果能够影响外泌体规模化提纯与应用。
NK细胞的扩增主要有两种方式：第一种扩增方式是借助饲养细胞共培养。常用的饲养细胞系例如K562细胞，但由于K562细胞是肿瘤细胞系，存在生物安全性风险。还有一种扩增方式是利用细胞因子培养处理，但是由于其成本，以及相关分子调控紊乱可能导致NK细胞衰竭。因此，如何获取来源安全、稳定均一且活化状态的NK细胞是我们需要突破的关键技术。
脐带血是本次我们所需的NK细胞的重要来源，其优势主要在于安全、便利、扩增性强。有研究表明，GMP级别的同种异体脐带血无需饲养细胞刺激也能扩增达到临床要求的数量，如此获得的NK细胞产品无论在活性、细胞表型、纯度、无菌等方面均能达到标准。脐带血NK细胞与外周血NK细胞的表型特征存在差异：两者除了CD56、NCRs、NKG2D表达水平接近外，脐带血NK细胞的CD16、粘附分子(CD2、CD11a、CD18、CD62L)、KIRs、DNAM-1、NKG2C、IL-2R和CD57的表达水平较低，且较高水平表达抑制性受体NKG2A导致细胞毒性稍低。脐带血NK细胞容易获取、成本低，且个体间差异较小更易于标准化制备成通用型的NK细胞产品。
干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万能细胞"。其中，造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液***疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或疾病的污染。
NK细胞的发育、增殖以及活化受到多种细胞因子的调节。静息NK细胞通常不能有效杀伤靶细胞，通过细胞因子处理可以显著促进NK细胞毒活性和细胞因子分泌能力。目前，较常报道的有IL-2，IL-12，IL-15，GM-SCF等，这些细胞因子单独或组合在促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性过程中发挥重要的作用并且已应用于临床疾病治疗(Fehniger et al.,2003；Long，2007；Walzer et al.,2005；Nandagopal et al.,2014)。IL-2是一种多功能的炎性细胞因子，能够激活、诱导NK细胞增殖，是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，IL-2在激活其他淋巴细胞之前活化NK细胞，增强NK细胞的细胞毒作用，产生淋巴细胞激活的杀伤细胞、诱导CD34+干细胞向NK细胞分化。(Malek,2008；Sadlack etal.,1993；Suzuki et al.,1995；Willerford etal.,1995)。IL-12能够诱导NK细胞分泌高水平的IFN-γ(Jalah et al.,2013；Kobayashi et al.,1989)。IL-12可以活化细胞酪氨酸激酶JAK2，导致STATs的磷酸化，最终促进IFN-γ的产生及其他生物学反应。能够诱导细胞因子的产生如IFN-γ，提升外周血NK细胞的细胞毒作用，介导人类体外NK细胞成熟分化在体外能够促进NK细胞扩增，与IL-2联用能增强IL-12对NK细胞的扩增。(Hunter,2005；Kaplan et al.,1996；McIntyre et al.,1996；Trinchieri et al.,2003)。在IL-15致敏下的NK细胞会增强IL-12诱导的IFN-γ分泌。可诱导NK样细胞的分化，促进其增殖。提高其细胞毒效应，增加细胞因子的产生量。同时，IL-15的预先刺激可以使NK细胞对随后的刺激更为敏感，因此会引起免疫细胞细胞更高水平的应答(Fehniger et al.,1999；Lucas etal.,2007；Ma et al.,2006)。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前还没有技术定向分选脐带血特异性外泌体的问题，而提供一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法。
本发明一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，它是按照以下步骤进行的：
步骤一、取脐带血，离心收集脐带血细胞；
步骤二、分离血浆及细胞：700g离心15min，吸取上层淡黄色血浆于50mL离心管，向下层血细胞部分加1倍体积的生理盐水，稀释后用于分离脐带血细胞中单个核细胞；所述的脐带血细胞中单个核细胞的分离是采用密度梯度离心法进行的；
