CN112237139A - 一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:1)铁皮石斛种子处理,2)铁皮石斛种子物理诱变处理,3)消毒液配制,4)诱变种子的消毒,5)培养基Ⅰ的配制,6)诱变种子培养,7)培养基Ⅱ的配制,8)幼胚培养,9)培养基Ⅲ的配制,10)变异植株繁殖扩增,11)生根培养基的配制,12)生根植株的培养,13)变异植株的栽植。获得叶色发生变异的铁皮石斛种苗,变异率为5%,且变异稳定,缩短新品种创造时间,为突变机理研究提供了丰富的材料,具有诱变效率高,操作方便的特点,为提高铁皮石斛种苗变异率,促进高效生物育种,提供可靠技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种领域,特别是涉及一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法。
背景技术
安全、高效的生物品种改造及高通量筛选/选择技术,是生命科学及生命产业技术创新的重要方向,也是生物化工学科创新发展的动力。基于基因组突变的高效生物育种方法是生物技术领域的热点和前沿,不仅可以成为生物诱变育种的平台,而且也可与理性设计结合,为智慧集成生物育种技术发展提供支撑。
常压室温等离子体(ARTP)诱导技术是一种新型诱变技术,具有活性粒子种类多、操作可控性强、诱变速度快、操作条件温和、安全性高等特点。现有技术中尚未找到适宜的铁皮石斛种子诱变方法,致使铁皮石斛的生物育种受到限制。因此有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提供一种能提高铁皮石斛种子变异率的复合诱变方法。
本发明利用物理诱变,结合常压室温等离子体(ARTP)诱导技术,对铁皮石斛种子进行诱变,以显著提高铁皮石斛种子变异率,对铁皮石斛种子进行高效生物育种。
本发明通过下列技术方案实现:一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:
1)铁皮石斛种子处理,于无菌条件下,将铁皮石斛已裂开的果荚装入无菌离心管中,冰箱4℃保存;未裂开的果荚用锡纸包裹,冰箱4℃保存;
2)铁皮石斛种子物理诱变处理,将步骤1)的铁皮石斛果荚于无菌操作台上,用手术刀破除未裂开的果荚,把所有种子放入盘中,将盘固定到诱变育种仪中,调整诱变育种仪的氦气压力为0.15-0.20MPa、功率为360W,进行诱变处理3-7分钟,得诱变种子;
3)消毒液配制,将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中,至质量浓度为0.2%,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min,得消毒液;
4)诱变种子的消毒,将步骤2)的诱变种子取出,放入经高压灭菌处理过的纱布袋中,置入质量浓度为70%的酒精中浸泡1-2min、用无菌水洗涤2-4次;用质量浓度为0.1%的升汞灭菌6-10min、用无菌水洗涤2-4次;用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡6-10min,用无菌水洗涤2-4次;用步骤3)的消毒液浸泡1-2min,取出,于无菌操作台上,用无菌吸水纸吸干,得消毒后的诱变种子;
5)培养基Ⅰ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.05mg/l + 6-BA 0.1mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅰ;
6)诱变种子培养,将步骤4)消毒后的诱变种子放在步骤5)的培养基Ⅰ中,暗培养至种子萌发后,转入1000lux弱光下,培养25-35天,得到幼胚;
7)培养基Ⅱ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅱ;
8)幼胚培养,将步骤6)的幼胚放在步骤7)的培养基Ⅱ中,在23-27℃、1000lux的无菌环境下培养60-90天,叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,得变异植株;
9)培养基Ⅲ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅲ;
10)变异植株繁殖扩增,将步骤8)的变异植株放在步骤9)的培养基Ⅲ中,在22-27℃、2000lux的无菌环境下培养42-46天,使变异植株繁殖扩增;
11)生根培养基的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.5mg/l +IBA 0.3mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得生根培养基;
12)生根植株的培养,将步骤10)繁殖扩增的变异植株移至步骤11)的生根培养基中,在22-26℃、2000lux的无菌环境下培养23-32天,得生根植株;
13)变异植株的栽植,步骤12)的生根植株的根长至3-5cm时,将植株连同培养基一同移至正常日光下过渡18-22天,之后取出,用清水清洗掉植株上的培养基后,移植至经清水泡发的格陆谷椰糠上,于26-30℃,80%湿度下进行栽植,110-130天后长出新根新芽,得变异苗,并以新芽的叶色变异作为最终的变异率进行统计。
