CN112229918A - Uplc-ms/ms法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用 - Google Patents
Uplc-ms/ms法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了UPLC‑MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用。本发明有益效果在于，该方法选择性强，灵敏度高，通过大鼠和小鼠两种动物模型中***特征代谢产物含量器官分布的相互验证，可为生物样品中***及***主要代谢物的含量测定和组织分布情况提供数据参考，为评估毒品使用及药物滥用提供了分析手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用。
背景技术
在法医毒物分析中，检测***的常规检材往往都是以尿液、血液为主，然而，在不同动物模型中研究不同器官是否可以作为***检毒的常规检材的研究甚少。***，俗称白粉，其在体内极易被吸收和代谢，在血中转化为O6-单乙酰***的半衰期为3～9min，。然而，由于***在体内极易被代谢，导致生物检材中往往无法直接检测***的原型药物，所以只能通过检测并研究它的代谢物来判断是否吸食过***。O6-单乙酰***在血中转化为***的半衰期也仅约为45min，很快进一步去乙酰化为***，进而生成***葡萄糖醛酸苷。而在肝和其它组织中，O6-单乙酰***以较慢的速度转化为***，约在几个小时内完全转化。由于O6-单乙酰***仅来源于***的代谢，所以它常常被作为检测是否滥用***的有力证据。据文献查阅，均是用UPLC-MS/MS对单一大鼠或者小鼠体内***及***主要代谢物O6-单乙酰***、***、去甲***的研究报道，但并无同时用大鼠和小鼠两者测定体内***及***代谢物分布情况的报道研究。本文以SD大鼠和C57BL/6J小鼠为实验对象，通过建立成瘾动物模型并取用心、肝、肺、脑、肾和血液检材，利用超高效液相色谱串联质谱检测并比较***特征代谢产物O6-单乙酰***、***、去甲***的含量，为法医毒物分析在***实际案件中选择最适宜的分析方法和检材提供参考依据。
发明内容
鉴于现有技术的缺陷，本发明旨在于提供一种UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布及其应用。通过本发明对体内分布情况的研究，证实了血液，脑组织，肝组织可以作为***检毒的最佳检材，同时证明肺、肾也可作为***检毒检材。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，所述测定的方法包括：
S1分别精确称取***、***、去甲***、O6-单乙酰***标准品以甲醇溶解、定容，配制成质量浓度为1g/L的储备液，于4℃冰箱中保存；再分别吸取上述标准溶液1mL，准确定容至10mL，配制成质量浓度为100mg/L混合标准储备液；使用时用甲醇配制成质量浓度范围为2-200μg/L的混合标准工作液；
S2获得实验用的成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠 (150-200g)和C57BL/6J小鼠；
S2将实验动物随机分为两组；将盐酸***溶解在0.9％NaCl 溶液中，给实验动物每天连续腹腔注射2次，每天逐量增加，连续 21天；
S3随着***剂量的增加，实验动物产生了生理依赖，包括跳跃、牙齿抖动、扭动、湿狗样抖、上睑下垂、齿颤、异常姿势症状；
S4分别对步骤S3的实验动物采集心脏、脑、肾脏、肺、肝、血液等组织样本。样本采集后置于-80℃超低温冷冻储存箱保存被检；
S5取等体重的样本，充分研磨，加入500μl乙腈，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤后待测；
S6通过超高效液相色谱-串联质谱对样本进行检测；
S7获得检测结果，得出***代谢物的体内分布。
需要说明的是，在步骤S2中***的给药剂量范围：从第1天的20mg/kg开始，每次增加20mg/kg，最后稳定到280mg/kg 给药至第21天。
优选的，而去甲***在大鼠体内分布于肺、肝、肾，在小鼠体内分布较少，分布的情况：肺＞肝＞肾。
优选的，***在大鼠体内分布：肺组织＞肾组织＞肝组织＞心组织＞脑组织＞心血，在小鼠体内分布情况：肺组织>肾组织>心组织> 肝组织>脑组织；
优选的，***代谢物O6-单乙酰***在大鼠体内分布情况：心组织＞脑组织＞肺组织＞肾组织＞血液＞肝组织，在小鼠体内主要分布于血液、脑组织。
基于上述技术方案，利用本发明的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布应用于滥用***者进行检测排查。
本发明有益效果在于：该方法选择性强，灵敏度高，通过大鼠和小鼠两种动物模型中***特征代谢产物含量器官分布的相互验证，可为生物样品中***及***主要代谢物的含量测定和组织分布情况提供数据参考，为评估毒品使用及药物滥用提供了分析手段。
附图说明
图1为本发明的大鼠体内各个器官总离子流图；