步骤三、将上一步分离的单个核细胞，通过免疫磁珠孵育并通过磁化细胞分离器进行分离，得到脐血来源的CD56+NK细胞以及脐血CD34+干细胞；
步骤四、对分离得到的脐血来源的CD56+NK细胞与脐血CD34+干细胞联合体外扩培：
1)取细胞浓度为1.0×106含脐血来源的CD56+NK细胞和脐血CD34+干细胞的NK细胞无血清培养基，加入NK细胞体外培养增效剂，再置于培养箱中，在37℃，5％的CO2条件下细胞培养1～14d；其中NK细胞体外培养增效剂与无血清培养基中细胞液的体积比为1:10；
其中，无血清培养基中脐血来源的CD56+NK细胞与脐血CD34+干细胞的数量比为4～5:1；所述的NK细胞体外培养增效剂由100ng/mL IL-2、100ng/mL IL-12、100ng/mL IL-15、50ng/mLGM-SCF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、50ng/mLfms样酪氨酸激酶3配体、10％人血清白蛋白和3％叶酸组成；
2)在培养第3d，补加NK细胞无血清培养基与NK细胞体外培养增效剂；
3)在培养第5d和第6d，分别补加NK细胞无血清培养基，调整细胞浓度至1×108个/mL；
4)在培养第7d，进行无菌检测，补加NK细胞无血清培养基，并进行细胞计数，若细胞总数在6～12×107则补加NK细胞体外培养增效剂；
5)分别在培养第9d、10d和11d，补加NK细胞无血清培养基，进行细胞计数；
6)在培养第12d，补加NK细胞无血清培养基，并进行质控检验；
7)在培养第14d，进行细胞计数；
离心收集7～14d的含有细胞混合液的培养基，用生理盐水洗涤1次，然后加入NK细胞体外培养增效剂重悬NK细胞，采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体。
进一步地，所述的采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体是通过以下方式进行：对重悬NK细胞采用两步离心去除大颗粒和细胞碎片后，过0.22μm滤膜，若样品量为50～200mL，则采用TFF进行浓缩和洗滤，然后进行上柱，洗脱后，得外泌体。
进一步地，所述的进行上柱，洗脱后，得外泌体是指：采用4mLGE公司的GESepharose Fast Flow离子交换填料进行装柱，并用8mL平衡缓冲液平衡，然后，每150mL上清液，用40mL洗涤液洗涤去除蛋白质组杂质并洗脱的缓冲液连续使用1mL洗脱缓冲液洗6次，收集，即得外泌体，并在4℃条件下进行PBS暂时储存。
进一步地，所述的NK细胞无血清培养基为X-VIVO 15培养基培养基。
进一步地，步骤二中所述的采用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞：用PBS稀释将前一步50mL离心管中稀释后的溶液定容至30mL，并且加淋巴细胞分离液，得细胞悬液；随后将其以体积比2:1的比例向细胞悬液中加入Ficoll人淋巴细胞分离液，600g，室温离心15min后无制动停转；使用胶头滴管吸取中间白膜层，并将所吸取中间的白细胞层加入另一新的50mL离心管中，细胞沉淀用20mL无钙、镁离子PBS重悬每份脐血标本后，800g，室温离心15min；吸取中间白雾状细胞层，用PBS缓冲液洗涤2次，用培养基悬浮，显微镜下计数细胞，即分离得脐血中单个核细胞。
进一步地，将细胞悬液沿管壁铺在Ficoll人淋巴细胞分离液表面。
进一步地，所述的将上一步分离的单个核细胞以磁化细胞分离器进行分离，具体为：
将分离的干细胞和NK细胞混合液在水浴中进行标记：细胞先用抗CD34和CD56单抗与抗表面抗原的单抗孵育10min，经洗涤后加入磁珠分选buffer孵育10min，洗涤后加入用CD34抗体包被的细胞板，反应10min洗涤，洗涤后加生物素标记的磁颗粒，反应8min；培养过程中以10倍体积的DPBS洗涤，3000rpm/min离心8min，得到脐血NK细胞以及脐血CD34+干细胞；所述的抗CD34单抗与生物素标记的磁颗粒的体积比为1：1，磁珠与抗CD34单抗的体积比为3mL：100μL。
进一步地，所述的洗涤后加入用抗体包被的细胞板，其中抗体为CD34美天旎公司的磁珠分选抗体。
进一步地，采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体前进行如下操作：
取1mL重悬NK细胞继续培养3d，细胞计数；加入到含有5～100IU的X-VIVO 15溶液的试验孔中，于培养箱中培养1～6h；调整细胞悬液浓度为1×107/mL，用移液枪吸取200μL细胞悬液至24孔板中培养，每隔48小时，对细胞进行换液；每7天为一个周期，对细胞进行计数和分孔，待培养的细胞生长进入对数期，显微镜观察脐血NK细胞生长情况，待到细胞密度60％-70％后，进行外泌体富集提取。