所述步骤2)的诱变育种仪为洛阳清华天木生物科技有限公司 ARTP-P型诱导仪。
所述步骤8)以叶色发生变化来识别变异情况,具体是:叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,即可认定是变异植株。
本发明具备的优点及效果:本发明通过常压室温等离子体(ARTP)诱变,获得叶色发生变异的铁皮石斛种苗,变异率为5%,而使用常规化学诱变的变异率仅为2%左右,且变异稳定,缩短新品种创造的时间,同时也为突变机理研究提供了丰富的材料,具有诱变效率高,操作方便的特点,为提高铁皮石斛种苗变异率,促进高效生物育种,提供可靠技术支持。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:
1)铁皮石斛种子处理,于无菌条件下,将铁皮石斛已裂开的果荚装入无菌离心管中,冰箱4℃保存;未裂开的果荚用锡纸包裹,冰箱4℃保存;
2)铁皮石斛种子物理诱变处理,将步骤1)的铁皮石斛果荚于无菌操作台上,用手术刀破除未裂开的果荚,把所有种子放入盘中,将盘固定到诱变育种仪中,调整诱变育种仪的氦气压力为0.15MPa、功率为360W,进行诱变处理7分钟,得诱变种子;
3)消毒液配制,将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中,至质量浓度为0.2%,于110℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌30min,得消毒液;
4)诱变种子的消毒,将步骤2)的诱变种子取出,放入经高压灭菌处理过的纱布袋中,置入质量浓度为70%的酒精中浸泡1min、用无菌水洗涤2次;用质量浓度为0.1%的升汞灭菌6min、用无菌水洗涤2次;用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡6min,用无菌水洗涤2次;用步骤3)的消毒液浸泡1min,取出,于无菌操作台上,用无菌吸水纸吸干,得消毒后的诱变种子;
5)培养基Ⅰ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.05mg/l + 6-BA 0.1mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌30min后,冷却至室温,得培养基Ⅰ;
6)诱变种子培养,将步骤4)消毒后的诱变种子放在步骤5)的培养基Ⅰ中,暗培养至种子萌发后,转入1000lux弱光下,培养25天,得到幼胚;
7)培养基Ⅱ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌30min后,冷却至室温,得培养基Ⅱ;
8)幼胚培养,将步骤6)的幼胚放在步骤7)的培养基Ⅱ中,在23℃、1000lux的无菌环境下培养90天,叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,得变异植株;
9)培养基Ⅲ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌30min后,冷却至室温,得培养基Ⅲ;
10)变异植株繁殖扩增,将步骤8)的变异植株放在步骤9)的培养基Ⅲ中,在22℃、2000lux的无菌环境下培养46天,使变异植株繁殖扩增;
11)生根培养基的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.5mg/l +IBA 0.3mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌30min后,冷却至室温,得生根培养基;
12)生根植株的培养,将步骤10)繁殖扩增的变异植株移至步骤11)的生根培养基中,在22℃、2000lux的无菌环境下培养32天,得生根植株;
13)变异植株的栽植,步骤12)的生根植株的根长至3cm时,将植株连同培养基一同移至正常日光下过渡18天,之后取出,用清水清洗掉植株上的培养基后,移植至经清水泡发的格陆谷椰糠上,于26℃,80%湿度下进行栽植,110天后长出新根新芽,得变异苗,并以新芽的叶色变异作为最终的变异率进行统计,其变异率为5%。
实施例2
一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:
1)铁皮石斛种子处理,于无菌条件下,将铁皮石斛已裂开的果荚装入无菌离心管中,冰箱4℃保存;未裂开的果荚用锡纸包裹,冰箱4℃保存;
2)铁皮石斛种子物理诱变处理,将步骤1)的铁皮石斛果荚于无菌操作台上,用手术刀破除未裂开的果荚,把所有种子放入盘中,将盘固定到诱变育种仪中,调整诱变育种仪的氦气压力为0.20MPa、功率为360W,进行诱变处理3分钟,得诱变种子;
3)消毒液配制,将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中,至质量浓度为0.2%,于125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20min,得消毒液;
