CN112806262A - 一种盐桦组织培养高效繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐桦组织培养高效繁殖方法。本发明以盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，通过外植体的消毒和不定芽诱导、不定芽继代增殖、壮苗培养、生根培养、试管苗移栽等等阶段，利用独特的培养基和培养方式，增殖倍数高达30以上，能在短期内获得大量的试管苗，有利于盐桦种质资源的保护和可持续利用。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。

Description

一种盐桦组织培养高效繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种盐桦组织培养高效繁殖方法。
背景技术：
盐桦(Betula halophile)是桦木科桦木属的多年生落叶小乔木或灌木，仅原生于新疆阿勒泰县，1999年分别被列为国家二级重点保护植物。2012年被列为国家极小种群野生植物。由于难以获得种子，扦插繁殖成活率低，利用植物组织培养技术能对其进行规模化繁殖。包括丛生芽再生体系和愈伤组织再生体系研究，但利用丛生芽再生体系能较好地保持母株的优良性状，变异小。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种盐桦组织培养高效繁殖方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种盐桦组织培养高效繁殖方法，包括以下步骤：
a.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，经消毒处理后，接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，培养形成不定芽；所述的不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量，其余为B5基本培养基(Gamborg et al,1968)，pH 5.8-6.0；
b.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天；所述的不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；
c.壮苗培养：将高2～3厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天；所述的壮苗培养基每升含有：IBA 0.5-1.5毫克、多效唑PP3330.5-1.0毫克、蔗糖30-45克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；
d.生根培养：当芽高3～4厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天，得到生根试管苗；所述的生根培养基每升含有：萘乙酸0.3-0.5毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量(琼脂6克)，其余为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
e.试管苗移栽：当生根试管苗长至4～6厘米高时，在自然光照下炼苗7-10天，然后洗掉根部培养基，栽入栽培基质中培养，由此得到盐桦种苗。
所述的步骤b.不定芽继代增殖具体为：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天。
所述的消毒处理具体为先在体积分数75％酒精中浸泡10-30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液连接消毒若干次，每次消毒后用无菌水冲洗4-6次。
所述的用质量分数0.1％升汞溶液连接消毒若干次具体为：用质量分数0.1％升汞溶液连续消毒3次，第一次消毒时间为4-6分钟，第二次消毒时间为3-5分钟，第三次消毒时间为1-3分钟。
所述的栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述的泥炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为(2-4):(1-3):1。
MS、B5培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)；所述的1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素浓度减半，而其他成分浓度不变而形成的培养基。
本发明以盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，通过外植体的消毒和不定芽诱导、不定芽继代增殖、壮苗培养、生根培养、试管苗移栽等等阶段，利用独特的培养基和培养方式，增殖倍数高达30以上，能在短期内获得大量的试管苗，有利于盐桦种质资源的保护和可持续利用。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取生长旺盛优良的盐桦(Betulahalophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，采用体积分数75％酒精浸润的棉花擦拭后，在体积分数75％酒精中浸泡10秒后，用质量分数0.1％升汞溶液消毒4分钟，无菌水冲洗4次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒3分钟，无菌水冲洗4次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒1分钟，无菌水冲洗4次，然后将消毒的外植体接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度24℃，光照度1500lx，光照16小时/天。培养30天时有不定芽形成，不定芽发生率75％，消毒成功率70％。不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)0.5毫克、萘乙酸(NAA)0.1毫克、蔗糖20克、琼脂6克，其余为B5基本培养基，pH 5.8。
2.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24℃，光照度1500lx，光照16小时/天。30天为1个继代增殖周期。连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度24℃，光照度1500lx，光照16小时/天，1个月内增殖倍数为28倍。不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)0.5毫克、蔗糖20克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 5.8。
3.壮苗培养：由于上述培养基上产生的芽较细弱，需要进行壮苗培养。将高约2厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度24℃，光照度1800lx，光照16小时/天。形成的试管苗较粗，能应用于生根培养。壮苗培养基每升含有：IBA 0.5毫克、多效唑PP333 0.5毫克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 5.8。
4.生根培养：当芽高约3厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度24℃，光照度1800lx，光照16小时/天，得到生根试管苗。能正常生根，培养30天时生根率可达100％。生根培养基每升含有：萘乙酸(NAA)0.3毫克、蔗糖20克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8。
5.试管苗移栽：当生根试管苗长至4厘米高时，在自然光照下炼苗7天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土、珍珠岩和蛭石体积比为2:1:1的混合基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，由此得到盐桦种苗，成活率可达80％。
实施例2
1.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取生长旺盛优良的盐桦(Betulahalophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，采用体积分数75％酒精浸润的棉花擦拭后，在体积分数75％酒精中浸泡20秒后，用质量分数0.1％升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗5次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒4分钟，无菌水冲洗5次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒2分钟，无菌水冲洗5次，然后将消毒的外植体接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天。培养30天时有不定芽形成，不定芽发生率78％，消毒成功率75％。不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)0.7毫克、萘乙酸(NAA)0.2毫克、蔗糖25克、琼脂6克，其余为B5基本培养基，pH 5.9。
2.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天。30天为1个继代增殖周期。连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，1个月内增殖倍数为30倍。不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)0.7毫克、蔗糖25克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 5.9。
3.壮苗培养：由于上述培养基上产生的芽较细弱，需要进行壮苗培养。将高约2.5厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度26℃，光照度2000lx，光照14小时/天。形成的试管苗较粗，能应用于生根培养。壮苗培养基每升含有：IBA 1.0毫克、多效唑PP333 0.7毫克、蔗糖40克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 5.9。
4.生根培养：当芽高约3.5厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度26℃，光照度2000lx，光照14小时/天，得到生根试管苗。能正常生根，培养30天时生根率可达100％。生根培养基每升含有：萘乙酸(NAA)0.4毫克、蔗糖25克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9。
5.试管苗移栽：当生根试管苗长至5厘米高时，在自然光照下炼苗8天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土、珍珠岩和蛭石体积比为3:2:1的混合基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，由此得到盐桦种苗，成活率可达85％。
实施例3
1.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取生长旺盛优良的盐桦(Betulahalophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，采用体积分数75％酒精浸润的棉花擦拭后，在体积分数75％酒精中浸泡30秒后，用质量分数0.1％升汞溶液消毒6分钟，无菌水冲洗6次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗6次，用质量分数0.1％升汞溶液消毒3分钟，无菌水冲洗6次，然后将消毒的外植体接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度28℃，光照度2000lx，光照12小时/天。培养30天时有不定芽形成，不定芽发生率80％，消毒成功率80％。不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)1.0毫克、萘乙酸(NAA)0.3毫克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为B5基本培养基，pH 6.0。
2.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度28℃，光照度2000lx，光照12小时/天。30天为1个继代增殖周期。连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度28℃，光照度2000lx，光照12小时/天，1个月内增殖倍数为32倍。不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤(6-BA)1.0毫克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 6.0。
3.壮苗培养：由于上述培养基上产生的芽较细弱，需要进行壮苗培养。将高约3厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度28℃，光照度2500lx，光照12小时/天。形成的试管苗较粗，能应用于生根培养。壮苗培养基每升含有：IBA 1.5毫克、多效唑PP333 1.0毫克、蔗糖45克、琼脂6克，其余为MS培养基，pH 6.0。
4.生根培养：当芽高约4厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度28℃，光照度2500lx，光照12小时/天，得到生根试管苗。能正常生根，培养30天时生根率可达100％。生根培养基每升含有：萘乙酸(NAA)0.5毫克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 6.0。
5.试管苗移栽：当生根试管苗长至6厘米高时，在自然光照下炼苗10天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土、珍珠岩和蛭石体积比为4:3:1的混合基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，由此得到盐桦种苗，成活率可达90％。