本发明包含以下有益效果：
本发明选择脐带血NK细胞与外周血NK细胞相比：
脐血来源的NK细胞比外周血来源NK细胞，细胞活性、细胞状态、后期获取的外泌体一致性、均一性要好。其材料来源的优化比NK工具细胞系(肿瘤来源)生物安全性好。同时脐血NK细胞培养中采用CD34+干细胞饲养培养法改良，构建脐血NK细胞培养体系。便于后期获取外泌体的生物安全性和功能性。尽管脐带血NK细胞对靶细胞的杀伤活性稍逊于外周血NK细胞，但脐带血NK细胞容易获取、成本低，且个体间差异较小更易于标准化制备成通用型的NK细胞产品。
由于NK细胞体外不易扩增培养，需要混入肿瘤细胞系共培养所以回输有生物安全性问题，或者传统的细胞回输有伦理、生物安全性等问题条件应用限制，所以本发明避开直接回输细胞，本发明利用细胞活化(细胞因子刺激活化处理下的状态)阶段产生的外泌体作为筛选提取目标。同时，本发明通过刺激因子组合规模化制备。
由于脐血中含有大量的非NK细胞。因此，获取得到的外泌体纯净度较低，常规的操作通过过柱纯化等操作，获得纯净度相对较高的外泌体，但是该方法复杂，成分高。本发明选择将脐血NK细胞与脐血CD34+干细胞共培养，利用CD34+干细胞的干细胞特性，辅助脐血NK细胞培养，实现了获取杂质较少的外泌体的目的。
由于不同时期的细胞会分泌不同外泌体，因为外泌体内含物包含很多生物介质及杂质，很难定向分选，目前还没有技术定向分选出特异性外泌体，本发明采取特定刺激活化后的细胞时期的细胞外泌体分离，利用IL-2使NK细胞增殖，IL-12、IL-15、GM-SCF和Fit3-L能够促进NK细胞活化，并可以诱导CD34+干细胞向NK细胞分化。并在体外培养第10d左右分选收集NK细胞，以获得更多量的NK细胞分泌的外泌体。
相比超速离心的方式，本发明的外泌体获取方法很好的保留了外泌体完整性和粒径大小；回收率约80％；样品纯度、EV Markers和靶细胞对外泌体的摄取，均可匹敌超速离心方式；节省时间(小体积85min；大规模150min)；重复性好；可放大。
本发明利用创新优化NK细胞因子培养法与饲养法特点，规模化提取活化后的NK细胞外泌体，并用来达到活化NK细胞的目的。
附图说明
图1为脐血来源的NK细胞经初步分选结果图；
图2为体外培养的NK-92细胞生长情况图；
图3为NK细胞活化状态图；左图为100μm图，右图为1000μm图；
图4为不同浓度X-VIVO 15溶液条件培养对NK细胞扩增数量的影响；其中，
为0IUX-VIVO 15溶液，
为25IU X-VIVO 15溶液，
为50IU X-VIVO 15溶液，
为75IU X-VIVO15溶液，
为100IU X-VIVO 15溶液；
图5为提取的外泌体电镜检测图；
图6为外泌体检测CD63蛋白western检测图；
图7为提取的外泌体具有的NK细胞活化作用检测图；
图8为规模化提取外泌体缩略图；
图9为外泌体体外孵育细胞功能检测图；其中，A图为外泌体加入组与未加入组队NK细胞功能影响图，B图为差异基因表达影响的机制通路图；
图10为差异基因聚类分析结果图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
本实施方式的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，是按照以下步骤进行的：
一、采集新鲜抗凝脐血20mL～40mL/份，离心收集脐带血单核细胞；
二、脐血单个核细胞分离方法：700g低速离心15min，吸取上层淡黄色血浆于50mL离心管，向下层血细胞部分加1倍体积的生理盐水，稀释后用于分离单个核细胞；
采用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞：用PBS稀释在前一步50mL离心管中稀释后的溶液，定容至30mL并且向前一步骤中稀释后的细胞液中加至淋巴细胞分离液上面，保证不破坏液体界面，随后将其以2:1的比例加入20mL左右的Ficoll人淋巴细胞分离液，将细胞悬液沿管壁小心铺在Ficoll人淋巴细胞分离液(Ficoll人淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司)表面，缓慢增加离心力，以最低的升速水平由静止逐渐增至600g室温离心15min无制动停转；使用胶头滴管吸取中间白膜层，并将所吸取中间的白细胞层加入另一新的50mL离心管中，细胞沉淀用20mL无钙、镁离子PBS重悬每份脐血标本后，800g，室温离心15min；吸取中间白雾状细胞层，用PBS缓冲液洗涤2次，用培养基悬浮，显微镜下计数细胞，即分离得脐血中单个核细胞，待用；