4)诱变种子的消毒,将步骤2)的诱变种子取出,放入经高压灭菌处理过的纱布袋中,置入质量浓度为70%的酒精中浸泡2min、用无菌水洗涤4次;用质量浓度为0.1%的升汞灭菌10min、用无菌水洗涤4次;用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡10min,用无菌水洗涤4次;用步骤3)的消毒液浸泡2min,取出,于无菌操作台上,用无菌吸水纸吸干,得消毒后的诱变种子;
5)培养基Ⅰ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.05mg/l + 6-BA 0.1mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20min后,冷却至室温,得培养基Ⅰ;
6)诱变种子培养,将步骤4)消毒后的诱变种子放在步骤5)的培养基Ⅰ中,暗培养至种子萌发后,转入1000lux弱光下,培养35天,得到幼胚;
7)培养基Ⅱ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20min后,冷却至室温,得培养基Ⅱ;
8)幼胚培养,将步骤6)的幼胚放在步骤7)的培养基Ⅱ中,在27℃、1000lux的无菌环境下培养60天,叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,得变异植株;
9)培养基Ⅲ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20min后,冷却至室温,得培养基Ⅲ;
10)变异植株繁殖扩增,将步骤8)的变异植株放在步骤9)的培养基Ⅲ中,在27℃、2000lux的无菌环境下培养42天,使变异植株繁殖扩增;
11)生根培养基的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.5mg/l +IBA 0.3mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20min后,冷却至室温,得生根培养基;
12)生根植株的培养,将步骤10)繁殖扩增的变异植株移至步骤11)的生根培养基中,在26℃、2000lux的无菌环境下培养23天,得生根植株;
13)变异植株的栽植,步骤12)的生根植株的根长至5cm时,将植株连同培养基一同移至正常日光下过渡22天,之后取出,用清水清洗掉植株上的培养基后,移植至经清水泡发的格陆谷椰糠上,于30℃,80%湿度下进行栽植,110天后长出新根新芽,得变异苗,并以新芽的叶色变异作为最终的变异率进行统计,其变异率为5.1%。
实施例3
一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:
1)铁皮石斛种子处理,于无菌条件下,将铁皮石斛已裂开的果荚装入无菌离心管中,冰箱4℃保存;未裂开的果荚用锡纸包裹,冰箱4℃保存;
2)铁皮石斛种子物理诱变处理,将步骤1)的铁皮石斛果荚于无菌操作台上,用手术刀破除未裂开的果荚,把所有种子放入盘中,将盘固定到诱变育种仪中,调整诱变育种仪的氦气压力为0.18MPa、功率为360W,进行诱变处理5分钟,得诱变种子;
3)消毒液配制,将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中,至质量浓度为0.2%,于120℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌25min,得消毒液;
4)诱变种子的消毒,将步骤2)的诱变种子取出,放入经高压灭菌处理过的纱布袋中,置入质量浓度为70%的酒精中浸泡2min、用无菌水洗涤3次;用质量浓度为0.1%的升汞灭菌8min、用无菌水洗涤3次;用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡8min,用无菌水洗涤3次;用步骤3)的消毒液浸泡1min,取出,于无菌操作台上,用无菌吸水纸吸干,得消毒后的诱变种子;
5)培养基Ⅰ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.05mg/l + 6-BA 0.1mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于120℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌25min后,冷却至室温,得培养基Ⅰ;
6)诱变种子培养,将步骤4)消毒后的诱变种子放在步骤5)的培养基Ⅰ中,暗培养至种子萌发后,转入1000lux弱光下,培养30天,得到幼胚;
7)培养基Ⅱ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于120℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌25min后,冷却至室温,得培养基Ⅱ;
8)幼胚培养,将步骤6)的幼胚放在步骤7)的培养基Ⅱ中,在25℃、1000lux的无菌环境下培养70天,叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,得变异植株;