图2为本发明小鼠体内各个器官总离子流图；
图3为本发明***及其代谢物的质谱图；
图4为本发明***代谢物在大鼠体内的含量柱状图；
图5为本发明***代谢物在小鼠体内的含量柱状图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
本发明为一种UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，所述测定的方法包括：
S1分别精确称取***、***、去甲***、O6-单乙酰***标准品以甲醇溶解、定容，配制成质量浓度为1g/L的储备液，于4℃冰箱中保存；再分别吸取上述标准溶液1mL，准确定容至10mL，配制成质量浓度为100mg/L混合标准储备液；使用时用甲醇配制成质量浓度依次为2-200μg/L的混合标准工作液；
S2获得实验用的成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠 (150-200g)和C57BL/6J小鼠；
S2将实验动物随机分为两组；将盐酸***溶解在0.9％NaCl 溶液中，给实验动物每天连续腹腔注射2次，每天逐量增加，连续 21天；
S3随着***剂量的增加，实验动物产生了生理依赖，包括跳跃、牙齿抖动、扭动、湿狗样抖、上睑下垂、齿颤、异常姿势症状；
S4分别对步骤S3的实验动物采集心脏、脑、肾脏、肺、肝、血液等组织样本。样本采集后置于-80℃超低温冷冻储存箱保存被检；
S5取等体重的样本，充分研磨，加入500μl乙腈，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤后待测；
S6通过超高效液相色谱-串联质谱对样本进行检测；
S7获得检测结果，得出***代谢物的体内分布。
需要说明的是，在步骤S2***的给药剂量范围：从第1天的 20mg/kg开始，每次增加20mg/kg，最后稳定到280mg/kg给药至第21天。
优选的，***在大鼠体内分布：肺组织＞肾组织＞肝组织>心组织>脑组织>心血，在小鼠体内分布情况：肺组织＞肾组织＞心组织＞肝组织＞脑组织；
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基于上述技术方案，利用本发明的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布应用于滥用***者进行检测排查
实施例1
标准样品溶液的配置
标准品***(c＝1g/ml)、***(c＝1g/ml)、去甲*** (c＝1g/ml)、O6-单乙酰***(c＝1g/ml)标准品均购置于美国 Cerilliant公司。
标准品溶液的制备分别精确称取***、***、去甲***、O6- 单乙酰***标准品以甲醇溶解、定容，配制成质量浓度为1g/L的储备液，于4℃冰箱中保存。分别吸取上述标准溶液1mL，准确定容至10mL，配制成质量浓度为100mg/L混合标准储备液；使用时用甲醇配制成质量浓度依次为2-200μg/L的混合标准工作液。
样品制备与采集
实验动物从中山大学动物中心获得成年雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠(150-200g)和C57BL/6J小鼠。在12h 光/12h黑暗循环中，将动物置于温度控制环境中。从早上7：00至晚上7：00的灯光，自由采食食物和水。所有程序均按照道德操守委员会规定的准则进行利用中山大学的实验动物，尽一切努力减少动物的痛苦，减少实验动物的数量。
将实验动物随机分为两组(***成瘾大鼠6只和***成瘾小鼠6只)。采用制作的***依赖大鼠模型在注射前立即将盐酸***溶解在0.9％NaCl溶液中。动物每天连续腹腔注射2次，连续21 天，***的给药剂量范围：从第1天的20mg/kg开始，每次增加20mg/kg，最后稳定到280mg/kg给药至第21天。随着***剂量的增加，大鼠和小鼠产生了生理依赖，包括跳跃、牙齿抖动、扭动、湿狗样抖、上睑下垂、齿颤、异常姿势等症状。
样本采集给药后分别采集心脏、脑、肾脏、肺、肝、血液等组织样本。样本采集后置于-80℃超低温冷冻储存箱保存被检。样品采集期间实验动物仍按上述条件饲养。
样本前处理
取等体重的样本，充分研磨，加入500μl乙腈，涡旋混匀，振荡 10min，4000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤后待测。
检测与制作标准曲线
将标准品配制项下所得标准供试液依次进样，***、O6-单乙酰***、***、去甲***保留时间分别为：3.89min、3.18min、 2.46min、2.37min，将所得峰面积(Y)与浓度(X)进行线性回归，线性范围在2～200μg/ml内相关系数R均大于0.99。
色谱图
在反相色谱条件下，***及***代谢物的保留因子由小到大的顺序是去甲***、***、O6-单乙酰***、***。在使用洗脱能力较强的乙腈，去甲***、***、O6-单乙酰***、***分离良好，分离度＞1.5，如大鼠组和小鼠组的各种器官总离子。