三、用磁场分离磁珠孵育的CD34+干细胞和CD56+NK细胞：分离的干细胞和NK细胞在水浴中进行标记，细胞先与抗表面抗原的单抗孵育10min，细胞经洗涤后加入3mL磁珠分选buffer孵育10min，洗涤后加入用抗体包被(CD56和CD34美天旎磁珠分选抗体)的细胞板，反应10min洗涤，洗涤后加生物素标记的磁颗粒(加抗CD56单抗者加100uL磁颗粒和加100uL抗CD34单抗磁颗粒)反应8min；培养过程中以10倍体积的DPBS洗涤，3000r/min离心8min，得到脐血NK细胞以及脐血CD34+干细胞；
四、对分离得到的脐血NK细胞与脐血CD34+干细胞联合体外扩培：
1)取细胞浓度为1.0×107含NK细胞无血清培养基的细胞液，置于培养瓶内，在37℃5％的CO2培养箱常规细胞培养；然后加入的NK细胞体外培养增效剂(100ng/mL IL-2、100ng/mL IL-12、100ng/mL IL-15、50ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-SCF)、50ng/mLfms样酪氨酸激酶3配体(Fit3-L)、10％人血清白蛋白和3％叶酸)，置于培养箱中，在37℃，5％CO2条件下培养；其中NK细胞体外培养增效剂与含NK细胞无血清培养基的细胞液的体积比为1:10；细胞液中脐血NK细胞与脐血CD34+干细胞的数量比为4～5:1；
2)在培养第3d，补加NK细胞无血清培养液；
3)在培养第5d和第6d，分别补加NK细胞无血清培养液至细胞浓度为1×108/mL或不超过已有NK细胞无血清培养液体积的1倍；
4)在培养第7d，进行无菌检测，补加NK细胞无血清培养液，并进行细胞计数，若细胞总数在6～12×107则补加NK细胞体外培养增效剂；
5)在培养第8d，补加NK细胞无血清培养液至细胞浓度为1×109/mL，然后转入细胞培养袋，排空气泡；
6)分别在培养第9d、10d和11d，补加NK细胞无血清培养液，进行细胞计数；
7)在培养第12d，补加NK细胞无血清培养液，并进行质控检验；
8)在培养第14d，进行细胞计数；
离心收集7～14d的含有细胞混合液的培养基，用生理盐水洗涤1次，然后加入NK细胞体外培养增效剂重悬NK细胞；采用阴离子交换层析柱的方法获得外泌体。
所述的NK细胞无血清培养液X-VIVO 15培养基培养。
通过以下实验验证本发明的有益效果：
2)主要仪器与设备
仪器和设备的具体信息，参见表1。
表1主要仪器设备
3)主要实验试剂及耗材
耗材名称与厂家名称：
(1)枪头、Eppendorf管购自美国Axygen公司；
(2)5mL移液管(Cat:4487)、10mL移液管(Cat:4488)、25mL移液管(Cat:4489)购自美国Corning公司；
(3)移液枪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
(4)T25培养瓶T75培养瓶T175培养瓶T225培养瓶购自美国Corning公司；
(5)35mm培养皿(Cat:430165)、60mm培养皿(Cat:430166)、100mm培养皿(Cat:430167)购自美国Corning公司；
(6)6孔板(Cat:3513)、12孔板(Cat:3516)、24孔板(Cat:3517)、96孔板(Cat:3519)购自美国Corning公司；
(7)冻存管(Cat:430659)购自美国Corning公司；
(8)细胞计数板购自上海静谧仪器仪表公司；
(9)流式管(Cat:352054)购自美国Becton Dickinson公司；
(10)50mL离心管(Cat:430829)、15mL离心管(Cat:430791)购自美国Corning公司；
(11)细胞培养袋购自美国Life Technology公司；
试剂名称与公司名称：
(1)人淋巴细胞分离液、无血清淋巴细胞培养液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；
(2)IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、GM-CSF抗体购自美国BioLegend公司；
(3)胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；
(4)CD34、CD56分选/活化磁珠(货号：11141D)购自Life technologies公司
(5)CBA试剂盒购自美国Becton Dickinson公司；