Claims (5)

1.一种盐桦组织培养高效繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.外植体的消毒和不定芽诱导：在生长季节选取盐桦(Betula halophile)成年树的当年生的幼嫩茎节为外植体，经消毒处理后，接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽的诱导，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，培养形成不定芽；所述的不定芽诱导培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.1-0.3毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量，其余为B5基本培养基，pH 5.8-6.0；
b.不定芽继代增殖：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天；所述的不定芽继代增殖培养基每升含有：6-苄基嘌呤0.5-1.0毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；
c.壮苗培养：将高2～3厘米芽接种到壮苗培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天；所述的壮苗培养基每升含有：IBA 0.5-1.5毫克、多效唑0.5-1.0毫克、蔗糖30-45克、琼脂适量，其余为MS培养基，pH 5.8-6.0；
d.生根培养：当芽高3～4厘米高时，切下接种到生根培养基上培养，培养温度24-28℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天，得到生根试管苗；所述的生根培养基每升含有：萘乙酸0.3-0.5毫克、蔗糖20-30克、琼脂适量，其余为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
e.试管苗移栽：当生根试管苗长至4～6厘米高时，在自然光照下炼苗7-10天，然后洗掉根部培养基，栽入栽培基质中培养，由此得到盐桦种苗。
2.根据权利要求1所述的盐桦组织培养高效繁殖方法，其特征在于，所述的步骤b.不定芽继代增殖具体为：将诱导出的不定芽切割成单芽后接种到不定芽继代增殖培养基上进行不定芽的增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，连续培养2次后，将每个芽切成带有两个茎节的茎段接种到不定芽继代增殖培养基上进行增殖，培养温度24-28℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天。
3.根据权利要求1所述的盐桦组织培养高效繁殖方法，其特征在于，所述的消毒处理具体为先在体积分数75％酒精中浸泡10-30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液连续消毒若干次，每次消毒后用无菌水冲洗4-6次。
4.根据权利要求3所述的盐桦组织培养高效繁殖方法，其特征在于，所述的用质量分数0.1％升汞溶液连续消毒若干次具体为：用质量分数0.1％升汞溶液连续消毒3次，第一次消毒时间为4-6分钟，第二次消毒时间为3-5分钟，第三次消毒时间为1-3分钟。
5.根据权利要求1所述的盐桦组织培养高效繁殖方法，其特征在于，所述的栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述的泥炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为(2-4):(1-3):1。
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