9)培养基Ⅲ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于120℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌25min后,冷却至室温,得培养基Ⅲ;
10)变异植株繁殖扩增,将步骤8)的变异植株放在步骤9)的培养基Ⅲ中,在25℃、2000lux的无菌环境下培养45天,使变异植株繁殖扩增;
11)生根培养基的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.5mg/l +IBA 0.3mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于120℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌25min后,冷却至室温,得生根培养基;
12)生根植株的培养,将步骤10)繁殖扩增的变异植株移至步骤11)的生根培养基中,在24℃、2000lux的无菌环境下培养26天,得生根植株;
13)变异植株的栽植,步骤12)的生根植株的根长至4cm时,将植株连同培养基一同移至正常日光下过渡20天,之后取出,用清水清洗掉植株上的培养基后,移植至经清水泡发的格陆谷椰糠上,于28℃,80%湿度下进行栽植,120天后长出新根新芽,得变异苗,并以新芽的叶色变异作为最终的变异率进行统计,其变异率为5.3。
Claims (1)
1.一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法,其特征在于包括下列步骤:
1)铁皮石斛种子处理,于无菌条件下,将铁皮石斛已裂开的果荚装入无菌离心管中,冰箱4℃保存;未裂开的果荚用锡纸包裹,冰箱4℃保存;
2)铁皮石斛种子物理诱变处理,将步骤1)的铁皮石斛果荚于无菌操作台上,用手术刀破除未裂开的果荚,把所有种子放入盘中,将盘固定到诱变育种仪中,调整诱变育种仪的氦气压力为0.15-0.20MPa、功率为360W,进行诱变处理3-7分钟,得诱变种子;
3)消毒液配制,将优洁1003消毒液加入到无菌蒸馏水中,至质量浓度为0.2%,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min,得消毒液;
4)诱变种子的消毒,将步骤2)的诱变种子取出,放入经高压灭菌处理过的纱布袋中,置入质量浓度为70%的酒精中浸泡1-2min、用无菌水洗涤2-4次;用质量浓度为0.1%的升汞灭菌6-10min、用无菌水洗涤2-4次;用质量浓度为10%的次氯酸钠浸泡6-10min,用无菌水洗涤2-4次;用步骤3)的消毒液浸泡1-2min,取出,于无菌操作台上,用无菌吸水纸吸干,得消毒后的诱变种子;
5)培养基Ⅰ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.05mg/l + 6-BA 0.1mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅰ;
6)诱变种子培养,将步骤4)消毒后的诱变种子放在步骤5)的培养基Ⅰ中,暗培养至种子萌发后,转入1000lux弱光下,培养25-35天,得到幼胚;
7)培养基Ⅱ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅱ;
8)幼胚培养,将步骤6)的幼胚放在步骤7)的培养基Ⅱ中,在23-27℃、1000lux的无菌环境下培养60-90天,叶色白化、并在叶片边缘或叶片上出现白色、黄色或其他颜色条纹,得变异植株;
9)培养基Ⅲ的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.02mg/l+6-BA 0.5mg/l+香蕉泥 50g/l+马铃薯泥25g/l+白糖 30g/l+琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得培养基Ⅲ;
10)变异植株繁殖扩增,将步骤8)的变异植株放在步骤9)的培养基Ⅲ中,在22-27℃、2000lux的无菌环境下培养42-46天,使变异植株繁殖扩增;
11)生根培养基的配制,将下列培养基:MS + NAA 0.5mg/l +IBA 0.3mg/l +香蕉泥50g/l +马铃薯泥25g/l +白糖 30g/l +琼脂 7g/l,于110-125℃、0.1Mpa条件下,高压灭菌20-30min后,冷却至室温,得生根培养基;
12)生根植株的培养,将步骤10)繁殖扩增的变异植株移至步骤11)的生根培养基中,在22-26℃、2000lux的无菌环境下培养23-32天,得生根植株;
13)变异植株的栽植,步骤12)的生根植株的根长至3-5cm时,将植株连同培养基一同移至正常日光下过渡18-22天,之后取出,用清水清洗掉植株上的培养基后,移植至经清水泡发的格陆谷椰糠上,于26-30℃,80%湿度下进行栽植,110-130天后长出新根新芽,得变异苗,并以新芽的叶色变异作为最终的变异率进行统计。
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