(6)Anti-CD56-APC、Anti-CD56-PE、Anti-CD56-FITC、Anti-CD34-PE、Anti-CD34-FITC、Anti-CD34-APC、Anti-CD16-PE购自美国Becton Dickinson/BioLegend公司；
(7)荧光标记的小鼠抗人CD34、CD56单抗，购自美国Becton Dickinson公司；
(8)山羊抗鼠IgG/HRP Santa cruz公司；
(9)1kb DNA marker、6×Loading buffer、dNTPs、RNase抑制物、DNA酶均购自NEB公司；
(10)Tween-20、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、TMED、DMSO、β-巯基乙醇(β-ME)、嘌呤霉素等均购自Sigma公司；
(11)DMEM高糖(25mM)培养基、0.25％的胰蛋白酶、Trizol、十二烷基硫酸钠(SDS)、青链霉素、甘氨酸、Tris盐酸缓冲液(含0.05％Tween 20,pH 7.4)、PBS、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、CELL COUNTING KIT-8检测试剂盒(Cat:NC9864731)购自Thermo Fisher公司与Invitrogen公司；
(12)抗人CD63抗体购自Abcam公司；
(13)抗人β-actin抗体(Cat:A5316)购自Sigma公司；
PolyA聚合酶，RNase H酶(Cat:18-021-014)，SuperScript TM First-StrandSynthesis System逆转录试剂盒(Cat:11904018)，转染用试剂Lipofectamine 2000(Cat:11668500)均购自Invitrogen公司；
(14)快速DNA胶回收试剂盒(Cat:28704)购自Qiagen公司；
(15)CD34、CD56单克隆抗体美国Bio Legend公司；
(16)非放射性细胞毒性试剂盒CytoTox 
Promega公司；
(17)X-VIVO 15培养基、AIM-V培养基#087-0112购自美国Life Technology公司
(18)RetroNectin购自TaKaRa公司；
(19)小量质粒抽提试剂盒、大量质粒抽提试剂盒购自Axygen公司；
实验方法
脐血单个核细胞分离方法
采集脐血：采集新鲜抗凝脐血20mL-40mL/份。
分离血浆及细胞：700g低速离心15min，吸取上层淡黄色血浆于50mL离心管，剩余部分加1倍体积的生理盐水用于稀释细胞方便分离单个核细胞。灭活血浆：将血浆于56℃水浴30分钟灭活，然后室温400g低速离心10min。将上层血浆转移至新的50mL离心管，置4℃冰箱保存，血浆留存备用。每次使用保存的血浆前需要低速离心处理除去沉淀。采用密度梯度离心法(Ficoll)分离脐血中单个核细胞：用PBS稀释前一步50mL离心管中的上层淡黄色血浆然后定容到30mL。把前一步骤稀释的细胞液加到淋巴细胞分离液上面，注意不要破坏液体界面。随后将其以2:1的比例加入大约20mL左右的Ficoll人淋巴细胞分离液中，最后将细胞悬液沿管壁小心铺在Ficoll分离液表面，缓慢增加离心力，以最低的升速由静止逐渐增至600g常温离心15min。离心结束后使用胶头滴管吸取中间白膜层，并将所吸取中间的白细胞层加入另一新的50mL离心管中。用20mL无钙、镁离子DPBS重悬每份脐血标本后，500g，室温离心10min时以便沉淀细胞；吸取中间白雾状细胞层，用DPBS缓冲液洗涤2次，用X-VIVO15培养基悬浮，进行细胞计数。
收集脐血中分离出的单个核细胞，转入50mL离心管中，4℃，离心收集，弃上清；PBS重悬，离心收集，弃上清；根据细胞数量用MACS缓冲液重悬，40μL/107个细胞，加入10μL/107NK细胞biotin-antibody cocktail，4℃，10min；加入MACS缓冲液30μL/107个细胞，20μL/107NK细胞microbead cocktail，4℃，15min；加入10mL-20mL MACS buffer重悬，离心收集；用1mL MACS buffer重悬，进行相应的MACS操作，将流下的细胞离心，收集(结果如图1所示)。
脐血NK细胞与饲养细胞CD34+干细胞分离方法