***及***代谢物在体内组织分布的含量比较柱状图和相应含量三线表
用Origin软件作柱形图主要用于直观显示一段时间内的多项数据变化或者显示给项之间的综合比较情况。对于下面数据进行Origin 软件做柱状图，如图4和图5。相应含量数据作三线表的形式更直观、更简单，如表1和表2。
表1***代谢物在大鼠体内的各组织含量比较
表2***代谢物在小鼠组织内的含量数据比较
从实验数据可以得出，***在小鼠体内几乎均检测不出；O6- 单乙酰***在小鼠体内的分布依次为：脑组织＞血液＞肺组织，而肝组织、心组织和肾组织未能检测出；***在小鼠体内的分布依次为：肺组织＞肾组织＞心组织＞肝组织＞血液＞脑组织；去甲***在小鼠体内的分布依次为：肺组织>肾组织＞肝组织，而心脏、血液和脑组织均未检测出，如表2。
本文采用UPLC-MS法测定***及***主要代谢物O6-单乙酰***、***、去甲***在大鼠和小鼠体内的分布情况，实验结果发现，***在大鼠和小鼠体内均未能检测，说明***在体内均已转化为其他次级代谢物；O6-单乙酰***在大鼠体内主要分布情况：心组织＞脑组织＞肺组织＞肾组织＞血液＞肝组织，在小鼠体内主要分布于血液、脑组织；***在大鼠体内主要分布：肺组织＞肾组织＞肝组织＞心组织＞脑组织＞心血，而在小鼠体内分布情况：肺组织＞肾组织＞心组织＞肝组织＞脑组织；而去甲***在大鼠体内主要分布于肺、肝、肾，在小鼠体内分布较少，主要分布的情况：肺＞肝＞肾；从大鼠和小鼠体内***代谢物含量的分布情况，可看出***和O6-单乙酰***的含量是偏高的，证实了***在体内的代谢产物主要是***和O6-单乙酰***；而***在体内的含量和分布是最高且最广的，是因为***是***在动物体内存在较稳定且检测时限相对较长的代谢物，这也可以作为检测是否吸食***的指标之一。数据显示，不论大鼠或者小鼠体内O6-单乙酰***、***、去甲***在肺的含量较高有可能是腹腔给药的时候把药注射到肺里；大鼠和小鼠体内***主要代谢产物的含量差异较大，是因为大鼠和小鼠的体重差异、给药的剂量就不同而导致二者之间出现含量的差异较大；上述结果证实了血液，脑组织，肝组织作为***检毒的最佳检材，同时证明肺、肾也可作为***检毒的检材。
基于上述，本发明的技术方案可为法医毒物分析的检毒和戒毒提供最佳检材，有利于对滥用***者进行检测排查。通过大鼠和小鼠两种动物模型中***特征代谢产物含量器官分布的相互验证，可为生物样品中***及***主要代谢物的含量测定和组织分布情况提供数据参考，为评估毒品使用及药物滥用提供了分析手段。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (5)
1.UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，其特征在于，所述测定的方法包括：
S1分别精确称取***、***、去甲***、O6-单乙酰***标准品以甲醇溶解、定容，配制成质量浓度为1g/L的储备液，于4℃冰箱中保存；再分别吸取上述标准溶液1mL，准确定容至10mL，配制成质量浓度为100mg/L混合标准储备液；使用时用甲醇配制成质量浓度范围为2-200μg/L的混合标准工作液；
S2获得实验用的成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(150-200g)和C57BL/6J小鼠；
S2将实验动物随机分为两组；将盐酸***溶解在0.9％NaCl溶液中，给实验动物每天连续腹腔注射2次，每天逐量增加，连续21天；
S3随着***剂量的增加，实验动物产生了生理依赖，包括跳跃、牙齿抖动、扭动、湿狗样抖、上睑下垂、齿颤、异常姿势症状；
S4分别对步骤S3的实验动物采集心脏、脑、肾脏、肺、肝、血液等组织样本。样本采集后置于-80℃超低温冷冻储存箱保存被检；
S5取等体重的样本，充分研磨，加入500μl乙腈，涡旋混匀，振荡10min，4000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤后待测；
S6通过超高效液相色谱-串联质谱对样本进行检测；
S7获得检测结果，得出***代谢物的体内分布。
2.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，其特征在于，***代谢物O6- 单乙酰***在大鼠体内分布情况：心组织＞脑组织＞肺组织＞肾组织＞血液＞肝组织，在小鼠体内主要分布于血液、脑组织。
3.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，其特征在于，***在大鼠体内分布：肺组织＞肾组织＞肝组织＞心组织＞脑组织＞心血，在小鼠体内分布情况：肺组织＞肾组织＞心组织＞肝组织＞脑组织。
4.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布，其特征在于，而去甲***在大鼠体内分布于肺、肝、肾，在小鼠体内分布较少，分布的情况：肺＞肝＞肾。
5.一种利用权利要求1所述的UPLC-MS/MS法测定***成瘾大鼠和小鼠体内代谢物在体内的分布应用于滥用***者进行检测排查。
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