采用德国美天旎细胞分选磁珠NKCell Isolation Kit，NK细胞分选试剂盒是一个间接磁性标记***，用于从脐带血中分选未结合抗体的NK细胞。通过去除非NK细胞得到高纯度NK细胞。非NK细胞(即B细胞、T细胞、DCs、巨噬细胞、粒细胞和红细胞)与一系列生物素化的CD19、CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD5(Ly-1)、Gr-1(Ly-6G/C)和Ter-119抗体混合物共同孵育，再用抗生物素微珠做间接磁性标记，去除磁性标记细胞，即可分选出NK细胞。
NK细胞分选试剂盒包括一系列标记非NK细胞的生物素化抗体混合物和抗生物素微珠。MACS磁珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。磁珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。磁珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用20-30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。此外，MACS磁珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究等。
从样本中分离单个核细胞，以粘附法除去其中的单核细胞后，以尼龙棉柱法除去其中的B细胞，余下的CD34+干细胞和NK细胞以磁化细胞分离器(MACS)进行分离。
经典分析方式有两种方法分别为：阴性选择法，在反应中加入抗体，使细胞与之特异结合后形式磁性分离柱内，以除去标记的细胞，洗下的未标记细胞；阳性选择法，例如在反应中加入抗CD16及抗CD56，使NK细胞与之特异结合形成磁性免疫复合物留于柱内，将未标记细胞洗去后，将标记的NK细胞以洗液轻轻加压洗脱。具体操作方法如下：
1.将单个核细胞用含10％血清X-VIVO 15培养液调整为1×107/mL，加到无菌的塑料平皿中，37℃，5％CO2培养2h后，除去粘附于平皿的单核细胞和B细胞。
2.利用非粘附细胞与含10％血清X-VIVO 15液预孵育1h后过尼龙棉柱，B细胞和剩余的单核细胞粘附在尼龙棉柱上，用培养液洗柱，收集洗下的CD34+干细胞和NK细胞；用磁场分离CD34+干细胞和NK细胞。
3.新分离的细胞在水浴中进行标记，细胞先与抗原表位的单抗孵育10min，细胞经洗涤后与生物素标记的100uL羊抗鼠抗血清孵育10min，洗涤后加入FITC标记的链霉亲和素25uL，反应8min，洗涤后加生物素标记的磁颗粒反应8min。
4.上述每步反应后，均以10倍体积的PBS洗涤，3000r/min离心8min，以终止反应。
5.使用磁化细胞分离器(MACS)作免疫磁性分离。将标记有磁性复合物的细胞悬液重悬于2-5mL的PBS中，调整其细胞浓度为5×107～1×108细胞/mL。
6.将分离柱先与含PBS预孵育30min，4℃预冷后放入永久性磁铁的磁场中，将标记细胞悬液加80-100mL。
7.将分离柱拿出磁场，用50mL洗液在无菌条件下以注射器轻轻加压洗脱标记的细胞，离心沉淀细胞，用荧光显微镜分析存活率，以X-VIVO 15液保存。
注意事项：NK细胞为CD16+、CD56+细胞。若反应中加入了抗CD3单抗，则洗脱的未标记细胞为NK细胞；反应中加入了抗CD16、抗CD56单抗，则柱中保留的标记细胞为NK细胞。前一种方法为阴性选择法，后一种方法为阳性选择法。
脐血NK细胞体外扩增培养
培养第一天：取约1.0×107细胞液加入试剂盒中需要配制的NK细胞无血清培养液50mL(NK细胞培养液：淋巴细胞无血清培养液+淋巴细胞培养液添加剂。配置浓度按照起始培养液按5％，其余培养液按1-2％添加)然后在T175培养瓶中加入NK细胞体外培养增效剂置于培养箱中培养(37℃，5％CO2浓度)。NK细胞体外培养增效剂是该试剂盒中的核心试剂(100ng/mL IL-2、100ng/mL IL-12、100ng/mL IL-15、50ng/mL GM-SCF、50ng/mL Fit3-L、10％人血清白蛋白和3％叶酸)。根据需要培养的细胞数目每1×107细胞需要50mL。使用前从液氮或-80℃冰箱中取出，立即放置37-40℃水浴箱速溶，然后1200rpm离心5min，弃上清，用生理盐水把沉淀洗涤2次，然后用3mLNK细胞培养液轻轻悬浮备用即可。可以根据实际情况需要的NK细胞总数进行选择。
第3天补液：补加配制好的NK细胞培养液约50mL。
第5天补液：补加NK细胞培养液约50mL，补加培养液的量不宜超过已有体积的1倍，或将细胞浓度调整为1×107/mL。
第6天补液：补加NK细胞培养液约50mL。
第7天补液并补加NK细胞体外培养增效剂，同时进行无菌检测：补加NK细胞培养液约50mL，细胞计数，当细胞总数大于1×108时补加NK细胞体外培养增效剂；如果细胞总数在6-12×107时，则延长至第8天补加。做第一次无菌检测。
第8天补液并进行转袋：补加NK细胞培养液约200mL。转入细胞培养袋。
第9、10、11天补液：每天补加NK细胞培养液约150mL。
第12天补液并进行质控检验：补加NK细胞培养液350mL。
质控检验：全面质控检验，各项指标合格方可继续培养。
第12天NK细胞质控标准如下：
第14天收集细胞：细胞计数，离心收集需要量的NK细胞，用生理盐水洗涤1次。用300mL生理盐水(细胞浓度不要超过2×109/mL，再添加10％人白蛋白)。
留样并进行质控检验：细胞收集后，取2份样品，一份进行产品放行检测，另一份作为留样4℃保留半年，供跟踪检验。
第14天NK细胞放行检验。(培养结果如图2所示)
脐血NK细胞体外激活培养与活性状态阶段外泌体提取
取1mL新鲜完全培养基重悬沉淀，继续培养1d、2d、3d(如图3所示)，细胞计数；从X-VIVO 15溶液中选择合适的浓度(如图4所示，在100IU的X-VIVO 15溶液下最优)，加入培养皿中，于培养箱中分别培养1d、3d、4d、5d、10d……考察最佳培养时间，如图4所示，在4d后培养效果更佳。
1)调整细胞悬液浓度为1×107/mL，用移液枪吸取200uL细胞悬液至24孔板中；
3)每隔48小时，对细胞进行换X-VIVO 15溶液；
4)每7天为一个周期，对细胞进行计数，用以再次刺激细胞；
5)根据细胞增殖的实际情况，相应地分孔或扩大培养体系。
6)细胞生长进入对数期，收集细胞用于后续实验。
显微镜观察脐血NK细胞生长情况，待到细胞密度达到60％-70％后，可以进行外泌体富集提取(提取缩略图如图8所示)。
富集提取采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体是通过以下方式进行：对重悬NK细胞采用两步离心去除大颗粒和细胞碎片后，过0.22μm滤膜，若样品量为50～200mL，则采用TFF进行浓缩和洗滤，然后进行上柱，洗脱后，得外泌体(如图5所示)。并对外泌体检测CD63蛋白western检测如图6所示。
所述的进行上柱，洗脱后，得外泌体采用4mLGE公司的GE Q-Sepharose Fast Flow离子交换填料进行装柱，并用GE Health Care Life Science，8mL平衡缓冲液平衡，然后，每150mL上清液，用40mL洗涤液洗涤去除蛋白质组杂质并洗脱的缓冲液连续使用1mL洗脱缓冲液洗6次，收集，即得外泌体，并在4℃条件下进行PBS暂时储存。
提取后的外泌体功能验证与分析
首先设置NK细胞体外验证组，细胞数量为1×104将收集分离出的外泌体分别以不同浓度(0IU、25IU、75IU)分别加入NK细胞基础培养基中，在共孵育7天后对NK细胞表面活性受体NKG2D表达进行检测(如图7所示，发现不同浓度外泌体与NK细胞共孵育的效果，能够活化NK细胞活性受体)。发现高浓度的外泌体活化作用更为明显。结果如图9和10所示。
Claims (9)
1.一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
步骤一、取脐带血，离心收集脐带血细胞；
步骤二、分离血浆及细胞：700g离心15min，吸取上层淡黄色血浆于50mL离心管，向下层血细胞部分加1倍体积的生理盐水，稀释后用于分离脐带血细胞中单个核细胞；所述的脐带血细胞中单个核细胞的分离是采用密度梯度离心法进行的；
步骤三、将上一步分离的单个核细胞，通过免疫磁珠孵育并通过磁化细胞分离器进行分离，得到脐血来源的CD56+NK细胞以及脐血CD34+干细胞；
步骤四、对分离得到的脐血来源的CD56+NK细胞与脐血CD34+干细胞联合体外扩培：
1)取细胞浓度为1.0×106含脐血来源的CD56+NK细胞和脐血CD34+干细胞的NK细胞无血清培养基，加入NK细胞体外培养增效剂，再置于培养箱中，在37℃，5％的CO2条件下细胞培养1～14d；其中NK细胞体外培养增效剂与无血清培养基中细胞液的体积比为1:10；
其中，无血清培养基中脐血来源的CD56+NK细胞与脐血CD34+干细胞的数量比为4～5:1；所述的NK细胞体外培养增效剂由100ng/mL IL-2、100ng/mL IL-12、100ng/mL IL-15、50ng/mLGM-SCF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、50ng/mLfms样酪氨酸激酶3配体、10％人血清白蛋白和3％叶酸组成；
2)在培养第3d，补加NK细胞无血清培养基与NK细胞体外培养增效剂；
3)在培养第5d和第6d，分别补加NK细胞无血清培养基，调整细胞浓度至1×108个/mL；
4)在培养第7d，进行无菌检测，补加NK细胞无血清培养基，并进行细胞计数，若细胞总数在6～12×107则补加NK细胞体外培养增效剂；
5)分别在培养第9d、10d和11d，补加NK细胞无血清培养基，进行细胞计数；
6)在培养第12d，补加NK细胞无血清培养基，并进行质控检验；
7)在培养第14d，进行细胞计数；
离心收集7～14d的含有细胞混合液的培养基，用生理盐水洗涤1次，然后加入NK细胞体外培养增效剂重悬NK细胞，采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于所述的采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体是通过以下方式进行：对重悬NK细胞采用两步离心去除大颗粒和细胞碎片后，过0.22μm滤膜，若样品量为50～200mL，则进行浓缩和洗滤，然后进行上柱，洗脱后，获得外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于所述的进行上柱，洗脱后，获得外泌体是指：采用4mL GE Sepharose Fast Flow离子交换填料进行装柱，并用8mL平衡缓冲液平衡，然后，每150mL上清液，用40mL洗涤液洗涤去除蛋白质组杂质并洗脱的缓冲液连续使用1mL洗脱缓冲液洗6次，并进行收集，即获得外泌体，并在4℃条件下进行PBS暂时储存。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于所述的NK细胞无血清培养基为X-VIVO 15培养基。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于步骤二中所述的采用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞：用PBS稀释将前一步50mL离心管中稀释后的溶液定容至30mL，并且加淋巴细胞分离液，得细胞悬液；随后将其以体积比2:1的比例向细胞悬液中加入Ficoll人淋巴细胞分离液，600g室温离心15min后无制动停转；使用胶头滴管吸取中间白膜层，并将所吸取中间的白细胞层加入另一新的50mL离心管中，细胞沉淀用20mL无钙、镁离子PBS重悬每份脐血标本后，800g室温离心15min；吸取中间白雾状细胞层，用PBS缓冲液洗涤2次，用培养基悬浮，显微镜下计数细胞，即分离得脐血中单个核细胞。
6.根据权利要求5所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于将细胞悬液沿管壁铺在Ficoll人淋巴细胞分离液表面。
7.根据权利要求1所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于所述的将上一步分离的单个核细胞以磁化细胞分离器进行分离，具体为：
将分离的干细胞和NK细胞混合液在水浴中进行标记：细胞先用抗CD34和CD56单抗与表面抗原的单抗孵育10min，经洗涤后加入磁珠分选buffer孵育10min，洗涤后加入用CD34抗体包被的细胞板，反应10min洗涤，洗涤后加生物素标记的磁颗粒，反应8min；培养过程中以10倍体积的DPBS洗涤，3000r/min离心8min，得到脐血NK细胞以及脐血CD34+干细胞；所述的抗CD34单抗与生物素标记的磁颗粒的体积比为1：1，磁珠与抗CD34单抗的体积比为3mL：100μL。
8.根据权利要求7所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于所述的洗涤后加入用抗体包被的细胞板，其中抗体为CD34和CD56美天旎公司的磁珠分选抗体。
9.根据权利要求1所述的一种NK细胞活化阶段的外泌体分选方法，其特征在于采用阴离子交换层析柱的方法获得所述的外泌体前进行如下操作：
取1mL重悬NK细胞继续培养3d，细胞计数；加入到含有5～100IU的X-VIVO 15溶液的培养袋或培养皿中，于培养箱中培养1～6h；调整细胞悬液浓度为1×107/mL，用移液枪吸取200μL细胞悬液至24孔板中培养，每隔48小时，对细胞进行换液；每2天为一个周期，对细胞进行计数和分孔，显微镜观察脐血NK细胞生长情况，待培养的细胞生长进入对数期，细胞产生成团趋势时，进行外泌体富集提取。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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